材料和试剂

1. Eppendorf ® Safe-Lock 微量离心机 1.5 mL 管（Sigma-Aldrich，目录号： T9661 ）
2. 70μm细胞过滤器（Vita Scientific，目录号： NSTF90051 ）
3. CytoOne T75过滤帽TC烧瓶（USA Scientific，目录号： CC7682-4875）
4. 100 mm培养皿，组织培养处理（VWR，目录号： 25382-428）
5. Corning ® 96 孔透明平底聚苯乙烯 TC 处理的微孔板（Corning，目录号： 3596）
6. 0.45 µm 无菌聚醚砜注射器过滤器（VWR，目录号： 28145-493）
7. 10 mL BD Luer-Lok TM注射器（BD，目录号：309605）
8. Axygen 96 Well Clear V-Bottom 550 µL聚丙烯深孔板（ Axygen ，目录号：P-96-450V-C ）
9. IL10 GFP /Foxp3 RFP双报告小鼠模型（如我们之前在Huang et al., 2017 中报道的那样生成）。
10. Rag -/-小鼠模型（Jackson Laboratory，Strain #: 002216）
注：所有动物实验均已获得批准路易斯安那州立大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC)（协议号：18-047 和 21-039）。
11. MS柱（ Miltenyibiotec ，目录号：130-042-201）
12. LS 柱（ Miltenyibiotec ，目录号：130-042-401）
13. InVivoMAb抗小鼠 CD3ε [克隆：145-2C11]（Bio X Cell，目录号：BE0001-1）
14. InVivoMAb抗小鼠 CD28 [克隆：37.51]（Bio X Cell，目录号：BE0015-1）
15. 小鼠 IL-27（NS0 表达）蛋白（R&D Systems，目录号：2799-ML-010）
16. Retro-X TM浓缩器（Takara Bio，目录号：631456）
17. Opti-MEM TM ，减少血清培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
18. Mirus Bio TransIT ® -293 转染试剂（VWR，目录号：10766-968）
19. Morita中描述的逆转录病毒包装细胞系等。 (2000 年)
20. 反子逆转录病毒载体（例如，pGC-IRES-Thy1.1、pMI-IRES-hCD2、pGC-IRES-BFP2。详见致谢）。
21. RPMI 1640 培养基（Fisher Scientific，目录号：11-875-119）
22. DMEM（Fisher Scientific，目录号：11-965-118）
23. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：10082147）
24. 1 M HEPES溶液（ Cytiva ，目录号：SH30237.01）
25. 100 ×非必需氨基酸（Corning，目录号：25-025-ci）
26. 100 mM丙酮酸钠（ Hyclone ，目录号：sh30239.01）
27. 200 mM L-谷氨酰胺（ Hyclone ，目录号：SH30034.02）
28. 100 ×青霉素/链霉素溶液（ Hyclone ，目录号：SV30010）
29. 嘌呤霉素二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P7255）
30. 杀稻瘟菌素 HEPES缓冲液中的S.HCl溶液10 mg / mL（AG Scientific，目录号：B-1247-SOL）
31. 红细胞（RBC）裂解缓冲液（10 × ）（ Tonbo Biosciences，目录号：TNB-4300）
32. 抗生物素微珠（ Milteny Biotec ，目录号：130-090-485)
33. 丝裂霉素C（CAS 50-07-7）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-3514B）
34. 3% 乙酸和亚甲基蓝（ Stemcell TM Technologies；目录号：07060）
35. 生物素抗人/小鼠CD45R（B220）[克隆：RA3-6B2]（ Tonbo Biosciences，目录号：30-0452）
36. 生物素抗CD19单克隆抗体[克隆：HIB19]（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-0199-82）
37. 生物素抗CD8α大鼠单克隆抗体[克隆：53-6.7]（ Biolegend ，目录号：100704）
38. 生物素抗小鼠 TER-119 [克隆：TER-119]（ Tonbo Bioscience，目录号：30-5921）
39. 生物素抗CD49b（pan-NK细胞）大鼠单克隆抗体[克隆：DX5]（ Biolegend ，目录号：108904）
40. 生物素抗NK1.1 [克隆：PK136]（ Tonbo Bioscience，目录号：30-5941）
41. 生物素抗TCR γδ [克隆：GL 3]（ eBioscience ，目录号：13-5711-85）
42. 生物素抗Ly-6G / Ly-6C（Gr-1）大鼠单克隆抗体[克隆：RB6-8C5]（ Biolegend ，目录号：108404）
43. 生物素抗小鼠 CD122（IL-2Rβ）[克隆：5H4]（ Biolegend ，目录号：105904）
44. 生物素抗CD25大鼠单克隆抗体[克隆：PC61]（ Biolegend ，目录号：102004）
45. 生物素抗CD44大鼠单克隆抗体[克隆：IM7]（ Biolegend ，目录号：103003）
46. 生物素抗CD11b大鼠单克隆抗体[克隆：M1 / 70]（ Biolegend ，目录号：101204）
47. 生物素抗CD11c单克隆抗体[克隆：3.9]（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-0116-82）
48. 生物素抗小鼠 F4/80 [克隆：BM8]（ Biolegend ，目录号：123106）
49. Ghost Dye TM Violet 510（ Tonbo Biosciences，目录号：13-0870-T100）
50. FITC抗小鼠TCRβ[克隆：H57-597]（ Tonbo ，目录号：35-5961）
51. 藻红蛋白（PE）抗小鼠CD25单克隆抗体[克隆：PC61.5]（ Tonbo Biosciences，目录号：50-0251）
52. 别藻蓝蛋白（APC）抗CD4大鼠单克隆抗体[克隆：GK1.5]（ Biolegend ，目录号：100412）
53. PE-Cy7抗CD62L大鼠单克隆抗体[克隆：MEL-14]（ Tonbo Bioscience，目录号：60-0621-U100）
54. Pacific Blue TM抗人 CD2（hCD2）抗体[克隆：TS1/8]（ Biolegend ，目录号：309216）
55. PE抗大鼠CD90 /小鼠CD90.1（Thy-1.1）抗体[克隆：OX-7]（ Biolegend ，目录号：202523）
56. 全 DMEM（见食谱）
57. 全 DMEM + 嘌呤霉素/杀稻瘟素（见食谱）
58. 完整的 RPMI（见食谱）
59. 1 × RBC 裂解缓冲液（参见配方）
60. 初级生物素抗体预混液（见配方）
61. 磁性抗生物素微珠 + 分选抗体预混液（参见食谱）

