材料和试剂
1.一次性培养管16×100 mm（ Fisherbrand ，目录号：14-961-29）
2.Difco TM Luria-Bertani 肉汤（BD Biosciences，目录号：244620）
3.聚苯乙烯一次性培养皿150 mm×15 mm（VMR International，目录号：25384-326）
4.棉尖涂抹器，6英寸（Puritan，目录号：1495992B）
5.显微镜载玻片（ Fisherbrand ，目录号：12-550-343）
6.2 mL Safe Lock 管（Eppendorf，目录号：054027）
7.5 mm不锈钢珠（Qiagen ，目录号： 69989）
8.30 mL Oak Ridge 圆底管（Thermo Scientific Nalgene，目录号： 3115-0030）
9.一次性5ml注射器（BD Biosciences，目录号： 309647）
10.Precision Glide Needle（BD Biosciences，目录号：B305196）
11.0.22μm硝酸纤维素膜（ FroggaBio ，目录号： TM300 ）
12.滤纸（Bio-Rad，目录号：1703965）
13.1 层Kimwipes 11 × 21 cm（ KimTech Science Brand，Kimberly-Clark，代码：34155）
14.Bacto TM胰蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211705）
15.Difco TM琼脂，细菌学（BD Biosciences，目录号：214530）
16.Tris-HCl pH 8（Invitrogen，目录号：15-568-025）
17.二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，目录号： D-1435，CAS 号：67-68-5）
18.Trizma碱基（Sigma-Aldrich，CAS 编号：77-86-1）
19.盐酸（Bio Basic Canada Inc. CAS 编号：7647-01-0）
20.RNase A，无蛋白酶，高度纯化，牛胰腺（Sigma-Aldrich，CAS 编号：9001-99-4）
21.来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶 I（Sigma-Aldrich，CAS 号：9003-98-9）
22.MgCl 2 · 6H 2 O（Bio Basic Canada Inc. CAS 编号：7791-18-6）
23.来自鸡蛋清的溶菌酶（Sigma-Aldrich， CAS 号：12650-88-3)
24.十二烷基硫酸钠（Bio Basic Canada Inc. 目录号：151-21-3）
25.40％丙烯酰胺/双溶液29：1（Fisher Bioreagents，目录号：BP1408-1）
26.过硫酸铵（Sigma-Aldrich，CAS 编号：7727-54-0）
27.TEMED（Thermo Scientific，目录号：17919）
28.无菌蒸馏水
29.β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，批号：SHBJ8714；目录号 M6250）
30.乙醇 95% Vol（Greenfield Global 的商业酒精，货号：P016EA95）
31.甘氨酸（Bio Basic Canada Inc. 目录号：56-40-6）
32.蓝精灵预染蛋白梯（ FroggaBio ，目录号：PM008-0500）
33.甘油（Bio Basic，GB0232，CAS 编号：56-81-5）
34.溴酚蓝（Sigma-Aldrich，CAS 号：34725-61-6）
35.NaCl（Bio Basic，DB0483，CAS 编号：7647-14-5）
36.吐温 20（Sigma-Aldrich，CAS 编号：9005-64-5）
37.甲醇（Fisher Bioreagents，目录号：BP1105-4）
38.IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG（Mandel Scientific，ERP 编号：LIC-926-68071）
39.Nitro-BT (NBT)（Fisher BioReagents TM ，CAS 编号：298-83-9）
40.5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)（Fisher BioReagents TM ，CAS 编号：298-83-9）
41.甲酸 98-100%（Millipore Sigma，CAS 编号：64-18-6）
42.1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇；六氟异丙醇 (HFIP)（Sigma-Aldrich，CAS 编号：920-6611）
43.英杰公司 Novex TM WedgeWell TM 4 至 20%，Tris-甘氨酸，1.0 mm，迷你蛋白凝胶，10 孔（ Thermo Fisher Scientific，目录号：XP04200PK2)
44.英杰公司 iBlot TM 2 Transfer Stacks，硝酸纤维素，迷你（ Thermo Fisher Scientific，目录号：IB23002）
45.受感染的组织样本
46.N-鲸蜡基- N,N ,N,-三甲基溴化铵 (CTAB)（Sigma-Aldrich，CAS 号：57-09-0）
47.苯酚/氯仿/异戊醇（pH 7.7 - 8.3）（49.5：49.5：1）（Sigma-Aldrich，目录号：77618）
48.氯仿（Sigma-Aldrich，CAS 编号：67-66-3）
49.MSB肉汤（见食谱）
50.YESCA 肉汤（见食谱）
51.琼脂（见食谱）
52.2 × SDS-PAGE 样品缓冲液 (100 mL)（参见配方）
53.10 × SDS-PAGE 运行缓冲液 (1,000 mL)（参见配方）
54.10 × Towbin缓冲液或传输缓冲液 (1,000 mL)（参见配方）
55.10 × TBS (1,000 mL)（见配方）
56.1 × TBST（见配方）
57.12% 分离凝胶（2 个凝胶）（参见配方）
58.5% 浓缩凝胶（2 块凝胶）（参见食谱）
59.AP 缓冲液（碱性磷酸酶）（500 mL）（参见食谱）
60.NBT/BCIP 开发解决方案（见配方）

