材料和试剂

1. 组织培养板、烧瓶和试管
a. 24孔细胞组织培养板（Corning，目录号：3524）
b. T25细胞培养瓶（ Thermo Fisher，目录号：156367）
c. T75细胞培养瓶（ Thermo Fisher，目录号：156499）
d. 15 mL离心管（Corning，目录号：352095）
e. 50 mL离心管（Corning，目录号：430829）
2. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-031-CM）
3. RPMI 1640 培养基（Gibco，目录号：11875085）
4. 牛小牛血清（Sigma，目录号：12306C-500ml）
5. 青霉素/链霉素（ Thermo Fisher，目录号：10378016）
6. L-谷氨酰胺（ Thermo Fisher，目录号： A2916801）
7. 重组人白细胞介素-2（IL2）（R&D System，目录号：202-IL-050）
8. APC 抗人 TCR α/β 抗体（ Biolegend ，目录号：306718）
9. Dynabeads TM CD3（ Thermo Fisher，目录号：11151D）
10. TrueCut TM Cas9 蛋白 v2（Invitrogen，目录号：A36497）
11. EasySet磁铁（ Thermo Fisher，目录号：NC9284020）
12. DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，目录号：69504）
13. Q5热启动高保真DNA聚合酶试剂盒（ BioLabs ，目录号：E0555S）
14. 台盼蓝溶液，0.4%（ Thermo Fisher，目录号：15250061）
15. QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，目录号：28106）
16. 4D-Nucleofector TM X 套件（Lonza，目录号：V4XC-2032）
17. 细胞培养基（见配方）
18. 细胞洗涤缓冲液（参见配方）
19. gRNA（见食谱）

设备

1. 4D-Nucleofector TM X 单元（Lonza，目录号：AAF-1002X ）
2. 流式细胞仪LSRFortessa （BD Biosciences，目录号：647800L6）
3. Eppendorf TM 5424 微量离心机（Fisher，目录号：05-400-005）
4. 细胞培养罩HeraSafe KS（ Thermo Fisher，目录号：10110910）
5. CO2 培养箱HeraCell VIOS 160i（ Thermo Fisher，目录号：15381075）
6. VeritiPro TM 96孔热循环仪（Applied Biosystems，目录号：A47394）

软件

1. Genewiz ( Azenta Life Sciences, https://www.genewiz.com/en )
2. ICE 分析（ Synthego ， https ://ice.synthego.com/#/ ）
3. CRISPOR（特福， http : //crispor.tefor.net/ ）
4. FlowJo （树星公司，10.1 版）
5. 适用于 macOS V.9.3.1(350) 的 Prism 9 ( https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ )
6. BioRender ( https://biorender.com/ )

程序

整个实验程序的一般工作流程可以在图 1 中找到。

图 1. 整个实验程序的一般工作流程。
CRISPR/Cas9 介导的基因敲除和 CD3 阴性选择导致原位 CAR19 T 细胞中的 TCR 完全耗尽。

A. 人原位CAR19 T细胞的制备
1. 原代人总 T 细胞购自宾夕法尼亚大学免疫学核心。
2. 在 RPMI 1640 中计数细胞并调整到 1 × 10 6细胞/mL，辅以 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100-U/mL 青霉素、100-g/mL 硫酸链霉素和 10-mM HEPES。使用台盼蓝溶液（0.4%， Thermo Fisher）作为染料排除测试的细胞染色剂评估细胞活力。
3. 用 PBS 清洗涂有抗 CD3/抗 CD28 的磁珠 3 次，用细胞培养基清洗一次。
4. 以 1:3 的比例将 T 细胞与洗过的珠子混合 16-24小时。
5. 如我们之前的工作 (Zhang et al ., 2021)所述，用编码邻位CAR19的病毒颗粒转导激活的 T 细胞。简而言之，CD19BBz 和邻-hIL-2R β 序列被克隆到 p-TRPE 慢病毒骨架中，与CD19BBz、邻-hIL-2R β -T2A-mCherry 和 CD19-邻-hIL-2R β的限制性位点XbaI和 Sa1I 框内。用上述转移质粒和三种慢病毒包装质粒pCI VSV-G、 pRSV Rev 和pMDL gag/ pol.RRE ( Addgene ) 的组合转染 HEK293T 细胞产生慢病毒。
6. 用 100 IU/mL 人重组 IL2 培养细胞，每天喂它们三天，为 CRISPR/Cas9 介导的 TCR KO 做准备。