设备

1. LSR Fortessa X-20（BD 生物科学）
2. FACS Aria II 细胞分选仪（BD Biosciences）
3. Avanti J-15R 离心机（贝克曼库尔特）
4. Eppendorf Centrifuge 5420 (Eppendorf AG)
5. MACS® _ MultiStand （美天旎） Biotec ，目录号： 130-042-303)
6. Forma TM系列 3 水套 CO 2培养箱（Thermo Fisher，目录号： 4110）

软件

1. FlowJo （FlowJo，有限责任公司）
2. FACS DIVA 软件版本 9.0 (BD Biosciences)
3. GraphPad 棱镜（GraphPad 软件）

程序

A. 逆转录病毒生产
注意：逆转录病毒生产和转导的所有处理都在 BSL-2 罩下进行。从 Plat-E 生产的 RV 无法复制且具有生态性。然而，许多常用的感兴趣基因已被鉴定为癌基因，例如 HRas G12V （黄等人，2017 年）。
1. 将 Plat-E 细胞保存在带有完整 DMEM + 嘌呤霉素/杀稻瘟素的 T75 烧瓶中（参见食谱）。
2. × 10 6 Plat-E 细胞播种到 100 mm 培养皿中，培养皿中含有不含嘌呤霉素/杀稻瘟素的全 DMEM 培养基。
3. % –80% 的融合度转染 Plat-E 细胞，通常在接种后约 18–24 小时。
4. OPTI-MEM 和TransIT ® -293 加热至室温。
5. 将 1 mL 的 OPTI-MEM 移液器放入聚丙烯 1.5 mL Eppendorf 管中。
6. 添加10–15微克双顺反子逆转录病毒载体质粒 DNA 到 OPTI-MEM。轻轻吸管混合。
注意：调整总质粒以获得最佳转染效率。根据我们的经验，10 – 15 μg适用于大多数质粒。
7. 使用前，涡旋TransIT ® -293 0.5 秒。移液器30–45 μL TransIT ® -293 加入到 OPTI-MEM + 质粒混合物中。轻轻吸管混合。
注：1 μ g质粒 DNA 与 3 μ L的比例 TransIT ® -293 适用于大多数质粒。调整质粒 DNA 的总量和比例DNA:TransIT ® -293 试剂以优化。
8. 在室温下孵育转染混合物20 分钟。
9. 将转染混合物逐滴添加到细胞中，均匀分布在板上。轻轻地来回摇晃以均匀涂抹。
10. 将细胞返回培养箱。
11. 在转染后 24 小时，收集培养基，并更换为新鲜预热的全 DMEM 培养基。
12. × g和 4 °C 下将收集的介质离心5 分钟，然后通过 0.45 μ m过滤器放入干净的 50 mL 管中。将过滤介质储存在 4°C。
13. 在转染后 48 小时和 60 小时重复步骤 11 和 12，并将过滤后的介质合并到一个 50 mL 管中。
14. 每三卷过滤介质添加一卷 Retro-X 浓缩器。
15. 轻轻倒置试管混合。
16. 在 4°C 下孵育过夜。
17. 1,500 离心机 × g和 4 °C 45 分钟。
18. 弃去上清液。在完整的RPMI培养基中以原始体积的 1/10 重悬沉淀。
19. 立即使用浓缩的 RV 培养基，或以单次使用的等分试样储存在 -80 °C。在这些条件下，RV 在生产后最多可储存 2 年。

