材料和试剂

1. Whatman 床单（GE Healthcare，目录号：3030-931）
2. 10 mL无菌血清移液管（ Biofil ，目录号：GSP211010）
3. 1.5 mL 微量离心管
4. 从每个样品中纯化总基因组 DNA (~5 µg)
5. 为感兴趣区域设计的 DNA 探针
6. 限制性酶
a. HpaII （New England Biolabs，目录号：R0171S）
b. MspI （新英格兰生物实验室，目录号：R0106S）
c. HaeII （New England Biolabs，目录号：R0107S）
d. PstI -HF（New England Biolabs，目录号：R3140S）
e. EcoRV -HF（New England Biolabs，目录号：R3195S）
f. 10 × CutSmart Buffer（New England Biolabs，目录号：B7204S）
7. 超纯水（Invitrogen，目录号：10977-023）
8. 阿默舍姆 Rediprime II DNA 标记系统（GE Healthcare，目录号：RPN1633）
9. 怡乐思 MicroSpin G-50 色谱柱（GE Healthcare，目录号：27533001）
10. Zeta-Probe ®印迹膜（ Biorad ，目录号：162-0165）
11. UltraPure TM琼脂糖（ Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：16500-100）
12. 1 kb DNA梯（New England Biolabs，目录号：N3232S）
13. 氢氧化钠（Fisher Scientific，目录号：27815S）
14. 氯化钠（ HiMedia ，目录号：MB023-1Kg）
15. Tris-base（Fisher Scientific，目录号：15965-500G）
16. 盐酸（Fisher Scientific，目录号：29505）
17. 柠檬酸三钠（Fisher Scientific，目录号：14005）
18. 硼酸（Fisher Scientific，目录号：12005）
19. Ficoll-400（Sigma，目录号：F2637）
20. 溴酚蓝钠盐（Sigma，目录号：B5525）
21. 磷酸氢二钠，分子量 141.96 g/mol（Sigma 目录号：71642）
22. 双蒸高压灭菌水（除非另有说明，否则称为“水”）
23. 溴化乙锭（ Himedia ，目录号：MB071）
24. 十二烷基硫酸钠（SDS）（ Himedia ，目录号：GRM205）
25. 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA），分子量372.24 g/mol（Fisher Scientific，目录号：12635）
26. 正磷酸（Fisher Scientific，目录号：29245）
27. dCTP [α- 32 P]，10 mCi /mL（Board of Radiation and Isotope Technology，印度，目录号：PLC102）
28. 20 ×盐水-柠檬酸钠 (SSC)（参见食谱）
29. 脱嘌呤溶液（见配方）
30. 变性溶液（见配方）
31. 中和溶液（见配方）
32. 杂交缓冲液（见配方）
33. 溴化乙锭染色溶液（见配方）
34. 2 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2（见配方）
35. 10% SDS（见配方）
36. 0.5 M EDTA pH 8.0（见配方）
37. 1 M Tris 缓冲液 pH 8.0（参见配方）
38. 10 × Tris-Borate-EDTA (TBE) 缓冲液（参见配方）
39. 1 × Tris-EDTA (TE) 缓冲液（参见配方）
40. 8 × DNA 上样缓冲液（参见配方）
41. 洗涤缓冲液 1（参见配方）
42. 洗涤缓冲液 2（参见配方）
43. 洗涤缓冲液 3（参见配方）

设备

1. 水浴（ Neolab Instruments，印度，型号：WB-343）
2. 微量离心机（Eppendorf，型号：5415R）
3. Thermomixer（Eppendorf，型号：Thermomixer comfort）
4. 化学通风柜
5. 带附件的 DNA 凝胶电泳仪 ( Biorad , Sub-Cell GT Cell)
6. 杂交烘箱（ Thermo Fisher Scientific、 Hybaid烘箱）
7. 混合气瓶（WHEATON ®安全涂层，混合瓶， DWK生命科学，目录号：805027）
8. Typhoon Phosphor-Imager 扫描系统（ Amersham Biosciences，GE Healthcare，型号：Typhoon TRIO）
9. 荧光屏（GE Healthcare，20 × 24 cm）
10. 荧光粉曝光盒（GE Healthcare，20 × 24 cm）
11. 电泳电源装置（ Biorad 、 PowerPac HC）
12. 玻璃托盘
13. 微波炉
14. 凝胶摇杆（ Bionova India，型号：SLMGR100）
15. 气泡水平
16. 紫外凝胶成像系统（ Vilber Gel 文档系统）
17. UV交联剂（UVP，型号：CL1000）
18. PCR热循环仪（ Biorad ，型号：S1000）
19. 带有放射性处置设施的放射性物质安全工作空间

