材料和试剂

1. 带有针头（Weller，目录号： KDS2312P）的注射器（BD，目录号： 302830 ）和柔性塑料管（ Tygon ，目录号： AAD04103）
2. 微流体球阀（Cole-Parmer，目录号： EW-30600-00）
3. 1 号盖玻片，22 × 22 mm（VWR，目录号：48366-067）
4. 1 号盖玻片，18 × 18 mm（VWR，目录号：48366-045）
5. 培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5731）
6. 0.22 µm 过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：SLGSM33SS）
7. 异丙醇（IPA，VWR，目录号：BDH2032-1GLP）
8. 过氧化氢（H 2 O 2 ，30%）（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
9. （3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）（Sigma-Aldrich，目录号：440140）
10. 琥珀酸酐（Sigma-Aldrich，目录号：239690）
11. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7638）
12. 氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
13. 氢氧化铵（NH 3 ∙H 2 O，28.0%–30.0%）（Mallinckrodt Reagents，目录号：C5103500-2.5D）
14. 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）（ Thermo Scientific，目录号：22980）
15. 磺基-NHS （N-羟基磺基琥珀酰亚胺）（ Thermo Scientific，目录号：24510）
16. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV）
17. 抗 IgA（IgG）（B io -Rad，目录号：STAR141）
18. 人初乳 IgA（Athens Research and Technology，目录号：16-13-090701）
19. 人 IgM（Athens Research and Technology，目录号：16-16-090713）
20. 办公胶带（3M TM Scotch TM , 810, 3/4 in × 108 ft, 1 in Tape Core Dia , 透明, 哑光)
21. 10 克 L -1琥珀酸酐（见配方）
22. NH 3 ∙H 2 O、H 2 O 2和水（参见食谱）
23. EDC-NHS 解决方案（见配方）

设备

1. 光学面包板（ Newport，型号：SG-23-4-ML ）
2. 主动隔振平台（ Accurion ，型号： Vario Basic 60-300）
3. 80 mW激光二极管（Thorlabs，型号：PL450B）
4. 温控底座（Thorlabs，型号：LDM38）
5. 台式二极管电流控制器（Thorlabs，型号：LDC205C）
6. 温度控制器（Thorlabs，型号：TED200C）
7. 手动平移台（Thorlabs，型号： XR25P-K2）
8. 和配件必备工具包（ Thorlabs，型号： ESK16 ）
9. 底座和柱架必备工具包（ Thorlabs，型号： ESK01 ）
10. SM1 透镜套管必备套件（ Thorlabs，型号： ESK25 ）
11. Ø 2" 光学支架必备套件（ Thorlabs，型号： ESK19 ）
12. Pillar Post Essentials 套件（ Thorlabs，型号： ESK15 ）
13. 镜头卡口必备套件（ Thorlabs，型号： ESK22 ）
14. C-Mount 延长管套件（ Thorlabs，型号： CML-KIT ）
15. SM2 镜筒必备套件（ Thorlabs，型号： ESK26 ）
16. 笼式组件和透镜套管必备套件（ Thorlabs，型号： ESK07A ）
17. 笼式组件和透镜套管基本套件 B 组（ Thorlabs，型号： ESK07B ）
18. 安装好的 Ø 1" 消色差透镜套件（ Thorlabs，型号： LSB08-A）
19. 笼式立方体安装保护银转向镜（Thorlabs，型号： CCM1-P01）
20. 摄像头（XIMEA，型号： MQ003MG-CM 和 MQ013MG-CM）
21. 25 mm × 36 mm 保护银镜（Thorlabs，型号： PFR10-P01）
22. 动态荧光滤光片立方体（Thorlabs，型号： DFM1）
23. SM1A2 适配器（Thorlabs，型号： SM1A2）
24. 60 毫米笼式系统平移镜头安装座（Thorlabs，型号： CXY2）
25. 黄铜显微镜适配器（Thorlabs，型号： M2M34S）
26. 笼板（Thorlabs，型号： LCP08）
27. 隔热适配器（Thorlabs，型号： SM1A3TS）
28. 变焦外壳（Thorlabs，型号： SM1ZM）
29. 反射式 ND 滤光片（Thorlabs，型号： ND40A）
30. 30 –60 mm 笼板适配器（Thorlabs，型号： LCP33）
31. 笼式组装杆（Thorlabs，型号： ER18 ）
32. 板（Thorlabs，型号： CPVMP）
33. 运动学光束转向笼立方体（Thorlabs，型号： DFM1-P01）
34. 燕尾光轨（Thorlabs，型号： RLA1800）
35. 60 ×物镜（Olympus APO N 60 × Oil TIRF，NA 1.49）
36. 50 ×物镜 ( Motic ULWD 50 × , NA 0.42)
37. 消色差双合透镜（ Thorlabs，型号： AC508-180-A-ML、AC254-100-AB-ML 和 AC254-030 -AB-ML ）
38. Ø 1.5" 立柱（ Thorlabs，型号： P6、P8、P10、P12、P14)
39. Robbins活检穿孔器（ Robbins Instruments，目录号：18271P）
40. Sylgard 184有机硅弹性体（Dow Silicones Corporation，目录号：04019862）
41. 波托马克激光（1450 South Rolling Road Baltimore MD，21227，美国）
42. BD-20AC 实验室电晕处理器（Electro-Technic Products，目录号：12051A）
43. 烤箱（ Thermo Scientific，型号： PR305225M）
44. 双面胶带（3M，目录号：9628B）
45. Devcon环氧树脂（Euro Tool，目录号：GLU-735.90）