B. 分离幼稚 CD4 + T 细胞
1. GFP /Foxp3 RFP双报告小鼠模型中收集脾脏和淋巴结（颈椎、肱骨和腹股沟浅表很容易接近）。
2. 通过 70 μ m细胞过滤器通过研磨使组织均质化，然后转移到 15 mL 离心管中。
3. 600 离心机 × g 5 分钟。
4. 在 1 mL 的 1 × RBC 裂解缓冲液中弃去上清液并重新悬浮细胞（参见配方4 ）。将 RBC 裂解缓冲液加入 5 mL。在室温下孵育 5 分钟。
5. 添加 2 mL 的全 RPMI 介质以中和裂解反应。 600 离心机 × g 5 分钟。
6. 丢弃上清液，重新悬浮在 1 mL 的全 RPMI 介质中，然后转移到 1.5 mL 管中。
7. 1,500 离心机 × g 1 分钟，吸出上清液，然后重悬于初级生物素抗体预混液中（参见配方5 ），每只小鼠使用 200 μL 。如果有任何不规则的团块，则将其移除。
8. 在冰上孵育 15 分钟，每 5 分钟摇晃一次。
9. 在孵育期间，制备磁性抗生物素微珠 + 分选抗体主混合物（参见配方6 ）。
10. 将 1 mL 的完整 RPMI 介质添加到单元格中。以 1,500 × g离心1 分钟，吸出上清液，重悬于磁性抗生物素微珠 + 分选抗体预混液中。
11. 在冰上孵育细胞 15 分钟，每 5 分钟摇晃一次。
12. 细胞孵育时，在 MACS Multistand上准备 MS 或 LS 磁分离柱。在室温下用全 RPMI 介质预润湿色谱柱。在磁分离柱下装入无菌收集管。
a. MS 柱容纳一个脾脏。用 0.5 mL 的全 RPMI 介质预湿。
b. LS 柱容纳四个脾脏。用 2 mL 的全 RPMI 介质预湿。
13. 将 1 mL 的完整 RPMI 介质添加到单元格中。 1,500 离心机 × g 1 分钟，吸出上清液。
14. 在 550 μ L的全 RPMI 培养基中重新悬浮细胞。从管顶取 500 μL ，装入磁分离柱中。让媒体流过。
15. 为了提高产量，将 550 μ L的 RPMI 添加到 1.5 mL 管中。从管顶取 500 μL ，装入磁柱。
让细胞通过柱流入无菌收集管。幼稚的 T 细胞处于流通中，并准备好进行分类（图 1A ）。

图 1.幼稚 CD4 + T 细胞隔离门控策略。
幼稚 CD4 + T 细胞分离的示意图 (A)。通过流式分选进行体外分化 (B)分离幼稚 CD4 + T 细胞的门控策略的代表性 FACS 图。改编自黄等。（2017 年）。