设备

1.水浴
2.高压灭菌器真空蒸汽灭菌器（GETINGE，型号：533LS）
3.生物安全柜（Therma Electron Corporation，型号：1284）
4.水套式 CO 2培养箱（Therma Electron Corporation，型号：3110）
5.声波器（布兰森，数字声波 450）
6.组织均质机（ Retsch ，高速搅拌机MM400）
7.超高速离心机（Thermo Scientific，SORVALL EVOLUTION RC）
8.SDS-PAGE凝胶大仪（Bio-Rad，PROTEAN II xi Cell，型号：1651814）
9.Invitrogen TM迷你凝胶槽（ Thermo Fisher Scientific，型号：A25977）
10.冻干机（FTS System TM , Duro-Dry TM MP，型号：FD2085C0000)
11.冰柜（松下、三洋、型号：MDF-U76VC）
12.天平（梅特勒-托利多，型号：B2002-S）
13.Trans-Blot SD 半干转移细胞（Bio-Rad Laboratories）
14.英杰公司 iBlot TM 2 凝胶转移装置（Thermo Fisher Scientific，型号：IB21001）
15.Odyssey CLx成像系统和 Image Studio 4.0 软件包（Li-Cor Biosciences，型号：9140）
16.DeNovix DS-11 FX 微量分光光度计/荧光计

程序

用于 curli 纯化的突变菌株是S 。 enterica serovar Typhimurium 14028-3b Δ bcsA 。这是一种野生型鼠伤寒沙门氏菌 14028 菌株，我们通过引入来自肠炎沙门氏菌血清型肠炎 27655-3b的csgD启动子突变来设计产生更多卷曲（White 和 Surette，2006）。 csgD编码肠杆菌和大肠杆菌中的主要生物膜调节剂（Gerstel等，2003； Brombacher 等。 , 2006)。另一种修改是引入bcsA的单基因敲除(White et al. , 2006)，它编码纤维素合酶，负责在S. enterica和E. coli生物膜细胞的细胞表面制造纤维素聚合物 ( Zogaj 等。 , 2001;索拉诺等。 , 2002)。纤维素的存在导致其他物质在纯化过程中被困在细胞外基质中。此外，由于卷曲和纤维素难以分离（White等人，2003），这些碳水化合物可以占最终纯化产品的很大一部分。使用纤维素阴性Δ bcsA菌株可避免纯化这些不必要的污染物。
相同的程序可用于从产生纤维素的肠杆菌或大肠杆菌菌株中纯化卷曲；重要的是要注意纤维素将代表“成熟卷曲”最终重量的一部分。 curli 和纤维素之间的紧密联系 (White et al ., 2003) 将使得它们无法分离。

A.成熟卷曲提取纯化

细菌菌株和培养条件
1.生长菌株S 。 Typhimurium 14028-3b Δ bcsA在 5 mL Luria 肉汤（1% 盐）中在 37°C 下以 200 rpm 摇动过夜。
2.将无菌拭子浸入这种过夜培养物中，然后均匀地铺在 120 个大（150 毫米× 15 毫米）T 琼脂板上，以确保均匀的细菌草坪覆盖整个平板。
3.将接种板在 28°C 下孵育 48 小时。