软件

1. XIMEA CamTool (XIMEA)
2. MATLAB (MathWorks)
3. 斐济 ( https://imagej.net/Fiji )
4. 起源2019（起源实验室）
5. Office 365（微软）

程序

A. 设置光学排列
1. 将光学面包板放在主动隔振台上。
2. 按图 1 所示的顺序排列光学元件。下面列出了每个元件的详细信息。所有组件都使用 TR075 或 TR1 光学接杆（接杆和附件基本套件）、PH1 或 PH1.5 接杆支架和 BA1 安装底座（底座和接杆支架基本套件）固定在面包板上，具体取决于它们的尺寸。
3. 一个80 mW的激光二极管固定在一个温度受控的底座上作为光源。激光二极管由台式二极管电流控制器和温度控制器驱动。安装座通过两个 TR075 光学接杆和两个 PH1 接杆支架固定在面包板上。柱架使用 ¼”–20 × ½” 螺丝组固定在面包板上。

图 1. ESM 的光学布置。
×物镜的后焦平面上。通过手动平移台调整入射角，以达到 65° 的全内反射条件。相机还收集反射光以帮助找到目标焦点位置。来自蛋白质和玻璃表面的散射光由 50倍物镜收集，以通过第二台相机形成 ESM 图像。

4. 将一个 SM1L20C 开槽镜筒（SM1 镜筒必备套件）固定到温控安装座中。将一个AC254-030-A消色差双合透镜（Mounted Ø 1” Achromatic Lens kit）放入开槽镜筒中，用两个SM1扣环固定其位置，实现准直激光。
5. 在开槽镜筒末端固定一个 AC254-100-A-ML 消色差双合透镜（安装的 Ø 1" 消色差透镜套件）。
6. 用一个 SMR1 镜头卡口固定一个 AC254-030-A-ML 消色差双合透镜（安装的 Ø 1" 消色差镜头套件）。将镜头卡口连接到一个 TR3 光学接杆（接杆和附件必备套件），然后用另一个固定将两个 TR3 光学接杆和两个 RA90 直角接杆夹（接杆和配件必备套件）安装到一个 XR25P-K2 手动平移台上。图 2A 显示了组装零件的图片。
7. 用帽螺钉将一根 RLA1800 燕尾形光轨固定到面包板上。
8. 使用一个 TR075 光学接杆、一个 PH1 接杆支架和一个 RC2 燕尾导轨托架，将一个 DFM1-P01 运动光束转向笼立方体固定到燕尾光学导轨上。
9. 用带帽螺钉在燕尾光轨末端固定一块 CPVMP 板。
10. 修四 ER18 笼式组装杆安装在 CPVMP 板上，以构建一个 60 毫米垂直笼式系统的结构。
11. 将一个 LCP33 30 –60 mm 笼式板适配器固定到笼式装配杆上。
12. 笼式装配杆在笼式板适配器底部固定一个安装在笼式立方体上的受保护银色转向镜。
13. 一个 AC508-180-A-ML 消色差双合透镜固定到转向镜上作为显像管透镜。
14. 在消色差双合透镜的焦点处固定一台配备有一个 ND40A 反射式 ND 滤光片的摄像机（MQ013MG-CM），以监测反射光束的位置。
15. 用四个 ER025 笼式装配杆将一个动态荧光滤光片立方体固定在笼板适配器的顶部。一个半反射器设置在立方体中，以允许入射和反射光束的传输。通过将 25 mm x 36 mm 受保护的银镜切成两等份来制备一个半反射镜（25 mm x 18 mm），这可由 Thorlabs 技术支持团队定制。
16. 将另一个笼板适配器固定到运动荧光滤光片立方体顶部的笼组件杆上。将一个 SM1ZM 变焦外壳固定到板适配器上。
17. 使用 Thorlabs SM1A3TS 隔热适配器将一个 60 ×物镜固定到变焦外壳上。
18. 将办公胶带旋转并粘贴在 60 ×物镜的中间，以达到大约 34 毫米的最终直径。将一个 LCP08 笼板与一个 M2M34S 黄铜显微镜适配器固定到笼组件杆上。确保胶带圈连接到适配器表面以抑制漂移。
19. 将一个 CXY2 60 mm 笼式系统平移镜头安装座固定在物镜顶部以放置传感器芯片。
20. 将另一个 CXY2 60 mm 笼式系统平移镜头安装座固定到笼式装配杆上，并将带有 SM2 外螺纹和 SM1 内螺纹的 SM2A6 适配器固定到平移式镜头安装座上。然后，将一个 SM1ZM 变焦外壳固定到适配器上。
21. 将一个 50 ×物镜（工作距离 20.5 毫米）固定到变焦外壳上。
22. 将另一个笼板适配器固定到笼组件杆上。用四个 ER025 笼式装配杆将一个安装在笼式立方体上的受保护银色转向镜固定到适配器上。
23. 一个 AC508-180-A-ML 消色差双合透镜固定到转向镜上作为显像管透镜。
24. 将一台相机（MQ003MG-CM）固定在消色差双合透镜的焦点处，以实现 ESM 图像。

