材料和试剂

1. 0.22 µm 滤光片（Genesee Scientific，目录号：25-227 或同等产品），室温储存
2. PCR管（ Thermo Fisher Scientific，Eppendorf，目录号：E0030124286或等效物），室温储存
3. 14 mL 培养管（ Thermo Fisher Scientific，Falcon，目录号：14-959-1B 或同等产品），室温储存
4. 50 mL 管（ Thermo Fisher Scientific，Genesee Scientific Corporation，目录号：NC1259986 或同等产品），室温储存
5. 50 mL 反应管（Greiner Bio-One CELLSTAR ® CELLreactor锥形底部聚丙烯过滤器顶管 227245 或同等产品）
6. 1.7 mL 微管（ Thermo Fisher Scientific，Genesee Scientific Corporation，目录号：NC2045332 或等效物），室温储存
7. 血清移液管（ Thermo Fisher Scientific，Genesee Scientific Corporation，目录号：NC0631030 或同等产品），室温储存
8. 摇瓶（ Thermo Fisher Scientific，PYREX，目录号：09-552-32 或等效物），在室温下储存
9. 培养皿（Genesee Scientific，目录号：32-107G 或同等产品），室温储存
10. 96 孔深孔板（VWR International，目录号：10755-248 或同等产品），室温储存
11. 移液器吸头（Genesee Scientific，目录号：23-130RL & 24-150R & 24-160RS 或同等产品），室温保存
12. 电穿孔比色皿1 mm（Genesee Scientific，目录号：40-100），室温储存
13. 无核酸酶水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J71786.K2 或等效物），在室温下储存
14. Virkon（ Virkon TM S 广谱消毒剂，Chemours），室温储存
15. L-阿拉伯糖（ Teknova ，目录号：A2010 或等效物），室温储存
16. 氯仿（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J67241.AP 或等效物），室温储存
17. 盐酸无水四环素（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J66688.MB或等效物），储存在-20°C
18. 葡萄糖（D-葡萄糖）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：D16-1 或等效物），在室温下储存
19. OneTaq 2 × Master Mix with Standard Buffer（New England Biolabs，目录号：M0482S 或同等产品），-20 °C 储存
20. Q5 定点诱变试剂盒（New England Biolabs，目录号：E0554S 或同等产品），-20°C 储存
21. Q5 Hot Start High-Fidelity 2 × Master Mix（New England Biolabs，目录号：M0494S 或同等产品），储存于 -20 °C
22. SGI-DNA Gibson Assembly ® (GA) HiFi 1-Step Kit（CODEX DNA, Inc.，目录号：GA1200），储存于 -20 °C
23. NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，目录号：E2621S），储存在-20°C
24. NEB ® 5-α 感受态大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C2987H 或等效物）。储存在-80°C。
25. NEB ® 10-beta Competent E.coli （New England Biolabs，目录号：C3019H 或同等产品）。储存在-80°C。
26. LB肉汤（ Thermo Fisher Scientific，BD Difco ，目录号：DF0446-07-5或等效物），室温储存
27. 氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A0166-25G 或等效物），室温储存
28. 氯霉素（VWR，目录号：97061-244 或等效物），室温储存
29. 霉素单硫酸盐（TCI America，目录号：K0047 或等效物），室温储存
30. 六水合氯化镁（VWR，目录号：BDH9244-500G 或等效物），室温储存
31. 二水合氯化钙（ Thermo Fisher Scientific，目录号：C79-500或等效物），室温储存
32. TAE缓冲液（Tris-Acetate-EDTA）50 × （ Thermo Fisher Scientific，目录号：BP133220或同等产品），室温储存
33. 凝胶上样染料（New England Biolabs，目录号：B7024S 或等效物），室温储存
34. SYBR TM Safe DNA Gel Stain（ Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：S33102 或同等产品），室温储存
35. Quick- Load® 1 kb Plus DNA Ladder（New England Biolabs，目录号： N0469S或同等产品），室温储存
36. DpnI （New England Biolabs，目录号：R0176S 或同等产品），储存于-20°C
37. 琼脂糖（ Thermo Fisher Scientific，Lonza Inc，目录号：BMA50004 或等效物），在室温下储存
38. 质粒小量制备试剂盒（ Zyppy Plasmid Miniprep Kit， Zymo Research，目录号：D4019 或等效物），室温储存
39. DNA Library Prep Master Mix（New England Biolabs，目录号：E6040S 或同等产品），储存在 -20 °C
40. QIAamp DNA Kit（Qiagen，目录号：56304），室温储存
41. DNA Clean and Concentrator-5 试剂盒（ Zymo Research，目录号：D4004 或等效物），室温储存
42. 1 × DPBS（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：14-190-136 或同等产品），室温储存
43. 甘油（ Thermo Fisher Scientific，目录号：G33-4 或等效物），在室温下储存
44. 柠檬酸钠三水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C7254-1KG或等效物），室温储存
45. Super Optimal Broth（ Thermo Fisher Scientific， Bioworld ，目录号：50-254-370或等效物），室温储存
46. 噬菌粒骨架（ Addgene ，目录号：40782）
47. MP6质粒（ Addgene ，目录号：69669）
48. aTc诱导型启动子（ Addgene ，目录号：108529）
49. aTc-MP6质粒（ Addgene ，目录号：189935）
50. 引物 #1：用于扩增噬菌粒骨架的正向引物： aggatccgaggcttggattc
51. 引物 #2：用于扩增噬菌粒骨架的反向引物： atgagatctctatgctactc
52. 引物#3：诱变操纵子正向引物： acccgtttttttggacgcgt
53. 引物 #4：诱变操纵子反向引物： agtcaaaagcctccgaccgg
54. 引物 #5：CloDF13 正向引物： tacgtgccaagccaaatag
55. 引物 #6：CloDF13 反向引物： ggctgacttcaggtgctaca
56. 引物 #7： pTet和KanR正向引物： cagtggaacgaaaaatcaat
57. 引物 #8： pTet和KanR反向引物： tcagtatctctatcactgat
58. 引物 #9： TetR正向引物： ctcggtaccaaattccagaa
59. 引物 #10： TetR反向引物： ctcacttccctgttaagtat
注意：引物/寡核苷酸可从 Eurofins Genomics 或同等供应商处订购
60. 氨苄青霉素钠盐（100 mg/mL）（见食谱）
61. 氯霉素（34 mg/mL）（见食谱）
62. 卡那霉素单硫酸盐（50 mg/mL）（见食谱）
63. 10% 甘油（见食谱）
64. LB 媒体（见食谱）
65. PLM（参见食谱），在室温下储存
66. ePLM （参见食谱），室温储存
67. 含有 200 mM 柠檬酸钠的葡萄糖 (SOC) 超级最佳肉汤（参见食谱）

