材料和试剂

1.Snap-Cap 14 mL 培养管（Falcon，目录号： 352059)
2.无菌接种环（ Fisherbrand ，目录号：22-363-605）
3.移液器吸头 200 µL、1,000 µL（USA Scientific TipOne ，目录号：1111-0006、1126-7810）
4.具有0.400（27G）针头的胰岛素注射器（BD，目录号：329412）
5.10 cm 培养皿，每个测试组一个（Falcon，目录号：351029）
6.丁腈手套（Halyard，目录号：55082）
7.1.5 mL Eppendorf管（ SealRite ，目录号：1615-5500）
8.Galleria mellonella larvae ( https://www.waxworms.net/ , Vanderhorst Wholesale, St. Marys , Ohio, USA)
9.新型密球菌 H99株（血清型A ）
10.1 × DPBS（Gibco，目录号：14190-144）
11.BD Bacto蛋白胨（Gibco，目录号：211677）
12.BD Bacto酵母提取物（Gibco，目录号：212750）
13.Difco YPD Broth（Gibco，目录号：242820）
14.小型聚苯乙烯称重船（Heathrow Scientific，目录号：HS1420A）
15.葡萄糖（Sigma，目录号：1002789701）
16.YPD 液体培养基（见配方）

设备

1.血细胞计数器（ Hausser Scientific，目录号：3520）
2.移液器 2–20 µL、20–200 µL、100–1,000 µL
3.带培养管旋转器的微生物培养箱
4.显微镜（奥林巴斯，型号：BX40）
5.高压釜
6.注射器步进器（ Dymax STEPPER 重复移液器，型号：4001-010）
7.台式离心机（ Spectrafuge 24D）

软件

1.GraphPad Prism 软件 ( https://www.graphpad.com/ )

程序

选择具有理想质量的幼虫
1.选择并分离G. mellonella幼虫并准备培养皿，每个测试组一个。始终戴着丁腈手套处理幼虫，以降低污染风险。
2.使用数字秤选择体重在 100 到 200 毫克之间的幼虫。幼虫在被转移到培养皿中之前在小型聚苯乙烯称重船上单独称重，每个培养皿中最多有 15 只幼虫。
注意：幼虫的触感应该相对牢固，并且不会出现疾病迹象，例如全身黑色素化或运动减少（图 1A）。健康幼虫的角质层色素沉着存在正常变异性。理想情况下，幼虫将在感染前至少 16-24 小时进行分类，以便在到达后在室温下适应环境。

图 1. 对G. mellonella适应性的评估。
(A) 幼虫中隐球菌感染的进展导致变色和死亡。 (B) 受感染的幼虫转变为蛹和隐球菌感染的进展导致死亡。 (C) 完成蛹的发育和变态成蛾，这通常发生在所述实验实验室条件下的第 14 天或之后。

真菌细胞接种物的制备
3.在感染前大约 48 小时，在 14 mL Snap-Cap 培养管中接种 5 mL 的 YPD 培养基和所需的新型隐球菌菌株，并在 30 °C、35 rpm的细胞培养转子上孵育。或者， C. neoformans可以在 30 °C、35 rpm的 1 mL YPD 介质中过夜（16-24 小时）生长。
4.将 1 mL 的固定相培养物转移到 1.5 mL Eppendorf 管和颗粒真菌菌株，方法是在台式离心机中以 2，500 × g离心管 4 分钟。
5.通过丢弃上清液并每次将颗粒重新悬浮在 1 mL 的无菌 DPBS 中，用 DPBS 清洗您的样品两次。
6.准备 1:100 细胞稀释并使用血细胞计数器建立细胞浓度。
7.根据该协议，将细胞稀释至该浓度将导致每只幼虫注射10 5 个细胞；如果需要不同的接种物，请适当调整细胞稀释度。要准备为每只幼虫注射 10 5 个细胞的样品，请用 DPBS 将洗过的细胞稀释至 10 7 个细胞/ mL 的浓度。