B. 准备传感器芯片
1. 使用 22 × 22 mm 盖玻片作为传感基板。
2. 在沸腾的 NH 3 ∙H 2 O、H 2 O 2和水溶液中清洁盖玻片 1 小时，以获得清洁的羟基化玻璃表面，其中滴水成为一层。
3. 盖玻片和容器用水清洗两次，用水超声波清洗两次，用氮气吹干。
4. 在沸腾的 1% APTES 中孵育羟基化盖玻片，用 IPA 稀释 3 小时，用伯胺基团对表面进行功能化。如果步骤 B2 中的干燥正确进行，则溶液和盖玻片在处理后都应该是透明的。
5. 用 IPA 清洗盖玻片和容器两次，用 IPA 超声波清洗两次，并用氮气吹干。
6. 将氨基改性盖玻片在 10 g L -1琥珀酸酐中孵育 1 小时，得到羧基官能化盖玻片。用 1 M NaOH 溶液将琥珀酸酐溶液的 pH 值调节至 7.5–8。用水清洗盖玻片和容器两次，用水超声波清洗两次，然后存放在水中备用。在实验之前，用氮气干燥盖玻片以制造流通池。
7. 要制造流通池，请准备一个 18 × 18 mm 的盖玻片，上面有两个 1 mm 的孔，可以用激光钻孔。
注意：我们向 Potomac Laser 寻求帮助。
8. 使用Sylgard 184 有机硅弹性体制备厚度为 3 mm 的 PDMS（聚二甲基硅氧烷）板。将 24 mL 有机硅弹性体溶液放入直径为 100 mm 的培养皿中，然后在烤箱中以 60 °C加热，以获得 3 mm 厚的 PDMS 板。然后，切割一个长度为 6 毫米、宽度为 3 毫米、厚度为 3 毫米的 PDMS 零件。使用 Robbins 活检打孔器在每个 PDMS 部件的中间创建一个大约 1 mm 的孔。
9. 使用实验室电晕处理器处理 18 × 18 mm 盖玻璃和 PDMS 零件的表面。然后，将 PDMS 部件连接到盖玻璃上，并将其放入 90 °C的烤箱中1 小时。
10. 将双面胶带切成小块（18 × 18 毫米），并在胶带片的中间创建一个通道（8 × 15 毫米）。将胶带片连接到 22 × 22 毫米盖玻片上，然后将 18 × 18 毫米盖玻片与 PDMS 部件连接到胶带片上。用Devcon环氧树脂密封边缘。传感器芯片的最终图片如图 2B 所示。
11. 将传感器芯片固定在 CXY2 60 mm 笼式系统上，使用定制部件翻译镜头安装座（图 2C）。
12. 使用带有柔性塑料管的针头将传感器芯片连接到一个注射器。在传感器芯片上，304 不锈钢毛细管立方体可以连接管道和 PDMS 部分。微流体球阀用于启动和停止水流。将注射器放置在高于传感器芯片的位置，重力将推动样品流到传感器表面。
13. 在实验中，表面在 40 g L -1 EDC 与 11 g L -1混合磺基-NHS 15 分钟以激活连接蛋白质的羧基。使用前使用 0.22 µm 过滤器过滤 EDC/NHS 溶液。