软件

1. 图像J
2. 台风TRIO图像采集系统

程序

A. 基因组 DNA 消化
1. 将来自每个样品的大约 3 – 4 µg DNA（使用荧光法、分光光度法或通过凝胶电泳估计）放入 1.5 mL 微量离心管中，并用超纯水补足至 40 µL。
2. 添加 5 μL 的 10 × CutSmart 缓冲液和 40 单位的相应酶。用超纯水将总反应体积补至 50 μL。
3. 将密封管在水浴中孵育 12 至 16 小时，以促进完全消化。如果水浴不包含用于混合样品的流动搅拌器，请每隔 3 小时敲击一次手动混合。
4. 孵育后，在反应混合物中加入 8 µL 的 8 × DNA 上样缓冲液。轻轻敲击并旋转试管以收集内容物，然后进行凝胶电泳。
注意：如果需要，用上样缓冲液消化的 DNA 可以在 -20°C 下无限期储存。

推理
LINE1 是一种保守的转座子，通过植物中的 DNA 甲基化进行调节(Cui et al ., 2013) 。在这个例子中，在野生型 (WT) 水稻品种 - Pusa Basmati1 ( Oryza sativa Indica spp. ) 和植物特异性 RNA 沉默突变体的敲低突变体 (for详情请参考Sundar et al ., 2021 )。图 1A 显示了突变基因型中的 DNA 低甲基化，因为在特定植物样品（ HpaII泳道）中观察到了额外的较小尺寸的条带。从同样生长的40 天大的 WT 和突变水稻植物的叶子样品中提取进行测试的基因组 DNA 。当 DNA 用甲基化敏感酶消化时，低甲基化的部分容易产生酶活性，因此与甲基化对应物相比，积累的 DNA 片段更短。当与互补的标记链杂交时，我们观察到其他较小的片段反映了它们的低甲基化状态。对于相应的样品，在MspI和HaeII泳道中观察到类似的低甲基化。总之，这些不同的条带模式证实了突变基因型的特定系在 LINE1 基因座中显示 DNA 低甲基化。
图 1B 显示了 LINE1 转座子在突变系中的转座子显示图（转座子拷贝数概况）。突变体中的其他条带（红色箭头）表明，由于突变基因型中 DNA 甲基化的丧失，LINE1 元件已在基因组中增殖。当转座子增殖时，与转座子的原始拷贝相比，基因组中的新整合位点将在整合位置附近具有不同的酶识别位点模式。当用不同的酶消化时，这些额外的拷贝往往会产生展示这些新消化片段的杂交谱。

图 1. 不同基因型水稻中 LINE1 转座子 DNA 甲基化和拷贝数研究的 Southern 印迹。
A.来自不同基因型水稻的 LINE1 探针杂交片段的概况。使用寡核苷酸5' - tctctggacgagcctgttccaa-3 ' 和5' - ggctaagtcgtcagttgaatgc-对用甲基化敏感酶（ HpaII 、 MspI和HaeII ）消化的 DNA 进行电泳、印迹和杂交，并与从水稻基因组 LINE1 片段中扩增的探针杂交。 3 ' .附加条带（红色箭头）表示特定突变基因型与 WT 样本相比具有差异甲基化模式。 B. 转座子拷贝数印迹显示突变系中 LINE1 转座子的额外转座事件（红色箭头）。