B. CRISPR-Cas9 复合物的制备
1. TCRα 和 TCRβ gRNA 序列（TRAC gRNA 序列：TGTGCTAGACATGAGGTCTA；TRBC gRNA 序列：GGAGAATGACGAGTGGACCC）是使用 CRISPOR 设计的，这是一个帮助设计、评估和克隆 CRISPR/Cas9 系统的指导序列的在线程序。关于潜在 gRNA 候选者的主要考虑因素是寻找能够 (1) 有效地敲除靠近 ATG（翻译起始位点）的基因以最大程度地丧失功能，或在功能域位置破坏目标功能的 gRNA； (2) 没有或很少有脱靶基因。
The single human genomic sequence used in the TRAC and TRBC gRNA design was CTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGG CGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGGGGCGACCTCGGCTCACAGCGCGCCCGGCTATTCTCGCAGCTCACCATGGATGATGATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAACGGCTCCGGCATGTGCAAGGCCGGCTTCGCGGGCGACGATGCCCCCCGGGCCGTCTTCCCCTCCATCGTGGGGCGCC, with a protospacer adjacent motif (PAM) sequence of 20bp-NGG-Sp Cas9, SpCas9-HF1, eSpCas9 1.1.
2. 将 TCRα 和 TCRβ gRNA（安捷伦）以 10 μ g / μ L溶解在 1 × TE 缓冲液 (IDT) 中，并以等摩尔浓度将它们混合在一起。
3. 1 μ L的 gRNA 混合物（包括 5 μ g TCR α 和 5 μ g TCR β）与 2 μ L (5 μ g / μ L ) 的 Cas9 (Invitrogen) 混合。
4. 通过轻轻上下吹打两次来混合 gRNAs-Cas9 复杂混合物；避免在管中产生气泡。
5. 在室温（RT：15–25 °C）下孵育复杂混合物 10 分钟。

C. 制备用于电穿孔的 T 细胞悬液
1. 对于每种电穿孔条件（包括阳性和阴性对照），制备 5 mL 的细胞扩增培养基，辅以 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100-U/mL 青霉素、100-g/mL 硫酸链霉素、10-mM HEPES和 100U IL2。
2. 对于每种情况，将 2 mL 补充培养基（在程序 A 中制备）添加到 12 孔板（用于 100- μL尖端反应），并置于 37°C 培养箱中。
3. 将 1.5 × 10 6 个细胞（用于 100 -μL 比色皿反应）从原CAR19 T 细胞转移到 15-mL 管中。以 300 × g和 RT离心5 分钟。

D. 使用 Lonza 4D 系统对具有 gRNA-Cas9 复合物的 T 细胞进行电穿孔
图 2 演示了如何使用 Lonza 4D 系统进行电穿孔。

图 2. 演示如何使用 Lonza 4D 系统进行电穿孔。

1. 从细胞沉淀中吸出上清液（在程序 C 中制备）。用 4D- Nucleofector X Kit中的 100 μL P3 缓冲液重悬细胞，上下移液器混合。
2. 使用无菌 200 - μL PCR 管，将 gRNA-Cas9 复合物混合物（在程序 B 中制备）与 P3 缓冲液中的细胞混合。
3. 小心上下吹打两次，轻轻混合；避免在管中产生气泡。
4. 将含有 gRNA-Cas9 复合物混合物的细胞从 4D-Nucleofector X 试剂盒转移到比色皿中，确保没有气泡。将试管放入电穿孔室。
5. 使用“人类刺激 T 细胞”预设程序和 EH-115 脉冲代码对细胞混合物进行电穿孔。

