材料和试剂

1. 圆形盖玻片，德国玻璃，12 mm 直径，#1.5 厚度（Electron Microscopy Sciences，目录号：72291-02）
2. 24孔平底细胞培养板（Corning Costar，Corning，目录号：3526，或类似）
3. 1.5-1.7 mL微量离心管（Thomas Scientific，目录号：1138W14）
4. 0.5 mL开口厚壁聚碳酸酯管（Beckman Coulter，目录号：343776）
5. 50 mL锥形管（Corning，目录号：352070）
6. 0.22 µm 注射器过滤器（ Millex ，Millipore-Sigma，目录号：SLGPR33RS）
7. 50 mL Luer尖端注射器（BD Luer -Lok Tip，Fisher Scientific，目录号：14-820-11）
8. 10 µL 移液器吸头，末端被切断以形成更大的孔口
9. 磨砂显微镜载玻片（ Fisherbrand ，Fisher Scientific，目录号：12-550-343）
10. 用于速冻蛋白质的乙醇/干冰浴或液氮
11. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco， ThermoFisher Scientific，目录号：20012027）
12. 聚-L-赖氨酸，0.01％溶液（Sigma-Aldrich， MilliporeSigma ，目录号：P4707-50ML）
13. 兔肌肉 G-肌动蛋白，> 99% 纯度（Cytoskeleton，Inc.，目录号：AKL99）
注意：使用从兔骨骼丙酮粉末内部制备的肌动蛋白也可以，但需要注意确认所有捆绑蛋白质污染物已被去除。
14. ASAP1 N-BAR 重组蛋白，如前所述表达和纯化 ( Gasilina et al., 2019, 2022)
15. α-肌动蛋白（Cytoskeleton，Inc.，目录号：AT01）
注意：强烈建议使用真正的肌动蛋白捆绑蛋白，例如-actinin 或 vinculin tail，作为阳性对照。
16. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：B8667）。分装成 100 μL卷并快速冻结。储存在-80°C。
17. 甲醇≥ 99.9%（JT Baker，VWR International，目录号：9093-02）
18. 荧光标记的鬼笔环肽[罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen， ThermoFisher Scientific，目录号：R415），或 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽（Invitrogen， ThermoFisher Scientific，目录号：A12379）]。在 1.5 mL 的 100% 甲醇中重组并储存在 -20 °C。
注意：尽管任何明亮且光稳定的荧光鬼笔环肽共轭物均可用于染色和可视化束，但在可见光谱中使用荧光团将有助于在数据采集过程中查找和聚焦样品。
19. 腺苷 5'-三磷酸二钠盐（ATP）（Cytoskeleton，Inc.，目录号：BSA04）。用 1 mL 的冷 100 mM Tris，pH 7.5（配方 7）重新配制 100 mM 库存，分装成 5 – 100 µL 部分和 10 – 50 µL 部分，快速冷冻，并储存在 -80 °C。请注意，来自细胞骨架的 ATP 是从缓冲至 pH 7 的溶液中冻干的，因此，该溶液不需要额外调整pH 值。
20. 多聚甲醛，16％，无甲醇（电子显微镜科学，目录号：15710）
21. Dako荧光封固剂（Agilent，目录号：S302380-2）
22. 氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：223506）
23. 氯化钾（ KCl ）（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：P3911）
24. 氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：M9272）
25. Tris-HCl，1 M，pH 7.5（KD Medical，目录号：RGF-3350）
26. 二硫苏糖醇（DTT）Cleland试剂（MP Biomedicals，VWR International，目录号：0219482101）
27. 1 × G-肌动蛋白缓冲液（见配方）
28. 10 × ctin 聚合缓冲液（参见配方）
29. 1 × F-肌动蛋白缓冲液（见食谱）
30. 1 M 氯化钙2 （见食谱）
31. 1 M氯化钾（见食谱）
32. 1 M MgCl 2 (见配方)
33. Tris-HCl，1 M，pH 7.5 （参见食谱）
34. 1 M DTT （见配方）

设备

1. P10、P20 和 P200 微量移液器
2. 用于 1.5/2 mL 管的台式微量离心机
3. 小容量超速离心机（例如，带有 S120-AT3 转子的Thermo Scientific Sorvall MTX）
4. 配备油浸物镜的共聚焦显微镜，最好配备平铺扫描选项（我们使用 63 ×物镜，但考虑到束的大小，任何介于 40 ×和 100 ×之间的物镜都适用。）