设备

1. iSeq 100 或同等产品（Illumina，目录号：20021532）
2. -80 °C冰箱（ Thermo Fisher Scientific，Revco RLE 系列，型号：RLE50086A）
3. -20 °C冰箱（ Thermo Fisher Scientific， Isotemp ，型号：20LFEEFSA）
4. 4 °C冰箱（Jordon Refrigeration）
5. 酶标仪（Agilent BioTek ，Synergy H1，目录号：11-120-535）
6. I26 振荡培养箱（New Brunswick Scientific，Eppendorf，部件号：M1324-000）
7. 对流培养箱（VWR，Symphony，部件号：414004-610）
8. 孵育微孔板振荡器（ Thermo Fisher Scientific，目录号：02-217-759）
9. 离心机（ Thermo Fisher Scientific， Sorvall Legend X1R，目录号：75004261）
10. 微量离心机（ Thermo Fisher Scientific， Sorvall Legend Micro 21R，目录号：75-002-446）
11. 迷你离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号：05-090-100）
12. Thermocycler（Eppendorf， Mastercycler nexus eco，目录号： 6330000021）
13. 梯度热循环仪（Eppendorf， Mastercycler nexus gradient，目录号：6331000025）
14. 单通道可调移液器，0.01 – 1,000 µL (Eppendorf)
15. 多道可调移液器 1 – 1,000 µL (Eppendorf)
16. 流式细胞仪（BD Biosciences， Accuri TM C6 Plus，目录号：660517）
17. 数字干浴加热块（Benchmark Scientific，型号：BSH1001）
18. MicroPulser Electroporator（Bio-Rad，目录号：1652100）
19. 分光光度计（ Thermo Fisher Scientific， NanoDrop TM 2000c，目录号：ND-2000C）
20. DNA 电泳槽（Bio-Rad，Mini-Sub Cell GT Tray，目录号：1664400EDU）
21. DNA 电泳电源（Bio-Rad， PowerPac TM Basic，目录号：1645050）
22. 凝胶成像仪（Bio-Rad，Gel Doc TM EZ 成像仪，目录号：170-8270）