幼虫感染
8.在实验前校准步进设备并设置为分配 10 μL 的液体，除非需要或需要另一个体积。
9.将接种物吸入 1 mL 结核菌素注射器。
10.倒置并轻弹注射器，直到气泡上升到顶部并且可以排出空气，只留下准备好的接种物。
11.将注射器装入步进装置，确保注射器牢固就位，注射器的柱塞靠在步进器的推杆上，注射器的柄部靠在注射器夹上，以防止滑动和接种物分配不准确。
12.按下分配按钮时，测试步进器是否准确分配接种物。
13.用非惯用手拿起预先分类的G. mellonella幼虫。用拇指和食指牢牢握住幼虫以防止移动。手指应朝向头部和胸部，以保持腹部打开。小心不要用注射器针头粘住手指。
14.将针头注入最后一个左前腿（图 2）。
重要的是要与注射的 proleg 保持一致，以减少感染的变异性。针头应该通过幼虫进入中途。
15.小心地从针中取出幼虫并将其放入培养皿中。
如果过多的血淋巴（如黄色液体所示）从注射部位泄漏，可能会导致幼虫死亡。如果血淋巴泄漏问题持续存在，将针头留在幼虫中 15 秒，然后再移除可能会减少血淋巴丢失量。如果担心注射后培养皿上的血淋巴干了，可以通过暂时去除幼虫、用 70% 乙醇擦拭培养皿并用纸巾擦干来清洁血淋巴。

图 2. 幼虫感染。
(A) G. mellonella幼虫模型的图示，带有主要解剖部位的指示。 (B) 照片说明了将新生隐球菌细胞悬液注射到幼虫前肢底部的位置。 (C) 注射部位的特写照片。

受试幼虫的孵化和维护
16.完成一系列注射后，将带幼虫的培养皿转移到分析所需温度（室温或 30 °C ）的位置。
17.每天通过检查每个幼虫的颜色变化并使用移液器尖端的尖端轻轻戳幼虫来评估幼虫的变异性。
如果还测定了蛹的存活率，请用移液器尖端的底部轻轻按下蛹来检查蛹的存活率。戳戳后没有运动表明死亡。已故G. mellonella幼虫的体色变化从最初的奶油色变为灰色、棕色和黑色（图 1A）。健康的蛹从白色和黄色开始，自然变成浅棕色至中等棕色，而死蛹则呈深棕色至黑色（图 1B）。

数据分析

要分析和可视化G. mellonella的差异，请使用生存表格式将数据上传到 Prism GraphPad 软件中。将数据绘制为与时间（天）相关的生存百分比。图 3A 和 3B 中显示了如何收集生存数据以及应如何以 Prism GraphPad 格式格式化表格的示例，其中 0 表示已审查事件，无法再读取生物的生存数据（即，有机体存活到实验终点或丢失），1 表示有机体死亡，空白单元格表示没有事件发生（没有幼虫死亡）。每个事件（死亡或审查）都需要换行。 Prism GraphPad 上此数据的示例输出如图 3C 所示。

图 3. 生存数据的格式和图表示例。
(A) G. mellonella的生存数据每天收集并记录为每种情况下发生的死亡人数。 (B) 将生存数据转换为 Prism GraphPad 所需的格式时，记录每个事件，每行仅记录一个事件。死亡事件记录为 1，而审查事件，无论是由于实验结束时的存活还是由于动物的死亡，都被标记为 0。在 (B) 中的对照数据中，有第 3 天和第 12 天有两个死亡事件，第 14 天有 13 个删失事件；这表明 2 只幼虫死亡，而 13 只存活到实验结束。 (A, B) 中的示例数据使用 Prism GraphPad 绘制在 (C) 中。

测试组之间的统计差异可以通过对数秩（Kaplan-Meier）检验进行比较。 P 值 <0.05 表示数据集之间存在显着差异。计算的风险比也可用于比较条件之间的毒力。

替代方案：37 °C 下的毒力测定
G. mellonella幼虫隐球菌感染的发展可以随着周围温度的变化而改变。在 37 °C 下孵化受感染的幼虫有助于模拟人体温度并缩短实验时间，但同时刺激G. mellonella的变态。

选择具有理想质量的幼虫
1.选择并分离G. mellonella幼虫并准备培养皿，每个测试组一个。使用数字秤，选择体重在 175 到 300 毫克之间的较大幼虫。
2.在转移到培养皿之前，使用用 70% 乙醇浸泡的无菌组织清洁幼虫的前肢区域，从而消除污染的可能性。