软件

1. 斐济/ImageJ（美国国立卫生研究院， imagej.nih.gov ）

程序

A. 聚-L-赖氨酸涂层盖玻片的制备
注意：此程序假定每个捆绑分析进行四次技术复制，总共进行四次捆绑分析-单独的F-肌动蛋白、带有 ASAP1 BAR-PH 的 F-肌动蛋白、带有 BSA 作为阴性对照的 F-肌动蛋白，以及F-肌动蛋白和-肌动蛋白作为阳性对照——都在单一浓度下。如果要测试额外的蛋白质或浓度，请相应地增加盖玻片的数量。
1. 要一式四份地检查四个条件，请将 16 个盖玻片放入 24 孔板中，每个孔中一个（图 1A - B）。我们使用 24 孔板，因为孔的大小非常适合 12 mm 盖玻片。
2. 在每口井中加入 500 μL 的 0.01% 聚 L-赖氨酸溶液，确保盖玻片完全浸没。如果盖玻片漂浮起来，用移液器吸头轻轻地将它们放回溶液中（图 1C - D）。
3. 更换盖子并在室温（RT）下孵育 2 小时（图 1E）。
4. 吸出聚-L-赖氨酸溶液，用 500 μL 的蒸馏水清洗盖玻片三次（图 1F）。
5. 将盖子稍微歪斜放在盘子上，让盖玻片干燥过夜（图 1G）。或者，将盖玻片在 65 °C烤箱中干燥 15 分钟。

B. 球状肌动蛋白 (G-肌动蛋白) 原液的制备
1. 将含有 250 µg 冻干肌动蛋白的试管短暂离心，将粉末带到试管底部。
2. 添加 250 µl 冷 G-actin 缓冲液，新鲜补充 0.2 mM ATP 和 0.5 mM DTT（参见食谱）。轻轻吸管 5 到 6 次以重新悬浮粉末，注意避免气泡。不要涡旋。
3. 在冰上孵育 1 小时。
4. 这是 1 mg/mL (~23 µM) 的 G-actin 库存。
笔记：
a. 肌动蛋白的球状形式不稳定。立即进行步骤 C 或分装成更少量并储存在 -80 °C 下。
b. 我们发现来自细胞骨架的高纯度肌动蛋白具有很少的聚集体，因此在再悬浮后不需要高速离心。如果使用其他肌动蛋白来源，可能需要以 100,000–150,000 × g离心 G-肌动蛋白原液以去除聚集体，然后计算剩余 G-肌动蛋白部分的蛋白质浓度。

C. 肌动蛋白丝 (F-肌动蛋白) 的制备
1. 准备 10 ×肌动蛋白聚合缓冲液（参见食谱）。
2. 将 25 μL 的 10 ×肌动蛋白聚合缓冲液（体积的 1/10）添加到 250 μL的1 mg/mL G-肌动蛋白库存中。充分混合，注意避免气泡。不要涡旋。
3. 在 RT 孵育 1 小时。
注意：F-actin 在 4 时稳定 °C长达 1 个月。不要冻结。

D. 制备潜在的捆绑蛋白，如 ASAP1 和 BAR-PH、阴性对照 BSA 和阳性对照 α-actinin 用于捆绑测定（可选但强烈推荐）
1. 将台式超速离心机和转子预冷至 4 °C 。
2. 在 RT 水浴中快速解冻 ASAP1 BAR-PH、BSA 和 α-肌动蛋白。我们通常将蛋白质储存在 100 μL等分试样中，蛋白质浓度约为 1 mg/ mL。对于 ASAP1 和源自 ASAP1 的重组蛋白，储存缓冲液通常为 20 mM HEPES、pH 8.0 和 150 mM NaCl。
3. 将蛋白质分配到聚碳酸酯超速离心管中。
4. 将装有“空白”溶液（例如，蛋白质缓冲液或水）的试管适当平衡后，将试管放入超速离心机转子中。固定盖子。
5. 在 150,000 × g和 4 °C 下旋转1 小时以沉淀颗粒和聚集体。
6. 离心后，打开转子盖，用圆点标记管朝外的侧面，以指示有颗粒和碎屑的一侧。
7. 将旋转蛋白转移到新的预先标记的微量离心管中，注意不要干扰颗粒。
8. 使用蛋白质测定法（例如 BCA 或 Bradford）或其他分光光度法确定蛋白质浓度。
注意：如果蛋白质浓度低，建议将蛋白质纯化到 F-actin 缓冲液中或使用 PD-10 ( Cytiva ) 或Zeba柱 ( ThermoFisher ) 将蛋白质交换到 F-actin 缓冲液中。