成熟的卷曲提取
1.使用显微镜载玻片（视频 1）或无菌细胞刮刀刮去琼脂表面，收集细菌细胞和细胞外物质。

视频 1. 刮板

2.将每组 10 个板中的细胞材料悬浮在 20 mL 的 10 mM Tris-HCl（pH 8）中，并辅以 RNase A 和 DNase I（最终浓度为 0.1 mg/mL）。
3.涡旋悬浮细胞材料，直到没有可见的团块。
4.将 1 mL 的细胞浆液转移到含有 5 mm 不锈钢珠 (Qiagen) 的 2 mL Safe-Lock 管中（每 10 个培养板约 20 个管）。
5.将管子放入搅拌机中，在室温下以 30 Hz 均质化 5 分钟，以分解细胞外基质。
6.将匀浆的细胞材料转移并合并到 30 mL Oak Ridge 离心管中。
7.× 30 s 脉冲以 30% 幅度通过超声裂解细菌细胞，脉冲之间在冰上冷却 2 分钟（图 1 ）。

图 1. 用于细菌细胞裂解的超声设备的参考图像。
细胞悬浮在 30 mL Oak Ridge 离心管中，该离心管嵌入在 500 mL 烧杯中的冰中。超声仪探头放置在离心管内液体细胞浆液表面下方约 5 mm 处。

8.超声处理后，加入 2 M MgCl 2至终浓度为 1 mM，在 37°C 下孵育混合物 20 分钟，不要摇晃。
9.孵育后，加入溶菌酶至终浓度为 1 mg/mL 将混合物在 37°C 下孵育 40 分钟，不要摇晃。
10.将 SDS 和 0.1 mg/mL DNase I 添加至终浓度为 1%，并在 37°C 下将此混合物孵育过夜，不要摇晃。
11.第二天，将混合物在 30 mL Oak Ridge 离心管中以 25,000 × g和 4°C 离心 25 分钟。
12.对于每个试管，去除上清液并将颗粒重新悬浮在 10 mL 的 10 mM Tris-HCl (pH 8) 中，煮沸 10 分钟，然后以 25,000 × g的速度将混合物离心25 分钟。重复此步骤两次。
13.用 10 mL 的 10 mM Tris-HCl (pH 8) 重悬沉淀，并添加 RNase A（0.1 mg/mL 最终浓度）、DNase I（0.1 mg/mL 最终浓度）和溶菌酶（1 mg/mL 最终浓度.) 并将混合物在 37°C 下孵育过夜。
注意：如果混合物高度粘稠（即看起来像一团粘液），此步骤可以重复多次，而不会降低最终纯化材料的数量或质量。
14.在混合物达到较低粘度（即变成水样）后，将混合物以 12,100 × g离心15 分钟。
15.用 10 mL 的 10 mM Tris-HCl (pH 8) 在 12,100 × g下离心15 分钟，清洗颗粒两次。降低粘度对于此步骤有效工作是必要的，并且可能因批次而略有不同。
16.将沉淀重悬于 3 ml 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液中并煮沸 15 分钟（粗蛋白样品）。

SDS-PAGE凝胶中的成熟卷曲纯化。
1.准备一个 4 mm 厚的 SDS-PAGE 凝胶，带有 5% 的堆叠凝胶和 12% 的分离凝胶（图 2A）。
2.将步骤 16（见上文）中的 3 mL 粗蛋白样品装入制备 SDS-PAGE 凝胶（图 2B）的孔中，并在 100V 下连续运行，直到样品中的所有染料都穿过底部（图 2C）。用冰在电泳装置的底部周围包装，以防止凝胶过热（图 2B）。

用于从细菌细胞中纯化 curli 的SDS-PAGE 凝胶应用程序。
(A) 凝胶浇注系统的参考图像。 (B) 在 SDS-PAGE 之前将三毫升粗蛋白样品装入井中。注意：SDS-PAGE 凝胶装置用冰包好或在 4 ° C的冷室中进行实验，以防止凝胶过热。 (C ) 进行电泳，直到上样染料到达底部。

