材料和试剂

1. 12孔板（Corning，Costar ® ，目录号：3513）
2. 微量移液器吸头 (0.5 – 20 µL, 100–200 µL, 1,000 µL) (Greiner Bio-One)
3. 60毫米细胞培养皿（Corning，Falcon ® ，目录号：353004）
4. 100 mm细胞培养皿（Corning，Falcon ® ，目录号：353003）
5. 注射器过滤器0.2μm （ VWR，目录号：28145-501）
6. 10号一次性手术刀刀片（ pfm Medical ag，Feather ® ，目录号：201000010）
7. 血清移液器 (5 mL, 10 mL) (Corning, Stripette TM )
8. 15 mL锥形管（Greiner Bio-One，目录号：188271）
9. 50 mL锥形管（Greiner Bio-One，目录号：227261）
10. T75烧瓶（Corning，目录号： CLS430641 ）
11. 可逆细胞过滤器（Stem Cell Technologies，目录号：27215）
12. 细胞过滤器 20 µm（Cell Trics TM ， Sysmex Partec GmbH，目录号：04-004-2325）
13. FACS管（5 mL聚苯乙烯圆底管，Falcon，目录号：352058）
14. 胶原酶 A（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10103578001）
15. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（无钙，无镁）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：14190094）
16. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ® ，目录号：25200056）
17. Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）高葡萄糖（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：11960044）
18. 胎牛血清（FBS）（ Thermo Scientific， Gibco TM ，目录号：10082147）
19. 青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
20. MesenCult TM MSC 基础培养基（人）（ Stemcell Technologies，目录号：05401）
21. MesenCult TM MSC 刺激补充剂（人）（ Stemcell Technologies，目录号：05402）
22. 70% 乙醇
23. 0.5 M EDTA（Invitrogen，目录号：AM9260G）
24. CD11c-PE（ Biolegend ，目录号：337205）
25. CD14-PE（ Biolegend ，目录号：301805）
26. CD19-PE（ Biolegend ，目录号：302207）
27. CD44-PE（ Biolegend ，目录号：397503）
28. CD45-PE（ Biolegend ，目录号：304007）
29. CD73-PE（ Biolegend ，目录号：344003）
30. CD90-PE（Abcam，目录号：328109）
31. CD90-APC （BD biosciences，目录号：559869）
32. CD105-PE（ Biolegend ，目录号：323205）
33. 小鼠 IgG2a，k 同种型-APC（ eBioscience ，目录号：17-4724-81）
34. 小鼠 IgG2a，k 同种型-PE（ Biolegend ，目录号：400212）
35. 细胞角蛋白 AE1/AE3（DAKO，目录号：M3515）
36. Melan-A（Abcam，目录号：EPR20380）
37. 波形蛋白（R&D Systems，目录号：MAB2105）
38. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma-Aldrich，目录号：MBD0015）
39. 胶原酶溶液（见食谱）
40. Mesencult完全培养基（见配方）
41. FACS 缓冲液（见配方）

设备

1. 移液器辅助装置（BRAND， accu -jet ® 亲)
2. 微量移液器（Eppendorf Research plus 、P20、P200、P1000）
3. 镊子（Dumont，5-Dumoxel ® -H）
4. 血细胞计数器（MARIENFELD，Neubauer，目录号：0640130）
5. 生物安全柜（ Thermo 科学TM , S2020 型 1.2)
6. CO 2培养箱（ Thermo 科学TM , Heracell TM 240i)
7. 离心机（热 Scientific TM , Heraeus Multifuge 1S-R)
8. 带照相机的相差倒置显微镜（蔡司，物镜 4 × , 10 × , 20 × ）
9. 冷冻机 -20 °C (利勃海尔)
10. 冰箱 2–8 °C（西门子）
11. FACS Aria II 分拣机（BD Biosciences）
12. 水浴（GFL ® ，目录号：1013）

软件

1. CapturePro 2.10.0.1（JENOPTIC 光学系统有限公司）
2. FACSDiva软件（BD Pharmingen，BD Biosciences）
3. FlowJo软件（树星）

程序

角膜缘的解剖和角膜缘簇的制备与之前公布的程序相似（ Polisetti 等。 , 2019)。

A. 边缘解剖
1. <2,200个细胞/mm 2 ）或供体中存在神经系统疾病或恶性肿瘤而不适合移植的器官培养角膜巩膜组织，从角膜库获得并获得适当的研究同意和道德认可。如果获得适当的研究同意，角膜内皮移植制备后的供体角膜残余物也是一个有价值的来源。
2. 将器官培养的角膜巩膜组织放入 60 mm 培养皿中，用 DPBS 洗涤两次。使用手术刀刀片和镊子将组织切成四个相等的四分之一（参见视频 1）。
注意：对于单次制备，使用 4 – 6 个角巩膜组织以获得足够的 LMSC 用于下游应用。本研究使用的器官培养的角膜巩膜组织是从平均年龄为69.8±10.7岁的供体获得的浅色供体角膜缘组织，培养时间为24.0±4.9天，死后时间为33.54±17.4小时。
3. 在解剖边缘前后 1 毫米处进行切口以获得边缘段（参见视频 1）。如视频所示，角膜缘部分进一步分为 2-3 个部分。