真菌细胞接种物的制备
3.在感染前大约 48 小时，用所需的新型隐球菌菌株接种 5 mL 的 YPD 培养基，并在 30 °C的细胞培养转子上孵育。
4.× g的速度将48 小时的新隐球菌培养4 分钟，丢弃上清液并提供等量 (5 mL) 的 YPD 培养基，再培养 2–4 小时。
如果需要，此步骤允许对处于对数生长阶段的细胞进行感染。如果没有，请在不进行此额外孵育的情况下继续执行后续步骤。与静止阶段相比，不同的微生物成分，包括毒力因子，在对数生长阶段表示。以对数增长进行真菌感染将使研究人员能够研究与这些因素如何影响毒力特别相关的问题。
5.在台式离心机中以 2，500 × g的速度将管离心 4 分钟，从而沉淀测试过的真菌菌株。
6.用 DPBS 清洗样品两次，准备 1:100 的细胞稀释液，并使用血细胞计数器确定细胞浓度。
7.用 DPBS 将洗涤过的细胞稀释至 10 7 个细胞/ mL 的浓度。

幼虫感染
按照基本协议的步骤：幼虫感染。

受试幼虫的孵化和维护
8.完成一系列注射后，将带幼虫的培养皿转移到 37 °C培养箱中，每天通过检查每个幼虫的颜色变化或使用移液器尖端的尖端轻轻戳幼虫来评估幼虫的变异性。

数据分析
按照基本协议的步骤：数据分析。

食谱

1.酵母蛋白胨葡萄糖 (YPD) 液体培养基
1,000 mL 蒸馏水 H 2 O
20 克 BD Bacto蛋白胨
10 克 BD Bacto酵母提取物
20 克葡萄糖（Sigma，1002789701）
或者
1,000 毫升 dH 2 O
50 克 Difco YPD 肉汤
要制备 YPD 液体介质，请使用磁力搅拌棒将所有成分混合在 2 L 锥形瓶中。将混合物转移到玻璃瓶中并高压灭菌 20 分钟。

笔记

时的一个主要考虑因素是其生物学变异性，这将取决于幼虫的来源或饲养方案。迄今为止，没有广泛可用的近交同基因G. mellonella菌株作为野生型。这为遗传变异打开了模型，从而打开了幼虫和幼虫来源之间的免疫变异性。由于饲养过程中的饮食差异，还会出现额外的显着差异。因此，对不同批次/世代的幼虫进行足够的复制非常重要。在测量蛹的存活率时，一致性也很重要。在成蛾出现之前，蛹也会停止对刺激作出反应。这将在不同的时间后发生，具体取决于环境温度，但通常发生在 30 °C的第 10-14 天之间。虽然这些蛹对刺激没有反应，但它们的颜色通常比死蛹更浅，被戳时会有一种轻盈柔软的“干燥”感觉。理想情况下，实验将在这个时间点完成。成年飞蛾在出现时被作为数据点进行审查，并且飞蛾的存活率没有被记录。

关键参数和故障排除
为了确保在G. mellonella存活试验中获得的数据质量正确，重要的是包括一个用 DPBS 接种的幼虫的阴性对照组，以及一个具有明确毒性隐球菌菌株（H99 或 KN99）的阳性对照。阴性对照组的高死亡率表明注射程序存在问题或使用过的幼虫存活率低，这可能由于各种原因而发生。对于注射实践，可使用水中的食用色素或 DPBS 来确保注射剂进入体腔，这由生物体范围的颜色表示。虽然在定义G. mellonella幼虫或蛹之间可能存在研究人员之间的差异无论是活的还是死的，重要的是生存的阈值和确定在日常和重复之间保持一致。通过确保一名（或尽可能少的）研究人员记录所有生存测量，可以提高一致性。
为了尽量减少意外针刺伤害的风险，请牢牢抓住幼虫，避免重新盖上针头，并将所有用过的带针头的注射器放入适当的生物危害锐器容器中。如果发生针刺伤，请清洗该区域，按照您的研究机构制定的程序，通知您机构的相应紧急健康诊所，并寻求医生的专业知识（Casadevall等，1994）。
利用G. mellonella作为模型生物来研究新隐球菌的毒力，可以对不同的临床、环境或突变菌株进行相对快速的评估。这种测定的结果通常可以在不到两周的时间内获得。通常，幼虫在感染新隐球菌后不到一周内就开始迅速死亡。提高培养温度和真菌细胞的初始接种量可以缩短实验的总时间。

致谢

协议改编自 Reeves等人。 (2004),米洛纳基斯等。 (2005), 加西亚-罗达斯等。（2011）和史密斯等人。（2021 年）。数字是使用 BioRender.com 制作的。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

伦理

由于其作为无脊椎动物的状态，目前没有关于在实验室环境中使用mellonella的伦理限制或法规。 G. mellonella通过在 -20 °C下冷冻至少 1 小时进行安乐死。

参考

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