3.使用带有 18 号针头的 5 mL 注射器收集保留在孔顶部的不溶性物质（图 3；箭头）。纯化的 curli 纤维不会进入 SDS-PAGE 凝胶，除非它们用 ˃90% FA (Collinson et al. 1991) 或 100% HFIP (Zhou et al. , 2013) 解聚。

图 3. 电泳后从凝胶顶部收集的 curli 聚集体。
红色箭头表示收集前井顶部的纯化卷曲原纤维。使用注射器和 18 号针头，研究人员可以从凝胶顶部收集白色物质。

4.用 10 mL 的无菌蒸馏水和沉淀物洗涤回收的不溶性物质，在16,000 × g和 4 °C下离心10 分钟。重复此洗涤步骤三遍。
5.用 5 ml 95% 乙醇溶解沉淀，并在 16,000 × g和 4°C 下离心 10 分钟。重复此步骤两次。
6.用 10 mL 无菌蒸馏水重悬沉淀，转移到合适的容器中（例如30 mL Oakridge 离心管；图 4A ），并在 -80°C 下冷冻混合物。
7.kimwipes包裹冷冻管，用橡皮筋固定，冻干 24 小时。白色的絮状材料应出现在每个管的底部（图 4B）。
注意：管可以用 1 层kimwipes或铝箔包裹。如果管子用铝箔包裹，则要打几个孔，以便对冷冻材料进行适当的冻干。这些孔允许冷冻材料从固态变为气态。

图 4. 纯化 curli 聚集体的冻干。
(A) 纯化的 curli 在水中的溶液在 -80°C 的 30 mL Oakridge 离心管中冷冻，用无绒组织包裹，并冻干 24 小时。 (B) 冻干后每个管底部存在的白色絮状物质 (红色箭头) 代表卷曲原纤维。

8.将冻干材料溶解在 2 mL 的 0.2 M 甘氨酸（pH 1.5）中，并将该混合物煮沸 10 分钟以溶解可能存在的任何 I 型菌毛（Müller等人， 1991)。
9.以 27,500 × g离心样品25 分钟。
10.用无菌蒸馏水洗涤颗粒五次，以 25,000 × g离心25 分钟。
11.用 5 mL 蒸馏水重新悬浮颗粒，并将混合物转移到预先称重的玻璃小瓶中。
12.将混合物冷冻在 -80 °C并冻干 24 小时。
13.冻干后，称量装有样品的玻璃小瓶以获得粗略的样品重量。最终纯化的材料（图 5 ）应为白色至灰白色，并且比步骤 6 中描述的材料“更粉”。

图 5. 纯化卷曲的定量和长期储存。
在最终冻干步骤后收集的所有材料都被转移到预先称重的无菌玻璃瓶中，并计算粗略重量。这种纯化的材料可以储存在-20 °C 。

14.将冻干材料（Curli 标准品）储存在 -20°C。储备溶液的最佳制备方法是将所需数量的纯化卷曲称重到玻璃小瓶中，然后重悬于蒸馏水中以达到所需浓度，例如 1 mg/ mL。准备好储备溶液后，将混合物分装到 Eppendorf 管中。由于纯化的卷曲纤维不溶于水，因此请确保将原液混合均匀并使用大口径移液器转移等分试样。
15.要制备解聚卷曲，将 ˃90% FA 或 100% HFIP 添加到成熟卷曲（步骤 13 中纯化的卷曲）。
注意： HFIP 和 FA 是刺激性和腐蚀性化学品。始终在化学通风橱下使用它们，并在处理时佩戴适当的防护设备。将它们存放在通风良好、凉爽的地方。
16.对于 HFIP 治疗，称量 1 mg curli，将其溶解在 1 mL HFIP 中，然后将它们等分到 0.5 mL Eppendorf 管中。对于 FA 处理，在无菌水中制备 1 mg/mL 的 curli，将 10 μL 的库存等分到 0.5 mL Eppendorf 管中，并添加 92 μL 的 FA。
17.立即将混合物在 -80°C 下冷冻 1 小时，在盖子上打一个洞（即，使用无菌针头），然后冻干 24 小时。
注意：含有酸的样品可能会损坏某些冻干机。
18.用 30 µl 1 × SDS-PAGE 样品缓冲液溶解成熟（来自步骤 13）和 FA/HFIP 处理或解聚的卷曲（来自步骤 15 – 16），并将它们加载到每个 SDS-PAGE 凝胶泳道中。
19.通过免疫印迹分析检查成熟和解聚卷曲的纯度（图 6A 和 6C ）。