E. 淘汰赛后文化
1. 立即将培养基添加到含有电穿孔细胞的试管中，并在 37°C 下孵育 15 分钟。
2. 通过添加补充了 IL2 的细胞培养基对细胞进行计数，并将细胞密度调整为 0.8 × 10 6 个细胞/mL。
3. 在 37°C 下孵育 72 小时，以进行基因组编辑。
4. 收获细胞以评估基因组编辑效率。使用位于目标区域两侧的引物分离和扩增基因组 DNA。对 PCR 产物进行测序。
使用的 PCR 试剂盒：Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase Kit
5. 使用 APC 人抗 TCRα/β 收集细胞并通过流式细胞术检查 TCR 蛋白表达。

F. CD3 阴性 T 细胞的分离
1. 使用Dynabeads CD3 ( Thermo Fisher Scientific)进行 CD3 +细胞的阴性选择。
2. 洗珠子
a. 重新悬浮小瓶中的珠子。
b. 将所需体积的珠子转移到 5 mL 管中。
c. 添加相同体积的隔离缓冲液（PBS 补充 0.1% BSA）。
d. 将试管置于磁铁中 1分钟，弃去上清液。
e. 从磁铁中取出试管，将洗涤过的珠子重新悬浮在与珠子初始体积相同体积的隔离缓冲液中。
3. 准备细胞
a. 在隔离缓冲液中将TCR KO T 细胞制备为 1 × 10 7 个细胞/mL。
b. 将 1 mL 的细胞 (1 × 10 7 ) 转移到试管中，并加入 25 μL 的预洗和重新悬浮的珠子。
c. 在 2–8 °C 下轻轻倾斜和旋转孵育 30 分钟（耗尽）。
d. 将试管置于Dynabeads TM磁架中 2 分钟。
4. 将上清液转移到新管中以供进一步使用，并丢弃珠子。

G. 流式细胞仪
1. 用 PBS 清洗 CD3 阴性 T 细胞两次，用 APC 抗人 TCRα/β 抗体（1:50， Biolegend ）染色 30 分钟，然后用 PBS 清洗两次。
2. 使用 BD LSRFortessa流式细胞仪量化 CD3 阴性 T 细胞。
3. FlowJo软件（Tree Star Inc.，版本 10.1）对 T 细胞 CD3 表达进行分析。

数据分析

在进行 TCR KO 之前，通过流式细胞术确认了 CAR19 和正交 IL-2Rβ 的表达（图 3）。使用FlowJo软件分析流式细胞仪数据。为了直接估计基因组编辑引入的突变的效率和类型，从编辑和未编辑的 T 细胞中提取基因组 DNA。使用引导 RNA 周围的引物进行 PCR 反应，PCR 产物在 1.0% 凝胶中可视化（图4 ），并纯化用于标准 Sanger 测序（ Genewiz ）。一旦完成 DNA 的 Sanger 测序，使用ICE 分析序列轨迹（图5 和 6A-D）。为了完全耗尽未经编辑的 TCR 阳性细胞，使用CD3 Dynabeads TM进行 CD3 阴性选择。 TCRα / β的纯度通过流式细胞术评估耗竭（图6E）；本研究中使用的流式细胞术门控策略的演示可以在视频 1 中找到。

邻-IL2Rβ 表达的FACS 分析。

图4. PCR 产物分析的琼脂糖凝胶电泳结果。
（一）TCRα。 (B) TCRβ。泳道 1：对照（不含 TCR gRNA）泳道 2：TCR KO + CD3 阴性选择。