E. 肌动蛋白捆绑测定
1. 标记四个微量离心管，每个反应一个：单独的 F-肌动蛋白、F-肌动蛋白 + BSA、F-肌动蛋白 + α-肌动蛋白和 F-肌动蛋白 + ASAP1 BAR-PH（图 1H - I）。
2. 使用 F-肌动蛋白缓冲液（参见食谱）在每个管中设置 15 μL 反应，以补偿体积差异（图 1J - K）。反应通常包含 1–3 µM 肌动蛋白和 1–3 µM测试或对照蛋白。使用 3 μM 肌动蛋白和 3 μM 测试蛋白以及各自的阳性和阴性对照来初步估计捆绑效率。
注意：反应应在 10 分钟内完成，并迅速转移到盖玻片上，以便每个反应的孵育时间相当。
3. 使用垂直固定的 10 μL 移液器和末端被切断的尖端，将 3 μL 的反应移液器直接移入每个盖玻片的中心（图 1L - M）。避免引入气泡——这可能需要仅将移液器柱塞压到第一站。重复所有复制和反应。
注意：将反应点直接放在盖玻片的中心将极大地促进图像采集过程。
4. 更换 24 孔板的盖子并在 RT 处孵育反应滴 1 小时。
5. 在此期间，从 16% 的库存中制备 20 mL 的 4% 多聚甲醛 (PFA) 在 PBS 中并在冰上冷却。未使用的 16% PFA 可在 4 °C 下密封保存在封口膜中长达两周。或者，在 PBS 中将整个 10 mL 安瓿稀释至 4%（总共 40 mL），并在 4 °C 下将未使用的部分储存长达一周。
6. 轻轻地将盘子放在冰上，在每口井中加入 500 μL 的冰冷 4% PFA（在井侧的移液器以避免破坏反应滴）（图 1N）。如果有任何盖玻片浮起，请用移液器吸头轻轻地将它们放回原处。固定 30 分钟（固定将肌动蛋白束粘附到盖玻片上，因此它们在染色过程中不会丢失）。
7. 在冷 PBS 中轻轻冲洗盖玻片两次，每次 5 分钟。轻轻吸气。
8. 在 PBS 中用 500 μL 的 1:500 稀释荧光鬼笔环肽在冰上染色每个盖玻片 30 分钟。在染色过程中用箔纸盖住盘子（图 1O）。
9. 同时，在 12 张显微镜载玻片（如果每张载玻片放置两个盖玻片）上预先标记识别信息（例如，日期、首字母缩写、反应名称和鬼笔环肽结合物）。如有必要，用喷有 70% 酒精的 Kimwipe 轻轻擦拭幻灯片（图 1P）。
10. 30 分钟后，轻轻吸出染色溶液并加入 PBS。孵育 5 分钟。重复。在最后的 PBS 洗涤后，将 500 μL 的 ddH 2 O 吸出并添加到每个井中。
11. Dako荧光介质在每张幻灯片上安装两个盖玻片。从盖玻片边缘轻轻吸出多余的安装介质（参见图 1Q - T）。允许在黑暗中在室温下干燥至少 1 小时。样品可在 4 °C下储存或在成像后转移至 -20 °C长期储存。

图1 。程序的象形摘要。
有关详细信息和说明，请参阅正文。

图像采集和图像分析
使用共聚焦显微镜对盖玻片进行成像。对于 Alexa 488 phalloidin，使用氩 488 激光；对于罗丹明鬼笔环肽，请使用氪 564 激光。使用平铺扫描选项（可选）可以获取大面积的反应点。
采集后，可以使用 ImageJ 进一步分析图像。束长度和数量或荧光强度可以使用免费提供的插件进行测量； Gasilina等人描述了其使用。（2019 年、2022 年）。

