材料和试剂

1. Tissue Tek 载玻片染色皿（Fisher，目录号：NC0731403）
2. 载玻片架（Fisher，目录号：NC9697666
3. 10 mL预填充冲洗注射器盐水（NaCl 0.9％）（BD，目录号：306575）
4. 25G × ¾''血液采集装置（BD，目录号：367285）
5. 费雪牌 ColorFrost TM Plus 显微镜载玻片（Fisher，目录号：12-550-17）
6. Fisherbrand TM标准一次性转移移液器，未毕业（Fisher，目录号：13-711-7M）
7. 山羊抗大鼠 IgG 抗体（H+L），生物素化（载体，目录号：BA-9400）
8. 山羊抗兔IgG抗体（H + L），生物素化（载体，目录号：BA-1000）
9. VECTASTAIN(r) Elite ABC-HRP 试剂盒，过氧化物酶（标准）（载体，目录号：PK-6100）
10. Dako液体3,3'-二氨基联苯胺（DAB）和底物（DAKO，目录号：K3468）
11. CD4（D7D2Z）（CST，目录号：25229）
12. CD8a（D4W2Z）（CST，目录号：98941）
13. CD19（D4V4B）（CST，目录号：90176）
14. F4/80（BM8）（Invitrogen，目录号：144801）
15. 二甲苯（Sigma，目录号：534056）
16. 10 ×柠檬酸盐缓冲液pH 6.0（Novus Biologicals，目录号：NB900-62075）
17. Triton X-100（Sigma，目录号：X100）
18. 乙醇（Fisher Bioreagents，目录号：BP2818100）
19. 过氧化氢（ BioRad ，目录号：BUF017B）
20. 苏木精复染剂（载体，目录号：H-3401-500）
21. 蛋白酶K（ abcam ，目录号：ab64220）
22. 10 × PBS（磷酸盐缓冲盐水）（Thermo Scientific，目录号：AAJ75889K8）
23. 正常山羊血清封闭溶液（载体，目录号：S-1000-20）
24. 费雪牌超霜TM Excell TM显微镜载玻片（Fisher，目录号：22-037-247）
25. 费雪化学 Permount TM安装介质（Fisher，目录号： SP15-100 ）
26. Dako抗体稀释剂（Agilent，目录号：S0809）
27. 去离子水
28. B6/ lpr （杰克逊实验室，目录号：000482）
29. 10％中性缓冲福尔马林（Fisher，目录号：22-110-869）
30. Globe Scientific 矩形盖玻片，尺寸 24 × 50 mm，No.1（Fisher，目录号：22-170-388）
31. Tween 20（Sigma，目录号：P1379）
32. PBS（磷酸盐缓冲液）和 PBS-T（吐温）（见食谱）
33. 10 mM 柠檬酸钠（见食谱）
34. 发蓝溶液（见食谱）

设备

1. 钳子
2. 切片机（任何供应商）
3. 微波（任何供应商）
4. 压力锅（任何供应商）
5. Leica SCN400 扫描仪
6. 通风柜（任何供应商）
7. ×和 40 ×透镜的光学显微镜
8. 水浴 (ISOtemp205)
9. Fisher Scientific Isotemp 650D 恒温箱