16. 通过将 1 mL 的冷全 RPMI 介质添加到 15 mL 管中，准备流分拣收集管。
17. 要分离幼稚 CD4 + T 细胞，请通过 FACS Aria II 细胞分选仪 (BD Biosciences)对 CD44 lo CD62L hi CD25 - Foxp3 RFP- TCRβ + CD4 +细胞进行分类。图 1B给出了门控策略的一个示例（黄等。 , 2017 年）。
18. 离心纯化的幼稚 CD4 + T 细胞 × g 5 分钟。弃去上清液。在全 RPMI 介质中以 1 × 10 6 个细胞/mL 重新悬浮。

C. Tr1 细胞分化
1. 要获得抗原呈递细胞 (APC)，请将 Rag -/-小鼠的脾脏通过 70 μ m过滤器均匀化到 5 mL 的全 RPMI 介质中。
2. 添加丝裂霉素 C 至终浓度为 50 μ g / mL。在 37°C 下孵育 30 分钟。
3. 600 离心机 × g 5 分钟。弃去上清液。
4. 在 1 mL 的全 RPMI 介质中重新悬浮细胞。转移到 1.5 mL 管中。
5. 通过在 1,500 下离心洗涤细胞 × g 1 分钟。吸出上清液。重新悬浮在 1 mL 的完整介质中。重复洗涤步骤共四次。
6. 将 10 μ L的细胞分装到 90 μ L的 3% 乙酸中，加入亚甲蓝。通过移液混合，并使用血细胞计数器和光学显微镜对 APC 进行计数。以 3 × 10 6 个细胞/ mL 重悬。
7. 混合等量的丝裂霉素 C 处理的Rag -/- APC 和纯化的幼稚 CD4 + T 细胞。初始 CD4 + :APC的最终比例为 1:3，0.5 × 10 6 /mL 初始 CD4 + T 细胞，1.5 × 10 6 /mL APC。
8. 将抗 CD3 ε 、抗 CD28 和 IL-27 添加到 CD4 + ：APC 混合物中，最终浓度为：
a. 1 μ g /mL 抗 CD3 ε (145-2C11)
b. 1 μ g /mL 抗 CD28 (37.51)
c. 25 纳克/毫升 IL-27
9. 在 96 孔平底板中每孔板200 mL 的细胞。
10. 在 37 °C 和 5% CO 2下孵育。

D. 转导
注意：逆转录病毒生产和转导的所有处理都在 BSL-2 生物安全柜下进行。
1. 转导 CD4 + T 细胞。
2. 以 1,500 离心 96 孔板 × g和 37 °C 5 分钟。
3. 小心地取出 170 μ L的介质，以避免干扰细胞。
4. 将 20 μ L的浓缩 RV（A 部分）添加到井中。
空的亲本双顺反子逆转录病毒载体用作对照（即，pGC-IRES-Thy1.1 用于感兴趣的基因-IRES-Thy1.1）。
5. 以 1,500 离心板 × g和 37 °C 2 小时。
6. 将 96 孔板放回 37°C 的培养箱中 2 小时。
7. 将 150 μ L的预热培养基添加到具有原始培养条件的每个孔中（在步骤 C8 中描述）。
8. 在转导后 48-72 小时分析 Tr1 细胞分化或对细胞进行分类以进行功能测定。

E. Tr1细胞分化分析
1. 准备流式细胞仪染色预混液：
a. 每个样品30 μL PBS
b. APC Anti-CD4 Rat [克隆：GK1.5]、Ghost Dye TM Violet 510 和抗报道抗体（例如Pacific Blue Anti-hCD2 [克隆：TS1/8]、PE 抗 Thy1. 1 [克隆：OX-7]）
2. 将细胞转移到 V 底染色板中。
3. × g离心细胞1 分钟。
4. 倒置板以去除上清液。
5. 孔加入 30 μL染色预混液，上下移液器重悬。在室温下孵育，避光 20 分钟。
6. 加入 230 μ L的 PBS。以 1,000 × g离心细胞1 分钟。倒置板以去除上清液。
7. 在 280 μ L的 PBS 中重悬颗粒。转移到流式细胞仪管进行分析。
8. 使用图 2中的门控策略，成功识别转导 (RV Reporter + ) 和非转导 ( RV Reporter - ) 细胞。收集足够数量的每个单元格以进行适当的分析。