图 6. 通过免疫印迹分析检测到的不同形式的 curli 的比较。
(A 和 B) 样品通过 SDS-PAGE 进行解析，SDS-PAGE 由 5% 丙烯酰胺浓缩胶和 12% 丙烯酰胺分离胶组成。使用iBlot系统将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。对于所有免疫印迹，使用兔抗卷曲多克隆血清检测CsgA的单体 (M)、二聚体 (D) 和更高分子量的寡聚体，然后使用IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG 并使用 Odyssey CLx成像系统 (Li -Cor 生物科学）。 (A) 在 SDS-PAGE 之前，用 90% FA 对 20 μg 和 10 μg 的纯化卷曲进行解聚。 (B)如前所述 (Miller et al. , 2020) ，在 SDS-PAGE 之前，用 90% FA 连续处理 3 次来自感染鼠伤寒沙门氏菌的小鼠的 50 mg 均质组织样本。 (C) 将 10 µg 纯化的全长 curli（成熟）、curli 中间体（ Interm ）和 FA 或 HFIP 处理的 curli 上样并直接在预制的Novex TM 4 – 12% Tris-甘氨酸迷你凝胶上分离。白星表示 25 kDa蛋白质标准。

B.Curli中间体的纯化

curli 中间体的纯化依赖于产生 ∆ msbB突变菌株（Nicastro等人，2019）。
对人类淀粉样蛋白的研究证明，在淀粉样蛋白聚合的多步过程中会形成不同类型的中间结构。其中，可溶性人淀粉样蛋白单体首先形成寡聚体，然后聚合成原纤维结构，然后将它们交叉组装成稳定、成熟的原纤维。尽管肠杆菌科中卷曲纤维组装的过程已经得到充分研究，但直到最近 Nicastro等人才发现或研究了卷曲的中间寡聚结构。（2019）。作者使用∆ msbB菌株了解 curli 的原纤维化动力学，它们的中间体，以及成熟的 curli 原纤维聚集体在细菌细胞外基质组装中的作用。沙门氏菌中的∆ msbB基因编码一种酶，该酶催化完成脂质 A 生物合成的两个二级酰化反应之一。它合成了一个全长的含 O 抗原的 LPS 分子，该分子仅缺乏预期的二级酰基链，并且在体外和体内条件下都不太能够诱导细胞因子和可诱导的一氧化氮合酶反应。他们发现细菌淀粉样蛋白的中间原纤维结构（ Curli中间体）更具细胞毒性，细菌 DNA 的添加加速它们形成成熟的纤维结构，限制了细胞毒性作用。有关卷曲纤维化动力学及其稳定性的更详细信息可以在其他地方找到（Nicastro等人，2019 年）。我们使用 lambda red 重组酶敲除程序（ Datsenko和Wanner ，2000）来生成S。鼠伤寒 14028s ∆ msbB 。我们第一次尝试产生ΔmsbB菌株是不成功的，因为我们很难在 LB 琼脂上恢复抗生素抗性转化体。据报道，沙门氏菌msbB突变菌株在 LB 琼脂上生长不良，通过改用 MSB 琼脂（不含 NaCl 并添加 Mg 2+和 Ca 2+的 LB），生长可以恢复到接近野生型水平（Murray等人，2001）。一旦将程序更改为在 MSB 琼脂而不是 LB 琼脂上回收 CM R （耐氯霉素）转化体，λ red 程序就有效地工作了。