可能的分析概述
通过比较束的荧光强度检查肌动蛋白捆绑的效率
绘制由不同肌动蛋白捆绑蛋白制成的束的线扫描强度可以是一种快速估计捆绑效率的方法。这种方法可以作为一种直接的工具，用于突变体或域截断等的初始表征。
请注意，不同显微镜图像之间荧光强度的直接比较需要使用相同的设置（物镜、光路、激光功率、增益、帧大小、缩放和扫描速度）进行采集。
1. 下载并安装斐济/ImageJ。
2. 打开肌动蛋白捆绑测定的显微镜图像。
3. 选择线工具并在束上画一条线。
4. 单击“分析” → “绘制轮廓”。
5. 当线扫描图出现时，单击“列表”并将结果窗口的内容复制到电子表格中。
6. 重复其他感兴趣的区域和图像。
7. 在单个图形中绘制线扫描以可视化束荧光强度的差异。

使用 Ridge Detection Plugin (ImageJ/Fiji) 量化肌动蛋白束的数量和长度
1. 下载并安装斐济/ImageJ。
2. 按照说明操作 https://imagej.net/plugins/ridge-detection 下载山脊检测插件。
3. 在 Fiji/ImageJ 中打开一个实验文件，然后通过单击图像→类型→ 8 位转换为 8 位。
4. 通过单击插件→山脊检测初始化山脊检测插件。
5. 设置“ Mandatory_parameters 。”为了帮助准确确定强制参数截止值，请检查“Preview”窗口并在“ Optional_parameters ”中修改高对比度和低对比度以实时查看捆绑检测。
6. 单击“确定”开始计算束长度和束数。
7. 摘要窗口提供每个已识别捆绑包的长度和唯一标识号。

图 2.代表性结果。请在文中引用
(A) “仅 F-肌动蛋白”对照样品被荧光鬼笔环肽染色。注意图像瓷砖上细丝的均匀分布。阴性对照蛋白，例如BSA ，应该与仅 F-肌动蛋白对照看起来几乎相同。 (B) “F-actin with ASAP1 BAR-PH”样品被荧光鬼笔环肽染色。注意厚束的外观。 (C) “F-肌动蛋白与α-肌动蛋白”阳性对照样品。 α-肌动蛋白是一种真正的肌动蛋白捆绑蛋白，可将肌动蛋白丝牢固地交联成粗束。比例尺 = 10 µm。

图 3. 检测失败示例。请在文中引用
(A) “仅 F-肌动蛋白”对照样品被荧光鬼笔环肽染色。注意左上角和右下角的肌动蛋白“团块”。 F-肌动蛋白储存不当会导致细丝聚集并随后出现团块。因此，该组中的其余盖玻片被丢弃。 (B) 在这个特定的例子中，测试蛋白在设置检测之前没有预旋转，导致碎片和微粒通过固定和染色，这表现为自发荧光伪影（右上）。这些强荧光点的存在阻碍了图像分析。比例尺 = 10 µm。

食谱

1. 1 × G-肌动蛋白缓冲液（4 °C 储存）
CaCl 2 (1 M) , 0.2 mM , 10 µL
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）， 20 mM， 1 mL
ddH 2 O, 49毫升
总计：50 毫升
在使用前立即补充 0.2 mM ATP 和 0.5 mM DTT（最终）。对于每毫升 G-肌动蛋白缓冲液工作溶液，添加 2 μL 的 100 mM ATP 库存和 5 μL 的 100 mM DTT 库存。继续冰上。 4 – 5 小时后丢弃未使用的库存。

2. 10 ×肌动蛋白聚合缓冲液（储存在 RT）
MgCl 2 (1 M), 20 毫米, 200 µL
氯化钾(5 M)、1 M、2 毫升
ddH 2 O, 7.8 毫升
总量： 10毫升
要制备 100 μL 的工作溶液，请将 10 μL 的新鲜解冻的 100 mM ATP 库存与 90 μL 的 10 ×聚合缓冲液在冰上混合。 4 – 5 小时后丢弃未使用的库存。

