材料和试剂
1. 1.5 mL微量离心管（ Biosharp ，目录号：BS-15-M）
2. 50 mL 微型生物反应器管（NEST，目录号：602052）
3. 9 cm Petri dish （ Sangon Biotech，目录号：F611001）
4. 1毫升注射器
5. 显微镜载玻片，76 ×26 mm（ Sangon Biotech，目录号： F518101）
6. 盖玻片，24 ×60 mm（ Sangon Biotech，目录号： F518118）
7. 记号笔
8. 单刃剃须刀片
9. 铝箔
10. 4 周龄本氏烟草幼苗
11. 7天大的拟南芥幼苗
12. 根癌农杆菌菌株 GV3101
13. 大肠杆菌DH5α感受态细胞（自制）
14. LB（ Sangon Biotech，目录号：A507002）
15. 蔗糖（ Sangon Biotech，目录号：A610498）
16. MgSO 4 （ Sangon Biotech，目录号：A601988）
17. 琼脂（ Sangon Biotech，目录号：A505255）
18. MES（ Sangon Biotech，目录号：A610341）
19. 0.5 M EDTA溶液，pH 8.0（ Sangon Biotech，目录号：B540625）
20. 丁香酮（ Sangon Biotech，目录号：A601111）
21. 二甲基亚砜（DMSO）（ Sangon Biotech，目录号： A100231）
22. MS基础盐混合物（Caisson，目录号： 05210003）
23. 康卡那霉素A（Adipogen ，目录号：BVT-0237-C100）
24. 植物RNAout试剂盒（ Tiandz Inc.，目录号： 160906-50）
25. HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR Kit（ Vazyme Biotech Co.，Ltd，目录号： R222-01）
26. HiPure Gel DNA Mini Kit (Magen, catalog number: D2111-03)
27. ClonExpress ® II 一步克隆试剂盒（ Vazyme Biotech Co.，Ltd，目录号：C112-01 ）
28. pEGAD载体（NCBI 登录号 AF218816）
29. 快速文摘生态RI -HF （NEB，目录号：R3101M）
30. 快速文摘 Bam HI -HF（NEB，目录号：R3136M）
31. 抗生素（均购自Sangon Biotech ；硫酸卡那霉素，目录号： A506636利福平，目录号： A600812；硫酸庆大霉素，目录号： A506614）
32. 液氮
33. 细菌悬浮缓冲液（见配方）
34. ConA stock solution (0.5 mM) (see Recipes)
35. MS-C liquid medium (see Recipes)

设备

1. 离心机(Eppendorf, model: 5804 R)
2. 水浴
3. Eppendorf Research® plus移液器（0.5 –10 μL 移液器，目录号：3120000020；10 –100 μL 移液器，目录号：3120000046；100 –1,000 μL 移液器，目录号：3120000062）
4. Nanodrop分光光度计（ NanoDrop ，型号：ND-1000）
5. 孵化器
6. 流动罩
7. Plant growth chamber (Ningbo Jiangnan Instrument Factory, model: RXZ-500C)
8. pH计（赛多利斯，型号：PB-10）
9. 热循环仪（B io -Rad，型号：S1000）
10. 高压釜（HIRAYAMA，型号：HVE-50）
11. 涡旋器（麒麟-贝尔，型号：VORTEX-5）