图 2. 数据收集门控策略。
在 Tr1 分化条件下培养幼稚IL10 GFP /Foxp3 RFP报告基因 CD4 +细胞，并用对照-Thy1.1 转导 RV。用于收集 RV 转导 Thy1.1 + (Reporter + ) 和非转导Thy1.1 - (Reporter - ) CD4 +细胞的门控策略的代表性 FACS 图。

F. 为功能测定分选转导的 Tr1 细胞
1. 将转导后 48–72 小时的细胞组合在 15 mL 管中。
2. 600 离心机 × g 5 分钟。吸出上清液
3. 用 1:200 稀释的全 RPMI 培养基重悬：
a. Ghost Dye TM紫罗兰色 510
b. APC 抗 CD4 大鼠 [克隆：GK1.5]
c. 抗报告抗体（例如，Pacific Blue Anti-hCD2 [clone:TS1/8]、PE anti-Thy1.1 [OX-7]）
d. 在冰上孵育 15 分钟，每 5 分钟摇晃一次。
4. 转移到 1.5 mL 管中。在冰上孵育 15 分钟，每 5 分钟摇晃一次。
5. 将 1 mL 的完整 RPMI 介质添加到单元格中。 1,500 离心机 × g 1 分钟，吸出上清液。
6. 在 1 mL 的全 RPMI 培养基中重新悬浮细胞，然后转移到管中进行分拣。
7. 使用Huang的门控策略等。 (2017 )为淋巴细胞/单联体/Live/CD4 + / RV Reporter + /IL10 GFP+ Foxp3 RFP- 进行分类。
注意：包括 Reporter - IL10 GFP+ Foxp3 RFP-细胞可用作另一种对照。
8. 继续在功能测定中使用纯化的细胞。

数据分析_

1. 使用门控策略淋巴细胞/单细胞/活细胞/CD4 + /Reporter + CD4 +细胞分析 Tr1 分化（图 3 ）。

图3. RV 转导 Tr1 细胞分析的门控策略。
CD4 + T 细胞用 HRas G12V -IRES-BFP2 RV 颗粒转导。用于分析 RV 转导 (BFP + ) 和非转导 ( BFP - ) IL10 GFP+ Foxp3 RFP- Tr1 细胞的门控策略的代表性 FACS 图。

2. IL10 GFP+ Foxp3 RFP- CD4 + T 细胞的频率可以通过 t 检验或单向 ANOVA 与 GraphPad Prism 中的适当事后检验进行比较，具体取决于实验组的数量。记者-细胞可以作为内部控制进行分析。

笔记

1. 包括经典的 Tr1 标记 LAG3 和 CD49b ( Gagliani et al. , 2013 )提供了 Tr1 分化的进一步证据，强烈推荐。
2. Reporter +细胞中转录因子的过度表达应通过核染色来验证。推荐使用eBioscience TM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Fisher, 00-5523-00)。
3. 双顺反子逆转录病毒载体骨架质粒产生高效率的转导，例如 pGC-IRES-Thy1.1、pMI- IRES-hCD2 和 pGC-IRES-BFP2。
4. Plat-E 细胞转染（A 部分）的效率是实现最佳 RV 滴度和下游 RV 转导效率的关键步骤。这可以在收获 RV 培养基后通过 Plat-E 细胞的流式细胞术轻松评估，通过对活细胞/报告者+细胞进行门控。
5. 插入片段的大小和生物学功能会影响 Plat-E 转染效率和 RV 转导效率。在我们手中，插入约 2,500 bp 时，转导效率显着下降，除非它促进 T 细胞活化（例如，组成型活性 STAT5）。
6. 转导的高效率使该协议可用于双转导实验和IL-10 诱导条件下CD8 + T 细胞的转导（图 4 ）。

图4. 用于分析双 RV 转导 Tr1 细胞的门控策略。
G12V -IRES-BFP2 和 caSTAT5-IRES-Thy1.1转导的 IL10 GFP+ Foxp3 RFP - Tr1 细胞的代表性 FACS 图。