B. 凝胶电泳：
1. 使用合适的梳子设置干净的凝胶铸造装置（每口井应该能够容纳大约 75 μL）。使用气泡水平仪确保凝胶托盘安装在没有倾斜的平直表面上。
2. 称量浇铸 0.8% (w/v) 凝胶所需的UltraPure TM琼脂糖的量，然后在微波炉中将其融化在玻璃瓶内适当体积的 1 × TBE 缓冲液中。避免凝胶混合物沸腾，因为这可能会改变缓冲液的浓度。再次测量熔融凝胶混合物，并用无菌水弥补蒸发损失。让混合物冷却。一旦温度约为 65°C，将凝胶混合物倒入凝胶浇注托盘中，静置 45 分钟。
注意：对于标准 15 × 10 cm 凝胶托盘，约 160 mL 0.8% 1 × TBE 凝胶需要约 1.5 cm 厚的凝胶，可容纳约 75 µL 孔体积。
3. 向凝胶电泳槽中加入所需体积的新鲜稀释的 1 × TBE 缓冲液，然后将凝胶放入仪器中直至完全浸没。
4. 将消化后的 DNA 加载到孔中，并包括一个 1-kb DNA 梯子（~1 µg）。在 80 V（约 8 V/cm 的凝胶长度）下进行电泳，直到溴酚蓝示踪染料到达凝胶底部（约 2.5 小时）。

C. 溴化乙锭染色和可视化
1. 将凝胶转移到含有足够体积的溴化乙锭染色溶液（约 350 mL）的干净玻璃托盘（容量约为 1 L）中。染色溶液在水中含有 0.5 µg/mL 溴化乙锭。
2. 在凝胶摇杆上轻轻摇动15-20 分钟，然后在 UV 凝胶成像系统中对凝胶进行成像。该图像既可用作加载控制，又可检查消化程度。

D. 脱嘌呤、变性和中和
1. 为帮助高效转移更高分子量的 DNA 片段，将凝胶在浸没量的脱嘌呤溶液中轻轻摇晃 20 – 30 分钟，直到溴酚蓝染料变为橙色。
注意：如果预期的片段大小小于 5 kb，则可以避免脱嘌呤步骤。
2. 弃去脱嘌呤溶液，用大量变性溶液代替，在摇杆中轻轻摇动 1 小时。
3. 丢弃变性溶液，并用大量水（约 20 凝胶体积）清洗凝胶。重复四次以消除任何残留的缓冲液。
4. 倒入 20 凝胶体积（~350 mL）的中和溶液，并继续轻轻摇动 1 小时。使用锋利的手术刀，修剪凝胶孔，仅保留电泳凝胶部分。

E. 毛细管转移到尼龙膜（图 2A）
1. 在一个大槽中，放置一个倒置的凝胶托盘（充当木板）。将 Whatman 片材切成长方形灯芯，其宽度等于修剪过的凝胶的宽度。灯芯的长度应该足够长，以便在托盘底部折叠。
2. × SSC 缓冲液倒入槽中，以完全润湿灯芯。小心地倒置凝胶（装载面朝向底部木板），并将其放在湿灯芯上。将 Zeta Probe 尼龙膜切割成精确修剪的凝胶尺寸，先在小托盘中将其浸入水中 3 秒，然后将其浸入另一个托盘中的 20 × SSC 中。
3. 用 20 × SSC 缓冲液彻底倒入凝胶，小心地将膜放在凝胶上，避免气泡。
注意：一旦放置在凝胶上，不得移动膜。根据印迹识别的要求，膜的凝胶接触面应在角落用铅笔标记。放置凝胶后，如果要去除气泡，必须使用无菌血清移液器轻轻滚动膜，消除气泡。
4. 切割三张 Whatman 膜尺寸，并小心地依次放置在膜上。将前两张纸浸入 20 × SSC 缓冲液中并放在凝胶上，而第三张纸则放在湿的 Whatman 纸上，无需预润湿。使用血清移液器轻轻滚动床单，以消除间隙和气穴。
5. – 12 厘米长的 Whatman 吸墨纸垂直堆叠设置，切割成膜的尺寸。在床单上放一块木板，并在上面放上约 200 克的重量（如玻璃瓶）。允许毛细管转移在室温下进行 14-16小时的设置后。
注意：确保槽底部有足够量的 20 × SSC 缓冲液，用于整个毛细管转移过程。

图 2. Southern 毛细管转移和交联。
A. Southern 毛细管印迹设置的图形表示。 B. 以所需剂量产生连续 UV-C 光束的 UV 交联剂的照片。