视频1. 边缘细胞分离

B. 角膜缘间充质基质细胞的分离
1. 用手术刀刀片将角膜缘段切成小块（ 2-3块）。在 37°C 下用 5% CO 2孵育过夜，以消化基质胶原蛋白并获得角膜缘细胞簇。
2. 孵化后, 使用 1 mL 移液器 (P1000) 将盘内的悬浮液进行上下运动, 并观察显微镜中是否存在细胞簇和单细胞 (图 2B)。细胞簇应该由角膜缘上皮细胞、基质细胞和黑素细胞小生境细胞组成（如图 1C 所示）。
在 37°C 和 5% CO 2的相同溶液中重新孵育额外 2小时以实现完全消化。相反，组织的过度消化（超过 20 小时）可能会对细胞活力和细胞质量产生不利影响。

图 2. 边缘簇细胞的分离。
A.将角膜巩膜边缘（左）切成扇形，每个扇形在角膜缘区域（右）前后修剪掉 1 mm。转载自波利塞蒂等。 (2019)，根据 CC BY 4.0 获得许可。 B. 角膜缘段在胶原酶溶液中过夜孵育后形成不同大小的角膜缘簇和单个细胞（左）（放大倍数 40）。 C.过滤后从单个细胞中分离出的边缘簇。 D.用胰蛋白酶-EDTA (x40 放大倍数) 消化角膜缘簇后角膜缘细胞的单细胞悬液。

3. 使用孔径为 20 μm 的细胞过滤器将角膜缘细胞簇与单个细胞分离，使单个细胞能够通过细胞过滤器并保留簇。用 DPBS 清洗过滤器两次，以去除任何剩余的单个细胞。反转过滤器并将其放在 60 毫米的盘子上。添加 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (5 mL) 以将簇 (图 2C) 冲洗到培养皿中，并在 37°C 下孵育 10 – 15 分钟，以将簇分离成单个细胞。
注意：代替 20 µm 细胞过滤器，可以使用37 µm可逆细胞过滤器。过滤后获得的单细胞悬液可以丢弃或用于其他目的，例如获得角膜缘成纤维细胞。
4. 孵育后，用 1 mL 移液器上下移动细胞悬浮液。在显微镜下观察细胞悬浮液（图 2D）。通过添加 5 mL含有 10% FBS的预热 DMEM （水浴中 37°C）来抑制胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移到 15 mL Falcon 管中，以 200 × g离心5 分钟。
在 37°C 和 5% CO 2的相同溶液中重新孵育额外 5分钟达到完全解离。相反，簇的长时间解离可能会对细胞活力和细胞质量产生不利影响。
5. 离心后，使用 P200 移液器在 200 μL 的 FACS 缓冲液中上下移液，重新悬浮细胞颗粒（参见配方 3）。

C. 荧光激活细胞分选 (FACS)
1. 将细胞悬液转移至 FACS 管（100 µL/管），在一个管中加入小鼠 APC 偶联的抗人 CD90 抗体（5 µL/10 6 个细胞），在 4°C 下将 IgG2a-Isotype APC 加入另一管.轻轻涡旋样品，在冰上孵育 45 分钟，每隔 15 分钟敲击一次。
注意：如果细胞数较多，即超过10 6 个细胞，则相应调整抗体的体积和浓度。
2. 孵育后，向每个 FACS 管中加入 1 mL FACS 缓冲液，并在 400 ℃下离心细胞 × 克 5分钟。重复洗涤两次。
3. 洗涤后，加入 500 µL 含有 DAPI (1:5000) 的 FACS 缓冲液，以排除死细胞，然后使用 FACS Aria II 分选机 ( Polisetti ) 进行流式分选等人，2022）。
4. 门控策略如下所示（图 3）。

图 3 。荧光激活细胞分选 (FACS) 图像展示了用于分离角膜缘间充质基质细胞的门控策略。
前向散射 (FSC-A) 与侧向散射 (SSC-A) 图显示了根据大小和粒度 ( i ) 选择的感兴趣的细胞。侧向散射面积与宽度图显示通过排除双峰或团块来选择单个细胞，(ii) 然后使用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 DAPI (iii) 排除死细胞。同型对照图显示了用于选择 CD90 +细胞 (iv) 的一组门 (iv)。阳性细胞的百分比 (%) 表示为平均值 ± SEM。