软件

1. Samtools （BSD，麻省理工学院， http: //www.htslib.org/ ）
2. BCFtools (BSD, MIT, http://www.htslib.org/ )
3. VarScan ( http://varscan.sourceforge.net/ )
4. 领结（ http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml ）
5. Benchling ( https://www.benchling.com ) 或同等质粒管理软件

程序

A. 噬菌粒 (PM) 的构建
使用 Gibson 组装（或任何适当的克隆技术）构建包含感兴趣途径的噬菌粒。
1. 噬菌粒 ( Addgene #40782) 用作所有噬菌粒克隆的骨架，因为没有插入物，它会由于产生紫罗兰素而将大肠杆菌菌落变为紫色。
a. 引物 #1：用于扩增噬菌粒骨架的正向引物： aggatccgaggcttggattc
b. 引物 #2：用于扩增噬菌粒骨架的反向引物： ctatgctactccatcgagcc
使用tmcalculator.neb.com计算退火温度。
2. 设计引物以放大在片段之间引入至少 20 bp 同源性的插入物（有关说明，请参见 NEB Gibson 组装协议）。
3. × Master Mix扩增骨架和 DNA 插入片段（20 – 30 ng 模板），然后运行凝胶检查扩增片段的大小。噬菌粒骨架扩增为 6.5 kbp 。使用tmcalculator.neb.com计算退火温度。
4. 在每个 PCR 反应中加入 1 μL DpnI ， 37 ° C孵育 2 h。该反应将消化模板 DNA。
5. 根据制造商的说明使用 Clean and Concentrator-5 试剂盒纯化 PCR 反应，并使用NanoDrop分光光度计测量浓度。
6. NEBuilder HiFi DNA 组装预混液或 SGI-DNA Gibson组装将骨干和插入物组装在一起，但在 50°C 的热循环仪中孵育样品 30 分钟而不是 15 分钟除外。
7. 根据制造商的说明，将吉布森反应转化为 NEB 5-α 或 10-β 主管大肠杆菌细胞，并使用氯霉素选择过夜。
8. 菌落 PCR 白色菌落（紫色菌落是噬菌粒骨架）以验证克隆是否成功。菌落 PCR 在质粒提取之前检查成功的克隆。根据制造商的说明在 PCR 反应中混合单个菌落。 PCR 反应制备如下：0.5 µL 10 µM 正向引物、0.5 µL 10 µM 反向引物、12.5 µL OneTaq 2 × Master mix 和 11.5 µL 无核酸酶水。使用tmcalculator.neb.com计算引物的退火温度。使用 NEB OneTaq Hot Start High-Fidelity 2 × Master 扩增连接，并在凝胶中进行 PCR 反应以验证扩增大小。成功的扩增被发送到 Sanger 测序。然后在摇动培养箱（37 °C，250 rpm）中，用适当的抗生素在 2 mL LB 中培养经过 Sanger 测序的验证结构过夜。根据制造商的说明，使用Zyppy Plasmid Miniprep Kit从过夜培养物中提取质粒。然后可以使用全质粒测序服务对准备好的质粒进行测序，例如质粒saurus ( www.plasmidsaurus.com/ )。