视频 1. 流式细胞术门控策略的演示，用于确认 TCR 完全耗尽。

图 5. PCR 产物的纯化和测序，使用Synthego对 TCRα/β 敲除的基因组编辑进行定量评估 CRISPR 编辑的推断( I CE)。

图 6. 在基因编辑后的第 4 天，使用 ICE 和流式细胞术评估 TCRα/β 耗尽的 TCRα/β KO 的测序结果，然后进行 CD3 阴性选择。
成功分析了 TCRα 和 TCRβ KO 样本，显示了多个参数，包括样本标签、ICE 分数、R 2分数、敲除分数、引导序列和 PAM 序列。（A-B）“贡献”选项卡显示了已编辑群体中存在的 TCRα（A）和 TCRβ（B）的推断序列，以及它们在编辑池中的相对表示。黑色垂直虚线表示切割部位。 (C-D) TCRα KO与TCRα 野生型 (WT) (C) 和 TCRβ KO与TCRβ WT (D) 的测序色谱图。 (E) FACS 分析用于确认 CD3 阴性选择后 TCRα/β 完全耗尽。

食谱

1. 细胞培养基
RPMI 补充有 10% 热灭活 FBS、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES、1% 青霉素和链霉素。
2. 细胞洗涤缓冲液
添加 2% BSA 的 PBS
3. μ g / μ L重悬于 TE 缓冲液中的 gRNA

致谢

我们感谢宾夕法尼亚大学以下设施的成员：用于细胞分选的流式细胞仪核心，用于提供来自正常供体的 T 细胞的人类免疫学核心。
这项工作源自张等人先前发表的论文。 (2021)，在Sci Transl Med 13(625)中称为“人类正交 IL-2 和 IL-2Rβ 系统增强 CAR T 细胞扩增和抗肿瘤活性在小鼠白血病模型中的活性” 。

利益争夺

作者没有要披露的财务和/或非财务竞争利益。

伦理

根据大学机构审查委员会批准的协议收集 T 细胞，并从每个健康供体获得书面知情同意书。

参考

1. Berns , K., Hijmans , EM, Mulenders , J., Brummelkamp , TR, Velds , A., Heimerikx , M., Kerkhoven , RM, Madiredjo , M., Nijkamp, W., Weigelt , B.等。（2004 年）。人类细胞中的大规模 RNAi 筛选可识别 p53 途径的新成分。自然428：431-437。
2. Conant, D., Hsiau , T., Rossi, N., Oki, J., Maures , T., Waite, K., Yang, J., Joshi, S., Kelso, R., Holden, K.,等人。（2022 年）。从 Sanger Trace 数据推断 CRISPR 编辑。 CRISPR J 5（1）：123-130。
3. 崔，Z.，刘，H.，张，H.，黄，Z.，田，R.，李，L.，范，W.，陈，Y.，陈，L.，张，S.，等。（2021 年）。通过 GUIDE-seq 比较 ZFNs、TALENs 和 SpCas9 在 HPV 靶向基因治疗中的作用。 Mol Ther Nucleic Acids ，26：1466-1478。
4. Gaj ，T.， Sirk ，SJ，Shui，SI。和 Liu, J. (2016)。基因组编辑技术：原理和应用。冷泉港_ 透视生物学8（12）：a023754。
5. Jackson, AL, Burchard, J., Schelter , J., Chau, BN, Cleary, M., Lim, L. 和Linsley , PS (2006)。由种子区域序列互补性介导的广泛的 siRNA“脱靶”转录物沉默。 RNA 12（7）：1179-1187。
6. 汗，SH（2019）。基因组编辑技术：各种基因组编辑技术的概念、优点和缺点以及临床应用的生物伦理问题。 Mol Ther Nucleic Acids ，16：326-334。
7. 奥基夫，EP（2013 年）。 siRNA 和 shRNA：通过基因沉默进行蛋白质敲除的工具。材料方法3：197。
8. Seki, A. 和Rutz , S. (2018)。针对原代 T 细胞中高效 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除优化的 RNP 转染。 J Exp Med 215（3）：985-997。
9. Zhang, Q., Hresko , ME, Picton , LK, Su , L., Hollander, MJ, Nunez-Cruz, S., Zhang, Z., Assenmacher , CA, Sockolosky , JT, Garcia, KC,等。（2021 年）。人正交 IL-2 和 IL-2Rβ 系统在白血病小鼠模型中增强 CAR T 细胞扩增和抗肿瘤活性。 Sci Transl Med 13（625）：eabg6986。