F. 紫外交联膜：
1. 小心拆卸装置，并保留一盘新鲜制备的 2 × SSC 缓冲液。
2. 使用镊子小心地将膜从凝胶中取出，然后将其浸入 2 × SSC托盘中15-20 秒。该步骤去除沉积在膜上的盐沉淀物。
3. 立即将膜放在干燥的 Whatman 纸上，转移面朝上，然后进行 UV 交联剂。
4. 使用 1200 焦耳连续脉冲的 UV-C 辐照将 DNA 与膜交联。紫外线照射器提供连续的紫外线光束，直到 1200 焦耳的能量均匀地照射在膜表面上（图 2B）。
5. 将膜置于密封的塑料盖中，并在 4°C 下储存直至杂交。
注意：转移后的凝胶可以用溴化乙锭重新染色，以检查残留的 DNA，从而检查转移效率。观察到高分子量 DNA 片段（约 25 kb 以上）的部分保留是正常的。

G. 探针的放射性标记：
1. 将大约 25 ng 感兴趣的探针区域的纯化同质 DNA 置于 45 μL 的体积中，并在 0.2 mL PCR 管中加满 1 × TE 缓冲液。
注意：所需的探针应在 PCR 扩增或质粒消化后进行凝胶洗脱和纯化，以免其他污染 dsDNA 分子。探针必须在 1 × TE 缓冲液中洗脱。有关理想探头的特性，请参见注释。
2. 将热循环仪中的探针溶液在 99°C 下加热 6-7分钟，然后立即放在冰上，使探针保持在变性状态。
3. 将探针混合物从冰中添加到Rediprime标记试剂盒小瓶中。向该小瓶中加入 5 µL [α- 32 P] dCTP ，并用移液器轻轻混合 10 次，使冻干的反应混合物溶解而无气泡。在恒温器中于37°C孵育30 分钟。
4. 添加 2 μL 的 0.5 M EDTA 以停止反应。纯化反应混合物以去除未标记的 [α- 32 P] dCTP和其他反应组分，使用 G-50 色谱柱，按照制造商的说明进行。简而言之，捏掉 G-50 柱的塑料密封，并以 800 × g的速度旋转 1 分钟以去除防腐缓冲液。将管子放在新鲜的 1.5 mL 收集管上，小心地将标记的反应混合物加到柱床上。以 800 × g再次旋转以收集纯化的探针。

H. 杂交、严格洗涤和暴露于成像屏幕：
1. 在烘箱中将杂交缓冲液加热至 65°C。将卷好的膜放入杂交瓶中，加入 50 mL 预热（至 65°C）的杂交缓冲液。将瓶子放入预热的杂交烘箱中。让这个预杂交步骤在 65°C 进行 2 小时，同时缓慢旋转杂交瓶（大约 12 – 15 rpm）。（这是为了便于用杂交缓冲液均匀覆盖膜，并封闭没有 DNA 的区域）。
2. 取出杂交缓冲液，换上 10 – 12 mL 新鲜的预热杂交缓冲液。允许在烤箱中旋转 10 – 15 分钟。
3. 将纯化的放射性标记探针在热混合器中 99°C 变性 5 分钟。立即放在冰上。
4. 尽快将变性探针加入 65°C 的杂交瓶中。让杂交在 65°C 下缓慢旋转 16 – 20 小时。
5. 杂交缓冲液弃入放射性废物中，加入 30 mL 预热至 65°C 的洗涤缓冲液 1。用力摇晃并冲洗印迹，并用 50 mL 新鲜的洗涤缓冲液 1 替换。在烘箱中继续旋转 30 分钟。
注意：所有洗涤缓冲液必须预热至 65°C，洗涤步骤在相同温度下轻轻旋转。
6. 丢弃洗涤缓冲液 1，并用 40 mL 洗涤缓冲液 2 代替。在烘箱中孵育 30 分钟。将洗涤缓冲液 2 替换为洗涤缓冲液 3，然后再次进行 30 分钟。
7. mL 的 2 × SSC 缓冲液（在室温下）冲洗印迹。在塑料盖中以湿态密封印迹，并将密封的印迹固定在曝光盒中，DNA 面朝上。将新擦除的荧光粉成像屏幕放在印迹上，然后关闭曝光盒。理想情况下，在室温下暴露 2-3 天就足够了。