B. 构建诱变质粒 (MP) – aTc-MP6 质粒 ( Addgene #189935)
如下构建了无水四环素诱导的诱变质粒( aTc -MP)：
1. 从 L-阿拉伯糖诱导型 MP6 质粒 ( Addgene #69669) 中扩增诱变操纵子（danQ926、dam、 seqA 、 emrR 、 ugi和 cda1）和复制起点 (CloDF13)。
a. 引物#3：诱变操纵子正向引物： acccgtttttttggacgcgt
b. 引物 #4：诱变操纵子反向引物： agtcaaaagcctccgaccgg
c. 引物 #5：CloDF13 正向引物： tacgtgccaagccaaatag
d. 引物 #6：CloDF13 反向引物： ggctgacttcaggtgctaca
2. 从 pAJM.011 ( Addgene #108529) 中扩增无水四环素诱导系统 ( pTet和TetR ) 和卡那霉素抗性基因 ( KanR )。
a. 引物 #7： pTet和KanR正向引物： cagtggaacgaaaaatcaat
b. 引物 #8： pTet和KanR反向引物： tcagtatctctatcactgat
c. 引物 #9： TetR正向引物： ctcggtaccaaattccagaa
d. 引物 #10： TetR反向引物： ctcacttccctgttaagtat
3. 根据制造商的说明使用NEBuilder HiFi 组装片段。
4. 根据制造商的说明，将组装反应转化为 NEB 10-beta 主管大肠杆菌细胞。
5. 在含有卡那霉素和 1% 葡萄糖的 LB 琼脂板上生长转化。葡萄糖用于抑制诱变操纵子。
6. 菌落 PCR（参见噬菌粒的构建部分） 5 – 10 个菌落以验证克隆是否成功。使用 NEB OneTaq Hot Start High-Fidelity 2 × Master 扩增连接，并在凝胶中进行 PCR 反应以验证扩增大小。成功的扩增被发送到 Sanger 测序。然后在摇动培养箱 (37 °C, 250 rpm) 中在含有卡那霉素和 1% 葡萄糖的 LB 中培养经 Sanger 测序验证的构建体过夜。根据制造商的说明，使用Zyppy Plasmid Miniprep Kit从过夜培养物中提取质粒。然后可以使用全质粒测序服务对准备好的质粒进行测序，例如质粒saurus ( www.plasmidsaurus.com/ )。
7. 然后可以将经过序列验证的 aTc-MP6 转化到含有 P1 噬菌体的大肠杆菌C600 中（可根据 Crook Lab 的要求提供）。含有 P1 噬菌体和aTc -MP 的大肠杆菌C600是构建多样化菌株的起点。

C. 电感受态细胞的制备和转化以产生多样化菌株
1. 将选定的多样化菌株（含有诱变质粒和 P1 噬菌体的大肠杆菌C600 菌株）接种到含有 50 μg/mL 卡那霉素的 2 mL LB 培养基中，并在摇动培养箱（37°C，250 rpm）中生长过夜。
2. 500 μL的过夜培养物稀释到 50 mL 的 LB 介质（1:100 稀释）中，并在摇动培养箱（37°C，250 rpm）中生长至 OD 600 = 0.8。
3. ，在冰上冷却10-15 分钟。
4. 在 3,000 × g和 4 °C 下旋转细胞 5 分钟。
5. 在 25 mL 的冰冷 10% 甘油中去除上清液并重新悬浮颗粒。
6. 在 3,000 × g和 4 °C 下旋转细胞 5 分钟。
7. 重复步骤 5 – 6 两次（共 2 次洗涤）。如果在电穿孔过程中出现电弧问题，请重复多次。
8. 将洗涤过的细胞重新悬浮在微量离心管中 1 mL 的 10% 甘油中，并在 3，000 × g和 4 °C 下旋转 3 分钟。
9. 在 0.5 mL 的 10% 甘油中重新悬浮颗粒。
10. 将电穿孔比色皿放在冰上 2 分钟。
11. 将 50 μL的细胞转移到冷冻的微量离心管中。添加 1 μL的噬菌粒 DNA (>50 ng)。
12. 小心地将细胞/DNA 混合物转移到冷冻比色皿中，不要引入气泡，并确保细胞沉积在比色皿底部。
13. 在电穿孔器（例如，Bio-Rad EC1）上用转化混合物电穿孔比色皿。成功转换的时间常数应为 5.0 – 6.0 ms 。
14. 立即将 1 mL 的 Super Optimal Broth (SOC) 培养基添加到电穿孔比色皿中，通过上下移液混合，然后转移到 1.5 mL 离心管中。
15. 将转化反应置于摇动培养箱（37°C，250 rpm）中 1 小时。
16. × g离心2 分钟，然后在 100 μL DPBS 中重新悬浮细胞。
17. 将细胞铺展到预热的选择性板（例如，LB + 卡那霉素 +氯霉素），并在 37°C 下孵育过夜。