1.生长菌株S 。 Typhimurium 14028s Δ msbB在 5 mL 含 34 µg/mL 氯霉素的 MSB 肉汤中，在 37°C 下以 200 rpm 振摇过夜。
2.将 5 mL 过夜培养物添加到 500 mL 的 YESCA 肉汤中，并在 1-L 烧瓶中添加 4% DMSO，并在 26°C 下孵育 72 小时，并以 200 rpm 的速度摇动。
3.孵育后，以 10,000 × g离心10 分钟收集细菌沉淀。
4.将颗粒重悬于 30 mL 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 中，并用 RNase A（0.1 mg/mL 最终浓度）、DNase I（0.1 mg/mL 最终浓度）和 MgCl 2 （1 mM 最终浓度）在 37°C 下保持 30 分钟。
5.× 30 s 的脉冲以 30% 的幅度打开细菌，脉冲之间在冰上冷却 1 分钟。
6.向混合物中加入溶菌酶至终浓度为 1 mg/mL，并在 37°C 下孵育 40 分钟。
7.向混合物中添加 SDS 至终浓度为 1%，并在 37°C 下孵育 20 分钟，同时以 200 rpm 的速度摇动。
8.孵育后，离心沉淀 curli（10,000 × g ，4°C 10 分钟）。
9.将 curli 颗粒重新悬浮在 10 mL 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 中并煮沸 10 分钟。
10.2 （1 mM ）之前，在冰上冷却样品最终浓度）。将该混合物在 37°C 下孵育 2 小时。重复此步骤，直到达到所需的粘度（参见 A 部分的步骤 13 和 14）。
11.将混合物在 10,000 × g和 4°C 下离心 10 分钟。
12.用 10 mL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 洗涤颗粒 3 次，并重新悬浮在 3 mL 的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液中并煮沸 10 分钟。
13.将 3 mL 的粗蛋白样品（来自上一步）加载到 4 mm 厚的 SDS-PAGE 凝胶中，该凝胶具有 5% 的浓缩凝胶和 12% 的分离凝胶，并在 100 V 下连续运行，直到样品中的所有染料都通过底部。
14.电泳后，使用 5 mL 注射器和 18 号针头从凝胶顶部收集 curli 聚集体，重悬于 5 – 10 mL 无菌水中，离心沉淀（10,000 x g × g 10 分钟）并洗涤用无菌水两次。
15.x g离心10分钟，然后用乙醇再洗涤两次。
16.将卷曲重新悬浮在无菌水中，并将混合物转移到预先称重的玻璃小瓶中。
17.在 -80°C 下冷冻混合物并冻干 24 小时。
18.冻干后，称量装有样品的玻璃小瓶以获得粗略的样品重量，并将冻干材料储存在-20°C。 curli 中间体的纯度可以通过免疫印迹分析来检查（图 6C ）。