程序

A. Vector construction
1. 拟南芥的 PCR 扩增 AtATG8a (AT4G21980)基因：使用 Plant RNAout试剂盒 ( Tiandz Inc.,160906-50)从 7 日龄幼苗中分离总 RNA ，然后使用HiScript ® II Q RT SuperMix将 1 μg总 RNA 转化为 cDNA用于qPCR带有 oligo(dT)20 的试剂盒（ Vazyme Biotech Co., Ltd, R222-01）。使用正向引物 5'- CTGCGGCAGCGGCCGAATTC ATGGCTAAGAGTTCCTTCAA -3' 和反向引物 5'- ATCTAGATCCGGTGGATCCA TCCAAAAGTGTTCTCTCCAC-3'（40 个 95 循环）扩增AtATG8a基因 °C 15 秒，55 °C 15 秒，72 °C 30 秒）。
Note:PCR 引物应设计为包含至少 20 bp 的重叠序列（下划线）以进行线性化克隆 pEGAD载体（see 图 1A）。
2. 将AtATG8a基因克隆到pEGAD载体中：用限制酶Eco RI和Bam HI在 37 处线性化pEGAD载体（NCBI 登录号 AF218816） ℃ 4 小时，然后使用HiPure Gel DNA Mini Kit (Magen, D2111-03) 进行纯化。按照制造商的说明 ( Vazyme Biotech Co., C112-01)，使用ClonExpress® II One-Step Cloning Kit组装线性化pEGAD载体和扩增的AtATG8a片段。使用类似的方法（图 1C）构建包含感兴趣的蛋白质（POI、 pEGAD - POI- mCherry ）的载体。
注意：对于每个 POI，应设计两种结构，一种在 N 端含有荧光蛋白，另一种在 C 端。在Tanz等人中可以找到一些在植物中产生荧光融合蛋白的一般指南。（2013）。
3. 大肠杆菌转化：取上述反应液 10 μL 与 100 μL 大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上孵育 30 min。在 37 中加热细胞 °C 水浴 90 秒，在冰上孵育 1 –2 分钟。将 700 μL 的LB 添加到细胞中，并在 37°C、200 rpm 下摇动 1 小时以进行恢复。 5,000 rpm 离心 3 分钟，然后弃去 600 μL 上清液并将沉淀重悬于剩余的上清液中。铺在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 板上，在 37 下孵育 12-14 小时摄氏度。进行菌落 PCR 以识别阳性克隆并通过 Sanger 测序进行验证带引物：5'-AATCATCGCAAGACCGGCAACAGGAT-3'。
4. 农杆菌转化：将 1 µg 经验证的质粒与 200 µ L GV3101 感受态细胞混合，在冰上孵育 30 分钟。用液氮冷冻细胞 1 –2 分钟，然后在 37°C 水浴中孵育 2 分钟解冻。将 1 mL 的 LB 添加到细胞中，并在 28°C、200 rpm 下摇动 4 小时以进行恢复。以 7,000 rpm 的转速离心 1 分钟，弃去 1 mL 的上清液，并将颗粒重新悬浮在剩余的上清液中。将细胞铺在含有适当抗生素的 LB 板上，并在 28 下孵育 °C 2 天以形成菌落。

本氏烟草叶片ATG8共定位试验中使用的载体结构示意图。
(A) 使用一步克隆法构建 pEGAD-GFP-ATG8a 载体。 (B) 和 (C) 分别是 pEGAD-GFP-ATG8a 和pEGAD -POI- mCherry载体的示意图。图中标出了启动子、终止子和开放阅读框。 35S：花椰菜花叶病毒35S启动子； BlpR ：巴斯塔抗性基因； IS1：插入序列； KanR ：卡那霉素抗性基因； LB：左边框； NOS：NOS终结者； oriV ：复制起点； POI，感兴趣的蛋白质。 RB：右边框； TetR ：四环素抗性元件的阻遏物； trfA ：复制起始蛋白；轨迹： F 质粒转移 ( tra ) 操纵子的正调节子。