D. 诱变的诱导
1. 接种到培养管中含有卡那霉素和氯霉素（无葡萄糖，1:100 稀释）的 2 mL LB 中。
2. 亚接种培养物中添加 200 ng/ μL aTc （2 μL的 100 ng/ μL aTc ）来诱导诱变。
3. 根据所需的突变率（每代每 bp 3.4 × 10-7替换），在摇动培养箱（37 °C，250 rpm）中生长诱导培养 8-16小时。
a. 对于 IDE 的第一个周期，从一个菌落开始过夜培养。
b. 对于 IDE 的第 2 周期及以后，从感染多样化菌株后的一夜之间生长的混合种群开始。

E. 噬菌体生产
1. 在诱变步骤（包含 P1、 aTc -MP 和噬菌粒）或筛选/选择步骤（包含 P1 和噬菌粒）后将2 μL菌株接种到 2 mL 含有氯霉素的 LB 培养基中，并在摇晃中生长过夜培养箱（37 °C，250 rpm）。
2. 150 μL的 O/N 培养物稀释到 15 mL 的ePLM （1:100 稀释）中，并在摇动培养箱（37 °C，250 rpm）中生长至 OD 600 = 0.8 – 1.0。
3. 添加 150 μL的 20% L-阿拉伯糖（1/100 培养体积），然后放回摇动培养箱（37°C，250 rpm）中 2 小时。文化应该澄清，如图 2 所示。
4. 将培养物转移到 50 mL 离心管中，并加入 400 μL氯仿（2.5:100 体积）。
5. 将管子放在冰上 5 分钟，每 1 分钟轻轻混合或移液一次。
6. 在 3,000 × g和 4 °C 下离心 10 分钟，然后将上清液转移到无菌管中储存。噬菌体裂解物在 4 °C 下稳定 1 年，在 -80 °C 下无限期稳定。

图 2. 噬菌体产生前后的细胞培养。
上图：将诱变步骤或筛选/选择步骤后的菌株再接种到新鲜的ePLM 中并生长至 OD 600 = 1.0。底部：用 L-阿拉伯糖诱导 2 小时后裂解细胞培养物。