C. 强化体系结构
1. 除了如图 2A 所示固定在手动平移台上的镜头外，所有组件都应与SM1 或 SM2 光学管连接。
2. 使用 SM1TC 或 SM2TC 夹具将每个光学元件连接到固定在面包板上的另一个光学柱上。
3. 使用 RA90 直角夹将光学柱相互连接，并 Ø 1/2" 不锈钢光学柱（图 2D）。

数据分析

以高帧率（约 200 fps）捕获的原始图像序列被转换为平均图像序列，通过使用相机记录软件 (XIMEA CamTool )的实时平均功能每 20毫秒对图像进行平均，以抑制枪声。为了去除背景，使用斐济的图像计算器插件，通过从平均图像序列的当前帧中减去前一帧来获得差分图像序列。斐济的TrackMate插件用于查找和计数分子，并通过平均艾里斑内所有像素的功率来实现分子的 ESM 强度。按照TrackMate的操作说明，在最后一步选择“Export all spot statistics”，平均强度项是艾里斑内所有像素的功率平均的结果。 Origin 2019 用于创建数据图和直方图（图 3），并使用多峰拟合工具将直方图与高斯函数拟合。

图 2. 系统图片。
(A) 手动翻译阶段的镜头。 (B) 传感器芯片。 (C) 将传感器芯片固定到系统上的机械部件。 (D) 光学系统。

图 3. 图像强度直方图和校准。
BSA (A)、IgG (B)、IgA (C) 和 IgM (D) 蛋白的倏逝散射显微图像强度直方图，其中红色实线是高斯拟合。 (E) A-D 中不同蛋白质测量的图像强度箱形图。 (F) 倏逝散射显微镜图像强度与蛋白质直径的关系，通过对数刻度的动态光散射测量。

食谱

1. 10 克 L -1琥珀酸酐
试剂最终浓度数量
琥珀酸酐 10 克 L -1 不适用
H 2 O 不适用 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

2. NH 3 ∙H 2 O、H 2 O 2和水（体积比为1:1:5）
试剂最终浓度数量
NH 3 ∙H 2 O 15% 15 毫升
H 2 O 2 15% 15 毫升
H 2 O
全部的 70%
不适用 70 毫升
100 毫升

3. EDC-NHS 解决方案
试剂最终浓度数量
电子数据中心 40 克 L -1 不适用
NHS
PBS缓冲液 11 克 L -1
不适用不适用
1毫升
全部的不适用 1毫升

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所授予 R01GM107165 的财政支持。该协议改编自我们之前发表的作品 ( Zhang et al., 2022)。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

1. 霍莫拉，J. (2008)。用于检测化学和生物种类的表面等离子共振传感器。化学修订版 108(2)：462-493。
2. Mauranyapin , NP, Madsen, LS, Taylor, MA, Waleed, M. 和 Bowen, WP (2017)。具有量子限制精度的倏逝单分子生物传感。自然光子学11（8）：477-481。
3. Zhang, P.、Liu, L.、He, Y.、Chen, X.、Ma, K.、Wei, D.、Wang, H. 和 Shao, Q. (2018)。基于复合层的等离子体波导共振，用于具有高品质因数的无标记生物传感。传感器和执行器 B：化学272：69-78。
4. Zhang, P., Ma, G., Dong, W., Wan, Z., Wang, S. 和 Tao, N. (2020)。单个蛋白质的等离子体散射成像和结合动力学。 Nat 方法17（10）：1010-1017。
5. Zhang, P., Ma, G., Wan, Z. 和 Wang, S. (2021)。用棱镜耦合等离子体散射成像对复杂介质中的单分子蛋白结合动力学进行量化。 ACS Sens 6(3)：1357-1366。
6. Zhang, P.、Zhou, L.、Wang, R.、Zhou, X.、Jiang, J.、Wan, Z. 和 Wang, S. (2022)。单蛋白结合动力学和 DNA 构象变化的倏逝散射成像。国家通讯13（1）：2298 。