D. 角膜缘间充质基质细胞的扩增
1. 将排序后的 CD90 + LMSC 播种到 12 孔板的孔中。
注意：每个角膜缘的 CD90 +细胞数 (150 – 900) 因样品而异。 CD90 -群体主要包含 LEPC，可用于富集 LEPC，使用细胞类型特异性培养基 ( Polisetti et al., 2020)。
2. 在Mesencult完全培养基中用 5% CO 2在37°C 下培养 LMSC，以扩大 LMSC。每 2 天更换一次介质。
3. 通过相差显微镜可视化 LMSC 的形态。 LMSC 显示为具有突出核仁的纺锤形细长细胞（图 4）。

图 4。相衬图像显示在接种第 3、5 和 10 天后 [ × 40放大倍数（上排）； × 100 放大倍率（底行）]。

E. 角膜缘间充质基质细胞的传代培养
1. 以 70% 至 80% 的汇合度从培养容器中取出培养基。
2. 使用 DPBS 清洗细胞，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.25%；在 37°C 水浴中预热）。在 37°C 和 5% CO 2下孵育5 分钟。
3. 孵育后，加入 2 mL 含有 10% FBS 的 DMEM 以抑制胰蛋白酶作用，并充分混合。
4. 将细胞悬液转移至 15 mL 管中，以 200 × g离心5 分钟。在Mesencult培养基中重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数器计算总细胞数。
5. 使用细胞进行选择或传代培养。
注意：过度融合（超过 80%）和长时间的胰蛋白酶消化（超过 5 分钟）会对细胞活力和传代培养过程中的细胞质量产生不利影响。始终以 70% 到 80% 的汇合度通过细胞。避免在胰蛋白酶中长时间孵育。
6. 为了评估 LMSC 特征，已经测试了表型谱、集落形成效率、生长特征和分化潜力（图 5）。详细协议请参考已发表的文章（ Polisetti 等。 , 2022)。

数据分析

本协议中提供的条件已经过优化，可隔离和扩展 LMSC。有关 LMSC 分离和扩增的详细分析，请参见Polisetti 等。（2022 年）。

图 5. CD90 + (LMSC) 细胞的表型谱和功能表征。
(A) 流式细胞仪分析显示 CD 标记的表达。细胞百分比表示为四个单独实验的平均值±SEM。 (B) 显示群体倍增的图表 [ log 10 (y/x)/log10 2 ，其中 y 是细胞的最终密度，x 是细胞的初始播种密度] ，群体倍增时间[ (t - t 0 )log2/(logy – logx ) , 其中 t, t 0表示细胞计数的时间，y 等于 t 时间的细胞数，x 等于t 0时间的细胞数] ，生长速率[ln( N t /N o )/t，其中N t代表最终细胞数，N o代表初始细胞数，t 等于培养天数] ，以及 LMSC 在传代中的增殖潜力。数据表示为五个单独实验的平均值。 (C) 显示 LMSC 菌落 ( i )的相差显微照片，以及显示 LMSC (ii) 结晶紫染色菌落的 T75 烧瓶。该图表示 LMSC 在通道上的集落形成效率。菌落百分比表示为平均值 ± 标准偏差 (n = 5)。 (D) 免疫染色分析显示脂肪酸结合蛋白 4 (FABP4)、骨钙素和聚集蛋白聚糖分别在脂肪形成、成骨和软骨形成诱导细胞中的表达。在未分化 (UD) 对照中未观察到 FABP4 染色，但在 UD 对照中观察到骨钙素和聚集蛋白聚糖的染色较弱。使用 DAPI（蓝色）进行核复染。
转载自波利塞蒂等。 (2022)，根据 CC BY 4.0 获得许可。

食谱

1. 胶原酶溶液 (2 mg/mL)
试剂胶原酶 A
成分和制备 500 mg 胶原酶 A
220 毫升 DMEM 高葡萄糖
25 毫升胎牛血清
5毫升青霉素-链霉素
通过倒置充分混合
灭菌方法无菌过滤器 (0.2 µm)
备注准备 10 mL 等分试样
储存 -20°C

2. MesenCult培养基
培养基 MesenCult TM培养基完全
成分和制备 450 mL MesenCult TM MSC 基础培养基
50 mL MesenCult TM MSC 刺激补充剂
5毫升青霉素-链霉素
通过倒置充分混合
灭菌方法无
备注如果需要，准备等分试样
在 2 –8°C 下储存1 个月

3. FACS 缓冲液（DPBS 中的 2% FBS 和 0.5mM EDTA）
和制备 1 mL FBS
25 µL 0.5 M EDTA
24 毫升 DPBS
通过倒置充分混合
灭菌方法无
注意事项始终使用新鲜的

致谢

该协议改编自以前的工作（ Polisetti 等。 , 2022)。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

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