F. 噬菌体感染
1. 将含有 P1 的筛选/选择菌株接种到 2 mL 的 LB 培养基中用于筛选步骤或含有卡那霉素的 LB 培养基用于多样化步骤，并在摇动培养箱（37°C，250 rpm）中生长过夜。
2. 隔夜培养接种到ePLM （ 1:100 稀释）中，并在摇动培养箱（37°C，250 rpm）中生长至 OD 600 = 1.0。
3. 在 3,000 × g和 4 °C 下离心 5 分钟，然后将颗粒重新悬浮在 1/3 体积的新鲜ePLM中。
4. 在 14 mL 培养管中将 1 mL 的细胞与 1 mL 的噬菌体裂解液混合。
5. 将感染混合物放入常设培养箱（37 °C）中 20 分钟，然后在摇动培养箱（37 °C，250 rpm）中再放置 20 分钟。
6. 将含有 200 mM 柠檬酸钠的 1 mL SOC 添加到感染反应中以淬灭感染。将反应置于摇动培养箱（37°C，250 rpm）中 1 小时。
7. 为了消除未感染的细胞，将感染反应转移到 50 mL 含有卡那霉素和氯霉素的 LB 培养基用于多样化步骤或含有氯霉素的 LB 琼脂板用于筛选步骤。
8. 要计算感染的库大小，请在含有适当抗生素的 LB 琼脂板上点板。
a. 在 96 孔板中，使用ePLM对感染反应进行连续稀释。进行五次稀释，从 1:10 到 1:10 5 。将 180 μL的ePLM添加到 AE 行。在 A 行中，添加 20 μL的感染反应。通过将 20 μL的先前稀释液添加到下一行来执行其余的稀释液。确保充分混合并在每次稀释后更换移液器吸头。此步骤可以使用多通道移液器完成。
b. 使用多通道移液器，在含有卡那霉素和氯霉素的 LB 琼脂板上进行 5 μL的每个感染反应稀释，用于多样化步骤或含有氯霉素的 LB 琼脂板用于筛选步骤。
c. 在常设孵化器 (37 °c) 中过夜孵化斑点板。
d. 早上计算 CFU/mL 以确定库大小。请记住将计数的菌落数乘以对应于该行的稀释因子以获得 CFU/ mL。
9. 要检查噬菌体生产和感染步骤是否正确进行，请运行以下控制：
a. 用另一种已经产生预期文库大小的噬菌体裂解物感染所需的菌株。这种控制将确定噬菌体生产或感染是否失败。
b. 在含有氯霉素或卡那霉素的 LB 琼脂板上培养未感染的细胞，以测试受感染的菌株是否对任一抗生素具有抗性。

G. 将 P1 噬菌体引入无 P1 菌株中以用于所需的筛选菌株
1. 从含有 P1 和噬菌粒的菌株中产生噬菌体裂解物。
2. 诱导噬菌体产生（参见章节：噬菌体产生）。
3. 感染感兴趣的菌株（参见章节：噬菌体感染）。
4. 在标准尺寸的 LB 琼脂板上进行10 μL的感染反应，以获得单菌落。
5. 使用 P1 特异性引物（片段大小 296 bp）筛选 P1 的 10 – 20 个菌落：
a. 正向引物： ACGACCATGAAAGCCTCTTCACCCGTAG
b. 反向引物： GCTTATTCGCACCTTCCCTAAAAACAAAGATGTTTGTAG
注意：要提高 P1 对新菌株的感染效率，请使用 1:10细胞：按体积计算的噬菌体裂解物。请注意，对于先前讨论过的含噬菌粒颗粒的感染，该比率会有所不同。

H. 筛选/选择
1. 新感染的筛选/选择菌株直接从上一步使用。
2. 筛选/选择步骤因应用而异。
a. 示例 1：基于生长的选择以提高特定糖的利用率。
i. 确保筛选/选择菌株在含有糖作为唯一碳源的基本培养基中实现低但非零的生长速率。
ii. 通过在含有糖作为唯一碳源的基本培养基中培养文库来选择改进的变体。
iii. Subinoculate培养2-5次以选择快速生长的菌株，然后再转移回多样化菌株。没有转移的重复子接种存在选择具有基因组突变的菌株的风险。
b. 实施例 2：用于增加分子或蛋白质产量的生物传感器筛选。
i. 在筛选/选择菌株中加入一个生物传感器，将生产力与荧光相结合，其中野生型生产力保持在生物传感器的线性范围内。
ii. 在有利于生物分子生产的条件下培养筛选/选择菌株。
iii. 通过荧光激活细胞分选 (FACS) 筛选高产变体。
iv. 如上所述，在转移回多样化菌株之前，可以通过 FACS 多次培养和重新分类分离的变体。
3. 重复诱变、噬菌体产生、噬菌体感染和筛选/选择步骤，直到找到满意的变体。