C.宿主组织/样本中的卷曲检测

小鼠组织分析程序改编自Miller等人。（2020 年）。相同的程序可用于分析其他动物物种的组织或其他类型的样本。
1.将组织样本（即肝脏、盲肠、结肠和小肠）放入锡纸包中，在液氮中快速冷冻，并在 -80°C 下储存。
2.通过储存在 -20°C 下预冷研钵和研杵。在液氮下将冷冻组织样品研磨成细粉。可以使用金属刮刀将粉末样品从研钵和研杵上刮到称重纸上，然后转移到 2 mL 螺旋盖冷冻小瓶中，并在 -80°C 下储存。
3.称取 50 mg 粉末组织样品，转移到 Eppendorf 管中，重悬于 500 μL的 1 × SDS-PAGE 样品缓冲液中，煮沸 10 分钟。此步骤将溶解大部分可溶性细胞蛋白。
4.在冰上冷却溶液，并以 25,000 × g离心5 分钟使细胞碎片沉淀。
5.500 重悬沉淀 μL无菌蒸馏水并以 25,000 × g离心5 分钟。重复此步骤两次。这会洗掉 SDS-PAGE 样品缓冲液的任何剩余残留物。
6.用 500 μL的 90% FA 重悬沉淀，并在 -80°C 下冷冻样品至少 1 小时。
7.将混合物冻干 16-24小时。重复步骤 6 和 7 三次。对于纯化的 curli 标准品，FA 处理只需进行一次。
注意：含有酸的样品可能会损坏某些冻干机。
8.FA 处理后，将冻干样品重新悬浮在 50 μL的 1 × SDS-PAGE 样品缓冲液中，并在 25,000 × g下将样品离心2 分钟。
注意：不要煮沸样品，因为它会导致 curli 单体聚集。
9.将 20 μL等分的上清液装入每个 SDS-PAGE 凝胶泳道。我们使用了自行制备的 5% 丙烯酰胺浓缩胶和 12% 丙烯酰胺分离胶或市售的 4 – 12% 丙烯酰胺梯度胶。加载至少一个带有商业预染蛋白梯的凝胶泳道。
10.在 110 V 下进行电泳。小心取出凝胶并将其放在硝酸纤维素膜上，并在 Trans-Blot SD 半干转移细胞中以 25V 进行 40 分钟的蛋白质转移。或者，可以使用自动化iBlot系统将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
11.使用任何标准免疫印迹程序检测组织样本中存在的 curli 蛋白。我们通常使用兔抗卷曲多克隆血清作为一抗，在 TBST 的 5% 脱脂牛奶中按 1:500 稀释，并在 4 °C下孵育过夜或在 37 °C下孵育1 小时。使用的二抗是 1:10,000 稀释的IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG（用于荧光应用）或山羊抗兔 IgG 碱性磷酸酶偶联物（在 TBST 中 5% 脱脂牛奶中以 1:2,000 稀释）。在室温下在黑暗中孵育 1 小时 30 分钟用于荧光检测，或在 37°C 下在倾斜的平台摇床上孵育 1 小时用于比色检测。
12.抗体结合通过 Odyssey CLX 成像系统和 Image Studio 4.0 软件包使用荧光进行可视化（图 6B ）。对于 curli 的比色检测，可溶性 BCIP/NBT 用作底物。碱性磷酸酶会产生稳定的蓝紫色产品，遇光不会褪色，无需特殊设备即可观察。

D.从卷曲中提取 DNA

Tükel实验室以前的工作表明，在成熟生物膜的发育过程中，细胞外 DNA (eDNA) 与卷曲原纤维结合，纯化的卷曲含有 eDNA (Gallo et al. , 2015)。由于 eDNA 的存在会影响免疫识别以及 TLR2/9 刺激（ Tursi和Tükel ，2018 年），因此每次纯化批次时确定有多少 eDNA 与纯化的 curli 相关联是一种很好的做法。
1.μL的 TE 缓冲液、30 μL的 10% SDS 和 70 μL的蛋白酶 K（20 mg/mL）中重新悬浮 500 μg的纯化 curli 。
2.充分混合并在 37°C 下孵育 1 小时。
3.添加 100 μL的 5 M NaCl 并通过移液器混合。
4.添加 80 μL的 CTAB/NaCl 溶液，并通过使用宽孔吸头移液彻底混合。
5.在 37°C 下孵育 10 分钟。
6.加入 300 – 400 μL苯酚/氯仿/异戊醇，倒置试管进行混合
7.以 15,682 × g离心和4°C 5分钟。
8.将上相转移到新的 Eppendorf 管中。
9.加入 700 μL氯仿并通过移液器混合。
10.以 15,682 × g离心和4°C 5分钟。
11.将上相转移到新的 Eppendorf 管中，加入等体积的异丙醇并用手摇动管子。
12.-20°C 孵育 30 分钟。
13.在 13,362 × g和 4°C 下离心 5 分钟。
14.× g下离心 5 分钟。
15.将最终的 DNA 沉淀重悬于 30 μL TE缓冲液或水中。
16.使用DeNovix DS-11 FX分光光度计/荧光计测量 DNA 含量。

数据分析

为了从动物组织中检测细菌产生的卷曲，建议从每种组织类型中检测至少两个 50 mg 样本，并从感染组中筛选所有个体小鼠。在我们之前的工作中，我们没有在每只感染沙门氏菌的小鼠中检测到卷曲的存在（米勒等人，2020 年）。我们不确定这是因为 curli 的随机表达（即，它不是在每只小鼠中产生）还是由于检测的技术困难。出于这个原因，作者建议对一组中的每只动物进行测试。