软件

1. AperioImage Scope（徕卡， https: //www.leicabiosystems.com/us/digital-pathology/manage/aperio-imagescope ）

程序

A. 组织处理（肝、肺、胰腺和结肠）
1. 收集组织
a. 2和颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
b. 从下巴到胸部切开皮肤。
c. 切掉胸骨。
d. 使用连接到 10 mL 注射器和 0.9% 盐水的 25G 蝴蝶针，将其插入左心室，靠近心尖。
e. 切开右心房，用生理盐水灌注。
f. 收集肝脏、肺、胰腺和结肠。
2. 固定组织
a. 对结肠和胰腺使用 10 mL 的 10% 福尔马林，对肝脏和肺使用 20 mL 的 10% 福尔马林。
b. 在室温下固定 48 小时。
3. 脱水组织
a. 在室温下将组织浸入 70% 乙醇中 15 分钟。
b. 在室温下将组织浸入 90% 乙醇中 15 分钟。
c. 在室温下将组织浸入 100% 乙醇中 3 次，每次 30 分钟。
d. 在室温下将组织浸入二甲苯中 3 次，每次 20 分钟。
4. Isotemp恒温箱中加热石蜡。
5. °C 下将组织嵌入石蜡中。由于石蜡需要几分钟才能硬化，这可能是该过程中的一个暂停点。
6. 切割 5 μm厚的切片。
7. 将每个部分放入水浴中，使其漂浮，然后用滑梯舀出以安装该部分。
8. 在室温下干燥幻灯片过夜。

B. 脱蜡和水合
通过以下解决方案沉浸幻灯片：
a. 二甲苯（纯），三次洗涤，每次 3 分钟。
b. 100% 乙醇，两次洗涤，每次 1 分钟。
c. 95% 乙醇，两次洗涤，每次 1 分钟。
d. 70% 乙醇，一次洗涤 1 分钟。
e. 用去离子水洗涤两次，每次 3 分钟。

C. 热诱导抗原修复
1. 将 10 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 添加到带载玻片的染色盘中，然后放入高压锅或微波炉中，以全功率煮沸 10 分钟。然后，保持半功率 10 分钟（总共 20 分钟）。对于蛋白酶 K 修复，在切片中加入 200 μL ，在室温下孵育 5 分钟，然后按照步骤 C.4 进行操作。
2. 在室温下冷却 30 分钟。
3. 在蒸馏水中清洗载玻片 5 分钟。
4. 在 PBS-T 中清洗幻灯片 3 次，每次 5 分钟。

D. 过氧化物酶猝灭
1. 阻断内源性过氧化物酶活性：
a. 在 PBS-T 中的 3.0% 过氧化氢中淬火切片 10 分钟。
b. 在 PBS-T 中清洗幻灯片 3 次，每次 5 分钟。

E. 非特异性结合的通透和阻断
1. 透化
a. 在 PBS 中用 0.1% Triton X-100 清洗切片 10 分钟。
b. 在 PBS-T 中清洗幻灯片 3 次，每次 5 分钟。
2. 阻塞
通过在室温下将组织切片在 PBS-T 中的 10% 山羊血清中孵育 25 分钟来阻止非特异性结合。

F. 抗体孵育
1. Dako抗体稀释剂中的一抗染色，按照以下注释中的稀释度进行。
a. 在室温下孵育 1.5 小时。
b. 在 PBS-T 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
2. 二抗染色。
a. 加入生物素化二抗（1:200），室温孵育 30 分钟。
b. 在 PBS-T 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。

G. 检测
1. ABC（抗生物素蛋白/生物素化酶复合物）法：
a. 在 PBS 中以 1:50 稀释，提前 30 分钟制备试剂 A（抗生物素蛋白）和 B（生物素化 HRP）的工作溶液。要准备 1:50 稀释，请将每种试剂的 100 μL添加到 5 mL 的 PBS 中。
b. 在室温下孵育组织切片 30 分钟。
c. 在 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
2. 准备 DAB (3,3'二氨基联苯胺)
a. 确定所需的 DAB 体积（每节100 μL ）。按照制造商的说明，每毫升底物缓冲液添加一滴 DAB。
警告：戴上手套，在通风橱中工作。
b. 添加 100 μ L的 DAB 工作溶液。带有 HRP的生物素化抗体将氧化 DAB 并在抗原部位产生棕色沉淀。每 5 分钟监控一次幻灯片以可视化棕色。
c. 当所需的染色呈棕色时，用去离子水清洗载玻片。

H. 复染
1. 使用苏木精复染。
a. 将载玻片浸入苏木精中以覆盖组织切片。
b. 孵育 16 秒。
c. 用自来水冲洗切片，直至水无色。
d. 将载玻片浸入酸性冲洗溶液十次，然后浸入自来水中十次。
e. 在蓝色溶液中孵育载玻片。
注意：苏木精每周过滤一次。