I. 筛选完成后
1. 可以从筛选/选择的文库中提取质粒并用于下一代测序以测量常见突变的频率。 Illumina iSeq 100 用于实现 80 – 100 ×测序深度。可以使用可以达到类似测序深度的其他测序机器和服务。 Illumina 全基因组测序试剂盒和 IDT ® for Illumina ® DNA/RNA UD Indexes 用于文库制备和测序。等效的 NGS 引物可用于索引不同的样品。也可以使用通过质粒saurus ( www.plasmidsaurus.com/ )进行的基于质粒或扩增子的测序。
a. 使用Trimmomatic修剪读取。
b. 使用 Bowtie2 对齐修剪后的读数。
c. VarScan识别突变。
d. 下面提供了一个示例计算管道：
#!/ bin/bash

##修剪读取
java -jar trimmomatic-0.38.jar PE Mel1_R 1.fastq R2.fastq R1_F_P.fastq R1_F_U.fastq R1_R_P.fastq R1_R_U.fastq ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10:2:keepBothReads LEADING:3 TRAILING: 3 分钟：36 滑动窗口：4:15

##映射到我们的基因组
bowtie2-build -f PM.fasta 质粒序列
bowtie2 --very-sensitive --end-to-end -x质粒序列 -1 R1_F_ P.fastq -2 R1_R_P.fastq -U R1_F_U.fastq,R1_R_U.fastq -S R1.sam

samtools排序 -m 10G -o R1.bam -T R1 R1.sam

samtools索引 -b R1.bam

山姆工具 mpileup -f PM.fasta -d 0 R1.bam -o variables.pileup

##调用变体
java -jar VarScan.v2.3.9.jar mpileup2snp variables.pileup --min -var- freq 0.0001 > snps.txt
java -jar VarScan.v2.3.9.jar mpileup2indel variables.pileup --min -var- freq 0.0001 > indels.txt

2. 可以从单个分离物中提取质粒并用于全质粒测序。
https://www将全质粒测序结果与野生型序列对齐以查找分离变体中的突变。 benchling.com或同等工具。
3. 请注意，噬菌粒骨架可能会在筛选过程中积累突变，从而可能影响其拷贝数。为了直接比较进化途径与野生型，进化途径可以克隆到新鲜的噬菌粒骨架中，或者两者都进化，野生型途径可以整合到基因组中。
4. 可以使用额外的分析（例如，在 96 孔板中的生长或在摇瓶中的生产力，然后进行 HPLC 分析）将单个分离物的性能与含有野生型噬菌粒的筛选/选择菌株进行比较。
5. 最高效的变体可以按原样使用，也可以接受额外的 IDE 轮次。

附录 1：电泳凝胶
使用 1% 琼脂糖凝胶确认克隆和 PCR 扩增。
1. 通过加热至沸腾，将300 mg 琼脂糖溶解在 30 mL 的 1 × TAE 缓冲液中。
2. 加入 3 μL SYBR Safe DNA 凝胶染料。
3. 将凝胶倒入带有梳子的凝胶托盘中并使其凝固。
4. 用 5 μ L Quick-Load 1 kb Plus DNA Ladder 在 120 V 下运行加载的凝胶 25 – 30 分钟。电源由BioRad提供 PowerPac ，凝胶在BioRad DNA 电泳室中运行。
5. 使用 Gel Doc EZ Imager 或同等设备对凝胶进行成像。

附录 2：处理噬菌体的最佳实践：
1. 所有含有噬菌体裂解物的步骤都应在 BSL2 罩中进行，以避免污染其他大肠杆菌实验。尽可能将您的 P1 工作与其他项目隔离开来。这可以通过为涉及噬菌体的项目指定单独的工作台空间和材料来完成。
2. 移取 P1 噬菌体裂解物时使用过滤器吸头。
3. 处理噬菌体后，使用 Virkon 擦拭所有表面和工具。
4. 将噬菌体裂解物储存在螺旋盖的15 或 50 mL离心管中。感染和噬菌体生产也在这些试管中进行。
5. 如果可能，将 P1 裂解物储存在不用于其他大肠杆菌实验的 4°C 冰箱中。
6. 不要保留含有 P1 的旧细菌板，因为噬菌体可以在静止菌落中开始裂解（4 °C 下<1 周）。