食谱

1. 全DMEM
记忆体
10% 胎牛血清
10 mM HEPES 溶液（pH 7.5）
1 ×非必需氨基酸
1 mM 丙酮酸钠
2 mM L-谷氨酰胺
1 ×青霉素/链霉素溶液
2. 全 DMEM + 嘌呤霉素/杀稻瘟素
记忆体
10% 胎牛血清
10 mM HEPES 溶液（pH 7.5）
1 ×非必需氨基酸
1 mM 丙酮酸钠
2 mM L-谷氨酰胺
1 ×青霉素/链霉素溶液
1微克/毫升嘌呤霉素
10μg / mL杀稻瘟素
3. 完整的 RPMI
RPMI 1640 中
10% 胎牛血清
10 mM HEPES 溶液（pH 7.5）
1 ×非必需氨基酸
1 mM 丙酮酸钠
2 mM L-谷氨酰胺
1 ×青霉素/链霉素溶液
4. 1 × RBC 裂解缓冲液
50 mL 10 × RBC 裂解缓冲液
450 毫升 ddH 2 O
5. 初级生物素抗体预混液
200 μ L全 RPMI 培养基
生物素抗体的终浓度为：
5 μ g /mL：抗 B220、CD19 和 CD8
2.5 μ g /mL：Anti-Ter119、DX5/CD49b、NK1.1 1、 TCR γ δ 、Gr-1 1、CD122、CD25 CD11c、CD11b 和 F4/80
0.25 μ g /mL：抗CD44
6. 磁性抗生物素微珠 + 分选抗体预混液
80 μ L全 RPMI 培养基
20 μ L抗生物素微珠（ Milteny Biotec抗生物素微珠）
1:200 Ghost Dye TM紫罗兰色 510
1:200 FITC 抗 TCRβ [克隆：H57-597]
1:200 PE Anti-CD25 [克隆：PC61.5]
1:200 APC Anti-CD4 [克隆：GK1.5]
1:200 PE-Cy7 Anti-CD62L [克隆：MEL-14]

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 (R21-AI129422、R56-AI146226、R01-AI138570 和 R01-AI151139) 的慷慨支持。 MCM 得到美国免疫学家协会的免疫学职业奖学金的支持。 WH 是美国大学妇女协会的工程、医学和科学研究出版补助金的获得者。我们要感谢 J. Sun、C. Li 和 YM Son 博士对 Plat-E 细胞系和有益的讨论。我们还感谢 A. Pernis 和 S. Gupta 博士 ( pGC ) 以及 T. Malek 和 A. Yu ( pMI ) 提供逆转录病毒质粒骨架。 pLKO.3 Thy1.1（C. Benoist 和 D. Mathis 博士赠送； Addgene质粒 #14749）和 mTagBFP2-Lifeact-7（M. Davidson 博士赠送； Addgene质粒 #54602）用于克隆 Thy1.1和 BFP2 分别进入各自的质粒骨架。此处介绍的协议改编自先前发表的作品（ Huang 等人，2017 年）。

利益争夺

MCM 声明没有利益冲突。 2017 年，WH 和 AA 就RAS 信号在 Tr1 细胞分化和功能中的应用在康奈尔大学申请了专利披露，当时关于 RAS 信号的原始研究发表于 2017 年。WH 获得了MegaRobo Technologies, Ltd 的资助，AA 获得了来自3M，这与本工作中提出的研究无关。

伦理

所有实验程序均经路易斯安那州立大学机构生物安全和动物护理和使用委员会批准，根据协议 18015（2018 年 12 月 10 日至今）进行生物安全 2 级研究和协议 IACUCAM 18-047（2018 年 5 月 23 日） – 5/22/2021) 和 IACUCAM 21-039 (4/26/2021 – 4/25/2024) 供动物使用。

参考

1. Bohm, L.、Maxeiner, J.、Meyer-Martin, H.、Reuter, S.、Finotto, S.、Klein, M.、Schild, H.、Schmitt, E.、Bopp, T. 和 Taube, C （2015 年）。 IL-10 和调节性 T 细胞在过敏原特异性免疫疗法中合作以改善过敏性哮喘。免疫杂志 194(3)：887-897。
2. Eremenko, E.、Taylor, ZV、Khand, B.、Zaccai, S.、Porgador, A. 和 Monsonego, A. (2021)。小鼠 CD4 T 逆转录病毒转导的优化方案细胞。 STAR 协议2(3)：100719。
3. Gagliani, N., Magnani, CF, Huber, S., Gianolini, ME, Pala, M., Licona-Limon, P., Guo, B., Herbert, DR, Bulfone, A., Trentini, F.等人。（2013）。 CD49b 和 LAG-3 的共表达可识别人和小鼠 T 调节 1 型细胞。 Nat Med 19（6）：739-746。
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