3. 1 × F-肌动蛋白缓冲液（立即制备和使用。保持在冰上并在 4 – 5 小时后丢弃）
G-肌动蛋白缓冲液 + ATP/DTT， 450微升
10 × 肌动蛋白聚合缓冲液 + ATP， 50 µ L
全部的： 500微升
使用以下作为指导（体积占移液错误）：要制作 G-肌动蛋白缓冲液 + ATP/DTT，将 500 μL 的 G-肌动蛋白缓冲液、1 μL 的 100 mM ATP 库存和 2.5 μL 的 100 mM DTT 股票。要制作肌动蛋白聚合缓冲液 + ATP，请将 10 μL的新鲜解冻的 100 mM ATP 库存和 90 μL 的聚合缓冲液结合起来。要制作 F-肌动蛋白缓冲液，请将 450 μL 的 G-肌动蛋白缓冲液与 ATP 和 DTT 以及 50 μL 的肌动蛋白聚合缓冲液与 ATP 结合。

4. 1 M 氯化钙2
将 7.35 g CaCl 2添加到 50 mL 的超纯水中，以获得 1 M 库存溶液。储存在 RT 的锥形管中。

5. 1 M氯化钾
将 18.6 g KCl添加到 50 mL 的超纯水中，以获得 5 M 库存溶液。储存在 RT 的锥形管中。

6. 1 M氯化镁2
将 10.2 g MgCl 2添加到 50 mL 的超纯水中，以获得 1 M 库存溶液。储存在 RT 的锥形管中。

7. Tris-HCl，100 毫米，pH 7.5
将 10 mL 的 1 M Tris-HCl 库存添加到 90 mL 的超纯水中并过滤消毒，以制备 100 mL 的 100 mM 工作溶液。储存在两个 50 mL 无菌锥形管中；将一根管子保持在 RT 中，将另一根管子储存在 4 °C 。

8. 1 M DTT
将 1.54 g 添加到 10 mL 的超纯水中，以获得 1 M 库存。将 9 mL 等分到 9 个 1 mL 等分试样中。取 1 mL 的 1 M 库存，用 9 mL 的超纯水进一步稀释至 100 mM。将 100 mM 库存分装在 500 μL 体积中。储存在-20°C。

致谢

这项工作得到了国家癌症校内研究计划的支持研究所，美国国立卫生研究院，卫生与公共服务部（项目编号 BC007365 至 PAR）。该协议改编自 Lin-Jones 和 Burnside (2007) 以及我们之前的工作 ( Gasilina et al., 2019, 2022)。作者感谢 Natalie M. Badillo 在摄影方面的帮助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1. Bharti, S., Inoue, H., Bharti, K., Hirsch, DS, Nie , Z., Yoon, HY, Artym , V., Yamada, KM, Mueller, SC, Barr, VA 等。（2007 年）。 ASAP1 的 Src 依赖性磷酸化调节足小体。摩尔细胞生物学27（23）：8271-8283。
2. Chen, PW, Billington , N., Maron, BY, Sload , JA, Chinthalapudi , K. 和Heissler , SM (2020)。 Arf GTPase 激活蛋白 ASAP1 的 BAR 结构域直接结合肌动蛋白丝。生物化学杂志 295(32)：11303-11315 。
3. Gasilina , A.、Vitali, T.、Luo, R.、Jian, X. 和 Randazzo, PA (2019)。 ArfGAP ASAP1 通过其 N-BAR 域控制肌动蛋白应力纤维组织。 iScience 22：166-180。
4. Gasilina , A.、Yoon, HY、Jian, X.、Luo, R. 和 Randazzo, PA (2022)。 ARF GTPase 激活蛋白 ASAP1 的 N-BAR 结构域中富含赖氨酸的簇是结合和捆绑肌动蛋白丝所必需的。生物化学杂志 298（3）：101700 。
5. Lin-Jones, J. 和 Burnside, B. (2007)。视网膜特异性蛋白肌成束蛋白 2 是一种肌动蛋白交联剂，与光感受器内段和花萼过程中的肌动蛋白束相关。 Invest Ophthalmol Vis Sci 48（3）：1380-1388。
6. Oda, A., Wada, I., Miura, K., Okawa, K., Kadoya , T., Kato, T., Nishihara, H., Maeda, M., Tanaka, S., Nagashima, K.,等。（2003 年）。 CrkL 将 ASAP1 引导至外周粘着斑。生物化学杂志 278（8）：6456-6460 。
7. Randazzo, PA, Andrade, J., Miura, K., Brown, MT, Long, YQ, Stauffer, S., Roller, P. 和 Cooper, JA (2000)。 Arf GTPase 激活蛋白 ASAP1 调节肌动蛋白细胞骨架。 Proc Natl Acad Sci USA 97(8): 4011-4016。