B. Agrobacterium-mediated transient gene expression in tobacco leaf
1. 拾取单个A. tumefaciens菌落，并接种到 15 mL 的 LB 液体培养基中，其中含有适当的抗生素（50 μg /mL 卡那霉素、50 μg /mL 利福平、10 μg /mL 庆大霉素）在 50 mL 迷你中生物反应器管。以 200 转/分摇动，28 °C 16-24 小时，直到 OD 600 = 0.8 –1.5。
2. 以 6,000 rpm 的速度离心收集细胞， 4 °C，10 分钟。用新鲜的悬浮缓冲液（见配方）将细胞重新悬浮到 OD 600 = 1.2 的最终浓度，并在渗透前保持在 25°C 超过 4 小时（图 2A）。
注意：作为一种常见的做法，乙酰丁香酮被添加到细菌培养物中以激活农杆菌的毒力。最佳的乙酰丁香酮(150 µM) 处理通常需要至少 4 小时。
3. 混合等体积的含有 pEGAD-GFP-ATG8a 和pEGAD - POI- mCherry或阴性对照pEGAD-mCherry结构的细胞，并使用 1 mL 无针注射器渗透到烟叶的背面。叶子的每一半都渗入约 100 μL 的细菌混合物（图 2B），渗入区域用记号笔标记（图 2C）。
注意：仔细渗透烟叶，以免损坏烟叶。
4. 保留渗入的烟苗在 28 的生长室中 °C 在 16/8 小时光照/黑暗条件下 24 –36 小时。

C. Concanamycin A (ConA) infiltration
1. 切除靠近浸润部位的小叶盘，并在荧光显微镜中检查 GFP 或mCherry标记蛋白的表达。
2. 用 1 mL 无针注射器在标记的叶区渗透稀释的ConA溶液（1 μM ）（图 2D）。当ConA溶液几乎被吸收时切割叶子（通常需要大约 15 分钟，图 2E）。
注意： ConA是液泡型 ATP 酶的特异性抑制剂，常用于稳定自噬体 ( Dröse et al., 1993; Dettmer et al., 2006)。稀释的ConA溶液必须在使用前新鲜制备，将 998 μL新鲜悬浮缓冲液添加到 2 μ L ConA储备溶液 (0.5 mM) 中。此外，重要的是使用不同的注射部位进行ConA浸润。
3. 去除分离叶片的中脉，放入含有两层滤纸的培养皿中，滤纸用无糖 MS 液体培养基（MS-C 培养基，见食谱）（图2F）。用一层预湿的滤纸盖住叶子，轻轻压在叶子上以保持湿润（图 2G）。
注意：碳饥饿是自噬诱导的常用方法。为此，此处使用 MS-C 液体培养基，并将ConA浸润的叶子切下并置于黑暗中。此外，在湿滤纸中加入约 1.5mL 的MS-C 介质。过多的水分会导致叶子中的细胞死亡。
4. 用铝箔盖住培养皿并保持在 28 的生长室中 °C 36 小时。（图 2H）。

图 2. 实验程序说明。
(A) 重悬菌液； (B) 渗入细菌混合物； (C) 标记浸润的叶区； (D) 渗透ConA溶液； (E) 分离浸润的叶子； (F) 将分离的叶子放在预先弄湿的滤纸上； (G) 再用一层预先润湿的滤纸盖住叶子； (H) 用铝箔包裹培养皿。

D. Fluorescence Confocal Microscopy Imaging
1. 切割×渗透部位周围的四个叶子方块（0.5 0.5 厘米）并安装在 ddH 2 O 水中。
2. 使用 Zeiss LSM 800 激光扫描共聚焦显微镜（Carl Zeiss， https: //www.zeiss.com）检查近轴表皮细胞以可视化 GFP-ATG8a 和 POI- mCherry的亚细胞定位。
3. 共聚焦显微镜的设置：对于 GFP，用氩激光在 488 nm 处激发，在 505-550 nm 处进行发射检测；对于mCherry ，使用HeNe在 543 nm 处激发，在 585-615 nm 处进行发射检测。对两种荧光蛋白使用 4% 的激光强度和 1 个通风单位的针孔。