I. 对屏幕进行成像，并剥离印迹：
1. 在分子成像仪上对屏幕进行成像，使用合适的激光激发波长和最大光电倍增管 (PMT) 激励电压。可以使用分子成像仪（.gel格式）提供的软件获取图像，并使用 ImageJ 软件包进行分析。
2. 印迹现在已准备好剥离和重新探测。
如果要进行剥离和重新探测，请确保印迹始终用一层 2 × SSC 缓冲液保持湿润。干燥的印迹很难剥离。
3. 预热烤箱和洗涤缓冲液 3 至 92°C。将热洗缓冲液 3 添加到含有印迹的杂交瓶中，并在相同温度下旋转 15 分钟。丢弃，用新鲜的洗涤缓冲液 3 替换，再继续 15 分钟。
4. 在室温下用 2 × SSC 缓冲液彻底清洗印迹，并将其储存在 4°C 的密封盖中，直到与新探针进行下一轮杂交。

笔记

1. 理想情况下，选择长度在 600 bp 到 2,000 bp 之间的探针，该探针对于转座子或感兴趣的重复是唯一的。避免长末端重复 (LTR) 的区域，因为不同 LTR 转座子之间可能存在延伸的保守性。选择编码转座酶的区域，或基因组的其他转座子相关编码区域。
2. 选择经证实可在长时间孵育后显示出降低星型活性和增加稳定性的限制性内切酶。避免添加超过 50 个单位的限制酶，因为这可能会导致过度消化或星号活性。
3. 在反复剥离和重新探测后，观察到 Southern 图像质量下降是正常的。为避免质量损失，可通过增加 DNA 量来扩大反应体积，并通过真空浓缩或乙醇沉淀进行消化后浓缩 DNA。
4. 如果该协议适用于其他真核生物，请根据基因组大小放大/缩小 DNA 数量，而所有其他步骤保持不变。任何来源的基因组 DNA 不得超过 10 µg。

食谱

1. 20 ×盐水-柠檬酸钠 (SSC) [3 M 氯化钠，0.3 M 柠檬酸三钠，pH 7.0] 缓冲液
称取 175.3 克氯化钠和 88.2 克柠檬酸三钠并将它们溶解在 800毫升水中。使用盐酸 (HCl) 将 pH 值调节至7.0，并补足至 1,000 mL 。对溶液进行高压灭菌，并在室温 (RT) 下储存。
2. 脱嘌呤溶液 [0.15 N HCl]
mL的浓 HCl 添加到 280 mL的水中并使体积达到 300 mL ，制备新鲜的脱嘌呤溶液（0.15 N HCl）。
3. 变性溶液 [1 M 氯化钠，0.5 M 氢氧化钠]
将 20 g NaOH 和 58.44 g 氯化钠溶于 800 mL水中，定容至 1000 mL 。高压灭菌器，并储存在 RT。
4. 中和溶液 [1.5 M 氯化钠，0.5 M Tris-Cl]
将 87.66 g NaCl 和 60.55 g Tris 碱溶解在 800 mL水中。使用浓HCl将 pH 值调节至 7.0 ，并使体积达到 1,000 mL 。高压灭菌器，并储存在 RT。
5. 2 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2
称取 56.8 克磷酸氢二钠盐，溶于 140 mL预热至 ±70 °C 的水中。使用正磷酸将 pH 值设置为 7.2。将体积补至 200 mL，高压灭菌，并储存在 RT。如果出现沉淀，请重新加热缓冲液以溶解组分。
6. 10% SDS (w/v)
将 50 克 SDS 溶解在 450毫升水中。将体积补至 500 mL，并储存在 RT。
7. 0.5 M EDTA pH 8.0
将 18.6 克 EDTA 溶解在 60 mL的双蒸馏水中。继续缓慢添加 NaOH 颗粒，直到 EDTA 完全溶解。使用 10 N NaOH 将 pH 值调节至 8.0。使体积达到 100 mL ，高压灭菌，并储存在 RT。
8. 杂交缓冲液 [0.5 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA]
将 10% SDS 和 2 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 溶液预热至 65 °C。混合 70 mL 的 10% SDS、25 mL 的 2 M 磷酸钠缓冲液、4.8 mL 的水和 0.2 mL 的 0.5 M EDTA pH 8.0，并在水浴中将溶液加热至 65°C。
9. 10 × Tris硼酸盐 EDTA (TBE) 缓冲液 [0.89 M Tris-Cl、0.89 M 硼酸、20 mM EDTA]
称取 108 克 Tris 碱、55 克硼酸和 7.5 克 EDTA。将它们溶解在 800 mL水中。 pH 应自行调节至 ~8.2。使体积达到 1,000 mL ，高压灭菌并储存在 RT。
10. 1 M Tris 缓冲液 pH 8.0
将 121.14 克 Tris 碱溶解在 800毫升水中。使用浓 HCl 将 pH 值调节至 8.0。使体积达到 1,000 mL ，高压灭菌并储存在 RT。
11. 1 × Tris-EDTA (TE) 缓冲液 [10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA]
在 8 mL的超纯水中加入 100 μL 的 1 M Tris 缓冲液 pH 8.0 和 20 μL 的 0.5 M EDTA pH 8.0。使体积达到 10 mL 。存储在 RT。
12. 8 × DNA 上样缓冲液 [20% Ficoll-400、88 mM EDTA、26.4 mM Tris-Cl pH 8.0、0.12% 溴酚蓝二钠盐]
对于 10 mL的加载缓冲液，将 2 g Ficoll-400 溶解在 8 mL的超纯水中。添加 1.76 mL的 0.5 M EDTA pH 8.0 和 0.264 mL的 1 M Tris 缓冲液 pH 8.0。加入 12 mg 溴酚蓝钠盐，混合并溶解。用超纯水使体积达到 10 mL 。储存在 4 °C。
13. 洗涤缓冲液 1 [3 × SSC 和 0.1% SDS]
向 80 mL水中加入 15 ml 20 × SSC 缓冲液和 1 mL 10% SDS。使体积达到 100 mL 。准备新鲜。
14. 洗涤缓冲液 2 [0.5 × SSC 和 0.1% SDS]
向 80 mL水中加入 2.5 mL的20 × SSC 缓冲液和 1 mL的 10% SDS。使体积达到 100 mL 。准备新鲜。
15. 洗涤缓冲液 3 [0.1 × SSC 和 0.1% SDS]
向 80 mL的水中添加 0.5 mL 的20 × SSC 缓冲液和 1 mL的 10% SDS。使体积达到 100 mL 。准备新鲜。