食谱

1.MSB 肉汤 (1,000 毫升)
胰蛋白胨 10 克
酵母提取物 2.5 克
1 mL 的 1 M CaCl 2
1 mL 1 M MgSO 4
在标准液体循环（15 psi 下 20 分钟）上对溶液进行高压灭菌。

2.YESCA 肉汤（1,000 毫升）
酪蛋白氨基酸 10 克
酵母提取物 1 克
在标准液体循环（15 psi 下 20 分钟）上对溶液进行高压灭菌，并添加 DMSO（最终浓度 4%）。

3.T 琼脂 (1,000 毫升)
胰蛋白胨 10 克
琼脂 15 克
在标准液体循环（15 psi 下 20 分钟）上对溶液进行高压灭菌。

4.2 × SDS-PAGE 样品缓冲液 (100 mL)
Tris (1 M, pH 6.8) 8 毫升
SDS (20 %) 10 毫升
甘油 10 毫升
溴酚蓝 (0.1 %) 600 微升
β-巯基乙醇（新鲜添加）4 mL
蒸馏水 67.4 毫升

5.10 × SDS-PAGE 运行缓冲液 (1,000 mL)
Tris碱 30.3 克
甘氨酸 144.4 克
SDS 10 克

6.10 × Towbin缓冲液或传输缓冲液 (1,000 mL)
Tris碱 30.3 克
甘氨酸 144.4 克
通过添加 100 mL 的 10 ×转移缓冲液和 200 mL 的甲醇并加入 700 mL 的蒸馏水来制备 1 ×转移缓冲液。

7.10 × TBS (1,000 毫升)
Tris基地 24 克
氯化钠 88 克
将组件溶解在 900 mL 的蒸馏水中。用 HCl 将 pH 值调节至 7.6，并用蒸馏水调至最终体积。通过添加 100 mL 的 10 × TBS 和 900 mL 的蒸馏水来制备 1 × TBS。

8.1 × TBST
将 0.5 mL 的 Tween 20 添加到 1,000 mL 的 1 × TBS。

9.12% 分离胶（2 块胶）
蒸馏水 82.56 毫升
1.5 M Tris-HCl pH 8.8 48 mL
丙烯酰胺/双 (40%) 57.6 毫升
10% SDS 1.92 毫升
10% APS 1.92 毫升
96微升_

10.5% 浓缩胶（2 块凝胶）
蒸馏水 23.84 毫升
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 9.6 mL
丙烯酰胺/双 (40%) 4.5 毫升
10% SDS 400 μL
10% APS 480微升
40微升

11.AP 缓冲液（500 毫升）
100 mM Tris 6.06 克
100 毫米氯化钠 2.92 克
5 mM MgCl 2 · 6H 2 O 0.51 g
将组件溶解在 450 mL 的蒸馏水中。使用 3 M HCl 将 pH 值调节至 9.5，并使用蒸馏水和高压灭菌器将其调至 500 mL。

12.NBT/BCIP开发方案
AP 缓冲液 10 毫升
NBT 66微升
BCIP 33微升

致谢

这项研究得到了自然科学和工程研究委员会 (NSERC) 发现补助金(Grant #2017-05737)、 Jarislowsky生物技术主席以及萨斯喀彻温大学授予 APW CT 的医学院研究奖的支持，并得到了 NIH 的支持授予 AI153325、AI151893 和 AI148770。 EGH，得到了 NSERC 本科生研究奖的支持。我们感谢 VIDO 的 Neil Rawlyk提供一般技术援助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。我们最近的出版物（Miller et al ., 2020）中使用了成熟的 curli 纯化方案和来自动物组织的 curli 免疫检测。用于纯化 curli 中间体和 DNA 提取的方案发表在 Nicastro等人。（2019）。作为 VIDO 手稿系列第 968 号出版。

利益争夺

作者没有可竞争的利益报告。

伦理

根据加拿大动物护理委员会的指导方针和萨斯喀彻温大学动物护理和供应委员会的规定，按照萨斯喀彻温大学批准的动物使用协议 #20110057 或 20170080 照顾和使用小鼠动物研究伦理委员会。

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