I. 幻灯片脱水和安装
1. 通过以下溶液两次使载玻片脱水，每次 1 分钟：
a. 95% 乙醇
b. 100% 乙醇
c. 二甲苯（纯）
2. 安装盖玻片
使用移液器，每张幻灯片添加一滴安装介质并放置盖玻片。让其干燥 1 – 2 小时。

J. 幻灯片可视化
使用 Leica SCN400 扫描载玻片，或使用显微镜观察组织切片（图 1）。

小鼠肝脏的免疫组织化学。

笔记

抗体名称公司猫＃抗原修复抗体稀释
CD19 细胞信号转导 90176 柠檬酸盐缓冲液 1:1,000（1 μL抗体 + 999 μL稀释剂）
CD8a 细胞信号转导 98941 柠檬酸盐缓冲液 1:100
CD4 细胞信号转导 25229 柠檬酸盐缓冲液 1:80
F4/80 电子生物科学 14-4801 蛋白酶K 1:200（5 μL抗体+ 995 μL稀释剂）
生物素化山羊抗大鼠向量 BA-9400 柠檬酸盐缓冲液 1:200

食谱

1. PBS（磷酸盐缓冲液）和 PBS-T（吐温）
1 × PBS（900 mL 水 + 100 mL 10 × PBS）
0.05% Tween 20（将 0.5 mL 的 Tween 20 添加到 1 L 的 1 × PBS）
0.1% Triton（将 1 mL 的 Triton 添加到 1 L 的 1 × PBS）
2. 10 mM 柠檬酸钠
10 毫升 10 ×柠檬酸盐 + 90 毫升水
3. 发蓝解决方案
1.5 mL NH 4 OH（30% 库存）
98.5 毫升 70% 乙醇

致谢

我们要感谢 Shalom Lerrer、Sean Chen、Hongyan Tang、Tao Su 和 Sun Dajiang 的支持和专业知识。这项工作得到了 NIH (AI125640、CA231277、AI150597) 和癌症研究所的资助。该出版物中使用了此处描述的方法（ Adam等人，2021 年）。

利益争夺

作者报告没有竞争利益。

伦理

根据 NIH 指南使用并经哥伦比亚大学机构动物使用和护理委员会批准的动物。图形来自BioRender库存 IHC 图像。该协议改编自： https ://www.rndsystems.com/resources/protocols/protocol-preparation-and-chromogenic-ihc-staining-paraffin-embedded-tissue 。

参考

1. Adam, K.、Iuga, A.、Tocheva, AS 和 Mor, A. (2021)。检查点抑制剂诱导的不良事件的新型小鼠模型。公共科学图书馆一号16（2）：e0246168。
2. de Boer, E., Warram , JM, Tucker, MD, Hartman, YE, Moore, LS, de Jong, JS, Chung, TK, Korb , ML, Zinn, KR, van Dam, GM, et al . （2015 年）。体内荧光免疫组织化学：荧光标记的西妥昔单抗在鳞状细胞癌中的定位。科学代表5：10169。
3. 梅斯特尔(2017)。癌症：用抗体成像。自然543（7647）：743-746。
4. Knight, JC, Mosley, MJ, Kersemans , V., Dias, GM, Allen, PD, Smart, S. 和 Cornelissen, B. (2019)。双同位素成像允许在肿瘤中使用放射性标记的抗体进行体内免疫组织化学。核医学生物学70：14-22。
5. Wen, L.、Xia, L.、Guo, X.、Huang, HF、Wang, F.、Yang, XT、Yang, Z. 和 Zhu, H. (2021)。多模式成像技术在患者衍生的异种移植小鼠模型中使用曲妥珠单抗偶联的有机纳米颗粒有效监测肿瘤中的 HER2 表达。前Oncol 11：778728。