致谢

这项工作得到了 NCBS-TIFR 核心资金和赠款的支持（BT/PR12394/AGIII/103/891/2014；BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19；BT/PR25767/GET/119/151/2017 ) 来自印度政府生物技术部 (DBT)。这项研究还得到了印度政府原子能部的支持，项目标识号为 RTI 4006（1303/3/2019/R&D-II/DAE/4749，日期为 2020 年 7 月 16 日）。
我们感谢 K. Veluthambi教授提供的水稻种子。我们感谢 NCBS 校园的放射性设施、实验室厨房、温室和实验室支持团队。该协议是从Sundar等人提出的原始研究中采用的。（2021 年），并针对来自Ramanathan 和 Veluthambi（1995 年）的甲基化分析进行了修改。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

1. 崔 X.金P. 崔 X. 顾 L. 卢 Z.薛Y. 魏 L. 齐 J. 宋 X. 罗 M.等人。（2013）。组蛋白 H3K4 去甲基化酶对水稻转座子活性的控制。 Proc Natl Acad Sci USA 110(5): 1953-1958。
2. Masser博士，斯坦福博士和弗里曼，WM（2015 年）。通过下一代测序进行靶向 DNA 甲基化分析。 J Vis Exp ( 96)：52488。
3. Ramanathan, V. 和Veluthambi , K. (1995)。从 TL-DNA 的左端转移根癌农杆菌 Ti 质粒 pTiA6 的非 T-DNA 部分。植物分子生物学28（6）：1149-1154。
4. Sundar, VH, Swetha, C., Basu , D., Pachamuthu , K., Chakraborty, T., Mosher, R. 和Shivaprasad , P. V. (2021)。植物聚合酶 IV 通过组蛋白修饰使染色质敏感，以防止沉默扩散到蛋白质编码域。 bioRxiv doi ： https ://doi.org/10.1101/2021.08.25.457601 。
5. Zhang, H.、Tang, K.、Wang, B.、Duan, CG、Lang, Z. 和 Zhu, JK (2014)。方案：植物中 RNA 指导的 DNA 甲基化分析的初学者指南。植物方法 10:18 。
6. Zhang, H.、Lang, Z. 和 Zhu, JK (2018)。植物DNA甲基化的动力学和功能。 Nat Rev Mol 细胞生物学19(8): 489-506。