数据分析

如图 3 所示，当用空泡型 ATP 酶的特异性抑制剂ConA ( Dröse 等。 , 1993 年;德特默等。 , 2006 年）。此外，POI- mCherry标记的斑点在液泡中积聚，在ConA处理后与 GFP-ATG8a 共定位，表明 POI 与自噬囊泡的关联。相比之下，无论ConA处理如何，在液泡中均未检测到mCherry标记的泪点。基于此处显示的烟草瞬时表达系统的 GFP-ATG8 共定位测定可用于鉴定 ATG 成分或自噬货物，以及其他方法，如蛋白质-蛋白质相互作用测定和 ATG8 脂化测定。

图 3. 显示 POI - mCherry和 GFP-ATG8a 的亚细胞定位的代表性共聚焦图像。
N.benthamiana叶表皮细胞与mCherry (A) 或 POI- mCherry (B) 和 GFP- ATG8a共浸润，然后在农杆菌浸润后 24 小时用共聚焦显微镜分析，然后用 1 μM孵育 36 小时 ConA或 DMSO 处理 (– ConA )。 AB：自噬体； scale bar = 10微米m。

食谱

1. 细菌悬浮缓冲液（使用前必须新鲜配制）
10 毫米氯化镁2
100 µM乙酰丁香酮
10 mM MES（用 1 M KOH 调节至 pH = 5.8）
在 ddH 2 O
2. ConA原液 (0.5 mM)
μ L DMSO 添加到 100 μg ConA中来制备储备溶液。将溶液分配到 50 μL等分试样中，并储存在 -20 °C 或以下。
3. MS-C 液体培养基
4.3 克MS 基础盐混合物
2 µM MES 一水合物
在 1 L ddH 2 O 中（用 1 M KOH 调节至 pH = 5.7）

致谢

这项工作得到了广东省自然科学基金 (Grant 2022A1515011483) 和华南农业大学学生创新创业训练计划 (202110564052) 对 NL 和中国国家自然科学基金 (Grant 31970307) 对 FL 的资助和（授予 31401906）给 NL。使用该协议的原始论文是 Luo等人。（2021；doi.org/10.1101/2021.06.11.448008）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

1. Dettmer, J.、 Hong-Hermesdorf , A.、 Stierhof , Y. 和 Schumacher, K. (2006)。拟南芥的内吞和分泌运输需要液泡 H + -ATP 酶活性。植物细胞18(3)：715-730。
2. Dröse , S., Bindseil , KU, Bowman, EJ, Siebers , A., Zeeck , A. 和Altendorf , K. (1993)。修饰的巴弗洛霉素和康卡那霉素对 P 型和 V 型腺苷三磷酸酶的抑制作用。生物化学32（15）：3902-3906。
3. Luo, N., Shang, D., Tang, Z., Huang, X., Tao, L.-Z., Liu, L., Gao, C., Qian, Y., Xie , Q. and Li, F.（2021 年）。工程化基于 Aim 的选择性自噬以降解蛋白质和细胞器。 2021.2006.2011.448008。
4. Marshall, RS 和Vierstra , RD (2018)。自噬：批量和选择性回收的大师。 Annu Rev 植物生物学29（69）：173-208。
5. Suttangkakul , A., Li, F., Chung, T. 和Vierstra , RD (2011)。 ATG1/ATG13 蛋白激酶复合物既是拟南芥中自噬循环的调节剂又是靶标。植物细胞23：3761-3779。
6. Tanz ，SK， Castleden ，I.，Small，ID 和 Millar，AH（2013 年）。荧光蛋白标记作为一种工具来定义植物中蛋白质的亚细胞分布。前植物科学4：214。
7. Zhuang, X.、Wang, H.、Lam, SK、Gao, C.、Wang, X.、Cai, Y. 和 Jiang, L.（2013 年）。与磷脂酰肌醇 3-磷酸和 ATG8 结合的 BAR 结构域蛋白 SH3P2 可调节拟南芥中自噬体的形成。植物细胞25（11）：4596-4615。