食谱

1. 氨苄青霉素钠盐 (100 mg/mL)
将 5 克氨苄青霉素溶解到 50 mL 的 ddH 2 O 猎鹰管中，并通过 0.22 μm 过滤器进行消毒。等分 1 mL 并储存在 -20 °C（在 LB 或 LB-Agar 中以 1:1000 稀释使用）。
2. 氯霉素 (34 毫克/毫升)
在 50 mL Falcon 管中将 1.7 g 氯霉素溶解到 30 mL 100% 乙醇中，并用 100% 乙醇将体积增加到 50 mL。将 1 mL 等分到微量离心管中，并储存在 -20 °C（在 LB 或 LB-Agar 中以 1:1,000 稀释使用）。
3. 卡那霉素单硫酸盐(50 mg/mL)
2.5 g 卡那霉素单硫酸盐添加到 30 mL 的 DI 水中，然后用 DI 水将体积增加到 50 mL。通过 0.22 µm 过滤器过滤以进行消毒。将 1 mL 等分到微量离心管中，并储存在 -20 °C（在 LB 或 LB-Agar 中以 1:1,000 稀释使用）。
4. 10% 甘油
试剂最终浓度数量
甘油 10% 10 毫升
无核酸酶 H 2 O 不适用 90 毫升
全部的不适用 100 毫升

5. LB媒体
将 25 g/L 的 LB 肉汤溶解在 DI 水中，并在 121°C 下对最终溶液进行高压灭菌 20 分钟。拧紧盖子，完全冷却后在室温下储存。
6. 生命周期管理
将最终溶液在 121°C 高压灭菌 20 分钟。
试剂最终浓度数量
LB肉汤不适用 25 克
MgCl 2 ·6H 2 O 100 毫米 20.3 克
CaCl 2 ·2H 2 O 5毫米 0.7 克
H 2 O 不适用 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

7. ePLM
将最终溶液在 121°C 高压灭菌 20 分钟。
试剂最终浓度数量
LB肉汤不适用 25 克
MgCl 2 ·6H 2 O 140 毫米 28.4 克
CaCl 2 ·2H 2 O 7毫米 1克
H 2 O 不适用 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

8. 含有 200 mM 柠檬酸钠的葡萄糖 (SOC) 超级最佳肉汤
试剂最终浓度数量
超优肉汤不适用 28 克
柠檬酸钠三水合物 200 毫米 58.8 克
H 2 O 不适用 1升
全部的不适用 1升

高压釜一旦溶解。在加入 20 mL 的 1 M MgSO 4和 20 mL 的 1 M 葡萄糖之前，让溶液冷却至 50 °C 或更低。在室温下储存。

致谢

我们感谢 Christopher Anderson 博士（加州大学伯克利分校）的实验室提供噬菌粒构建体（ Addgene #40782），David R. Liu 博士（哈佛大学）提供 MP6 质粒（ Addgene #69669），以及 Chase Beisel博士提供野生型和工程化的 P1 噬菌体。
该协议已改编自Al'Abri等人。（2022 年）。

利益争夺

ISA 和 NC 正在申请与这项工作相关的专利。

参考

1. Al'Abri , IS, Haller, DJ, Li, Z. 和 Crook, N. (2022)。细菌中复杂表型的可诱导定向进化。核酸研究 50（10）：e58 。
2. Crook, N., Ferreiro , A., Gasparrini , AJ, Pesesky , MW, Gibson, MK, Wang, B., Sun, X., Condiotte , Z., Dobrowolski, S., Peterson, D. 等。（2019）。哺乳动物肠道中候选益生菌大肠杆菌 Nissle 的适应性策略。细胞宿主微生物25（4）：499-512。
3. Esvelt , KM, Carlson, JC 和 Liu, DR (2011)。生物分子连续定向进化的系统。自然472（7344）：499-503。
4. Wang, HH, Isaacs, FJ, Carr , PA, Sun, ZZ, Xu, G., Forest, CR 和 Church, GM (2009)。通过多重基因组工程和加速进化对细胞进行编程。自然460（7257）：894-898。