材料和试剂

下面提供的所有目录号应作为指导；也可以使用替代来源。

材料
2 mL一次性注射器（Henry Schein，目录号：9003017）
移液器吸头 10 µL、200 µL 和1、000 µL（ Sarstedt ，目录号：70.760.002、70.3030.020 和 70.3050.020）
反应管 1.5 mL、2 mL、15 mL 和 50 mL（ Sarstedt ，目录号：72.690.001、72.691、62.554.502 和 62.547.254）
玻璃珠，3 mm（ Supelco ，目录号：1040150500）
圆底玻璃管（Roth，目录号：NY90.1）
螺帽，ND8（Roth，目录号：NL96.1）
螺纹颈 ND8 小瓶（Roth，目录号：KE27.1）
Sterican一次性26号针头，0.45 × 12 mm（Braun，目录号：4665457）

化学品
氯仿，乙醇稳定并证明不存在光气和 HCl（Roth，目录号：7331.2）
甲醇（VWR，目录号：20847.307）
4-吗啉丙磺酸，3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）（Sigma，目录号：M3183）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：34943）
KOH（Fisher Chemical，目录号：P/5640/60）
K 2 SO 4 （VWR，目录号：26997.293）
乙酸钠（ Sigma，目录号：S2889）
2-（ N-吗啉代）-乙磺酸（MES）（Roth，目录号：4256.2）
甘油（VWR，目录号：24388.295）
KCl （霍尼韦尔，目录号：31248）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma，目录号：E6758）
苏-1,4-二巯基-2,3-丁二醇（DTT）（Sigma，目录号：43819）
液氮
N-十二烷基β-麦芽糖苷（ DDM）（ Glycon ，目录号：D97002）
正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）（ Glycon ，目录号：D97001）
Sephadex G50，精细（ Cytiva ，目录号：17004201）
BioBeads （Bio-Rad，目录号：152-3920）。
溴酚蓝（Roth，目录号：A512.3）
Tris（Sigma，目录号：T1503）
蔗糖（Fisher Chemical，目录号：S/8600/60）
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Merck，目录号：8.08742.0250）
过二硫酸铵（APS）（Roth，目录号：9592.2）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma，目录号：L3771）
硫酸铝水合物（Roth，目录号：3731.1）
无水乙醇≥ 99.8%（VWR，目录号：20821.321）
丙烯酰胺（Roth，目录号：3029.1）
正磷酸（VWR，目录号：20624.295）
考马斯亮蓝G-250（ Serva ，目录号：35050）
PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder，10-250 kDa （ Thermo Scientific，目录号：26619）
重组缓冲液（见配方）
蛋白质储存缓冲液（见配方）
1 M OG 库存（见食谱）
0.5 M DTT 库存（见配方）
Sephadex G50 细浆（见配方）
预洗的BioBeads （参见食谱）
Laemmli 缓冲液（参见食谱）
20% SDS 库存（见配方）
SDS-PAGE 电泳缓冲液（参见配方）
SDS 凝胶（见配方）
10% APS 库存（见食谱）
1 M Tris（见食谱）
胶体考马斯染色溶液（见配方）
胶体考马斯脱色溶液（见配方）

脂质
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850457）
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油）（钠盐）（POPG）（Avanti Polar Lipids，目录号：840457）

DMSO 中的 SNAP 染料
SNAP-Surface Alexa488（New England BioLabs Inc.，目录号：S9129S）
SNAP-细胞 647-SiR（New England BioLabs Inc.，目录号：S9102S）
SNAP-Surface 647（New England BioLabs Inc.，目录号：S9136S）和 SNAP-Cell Oregon Green（New England BioLabs Inc.，目录号：S9104S）也已成功进行该测定

设备

分析天平（Sartorius Entris-i II，220 g/0.1 mg，Buch Holm，目录号：4669128）
Avanti 迷你挤出机套件（Avanti Polar Lipids，目录号 610000 ）
用于挤出机的过滤器支架（聚酯排水盘，10 mm； Cytiva ，目录号：230300）
用于挤出机的膜 200 nm（ Cytiva ，目录号：10417004）
1,000 μL气密注射器（Avanti Polar Lipids ，目录号：610017）
用于 15 和 50 mL 聚丙烯管的带转子离心机（Eppendorf 5810 R； Wesseling ，德国）
Chemidoc MP 成像系统 (Bio-Rad)，照明波长分别为 460 – 490 nm 和 520 – 545 nm，发射滤光片分别为 530/28 nm 和 695/55 nm。
Eppendorf Research ® plus 移液器 P2.5、P20、P200 和 P1000（Eppendorf，目录号：3123000012、3123000039、3123000055 和 3123000063）
玻璃干燥器Boro 3.3，盖子上有插座，20 cm，包括旋塞阀（BRAND GmbH，目录号：65238）
Hamilton 700 系列注射器 25 µL、100 µL 和 1,000 µL（Hamilton Company，内华达州，美国）
头顶式转动装置（ neoLab ，目录号：7-0045）
Mini-PROTEAN ® Tetra 细胞系统（Bio-Rad，目录号：1658000）
R -100、SJ29/32、V、220–240V的真空泵 V-100 （ Buchi ，目录号：11593636、11593655D 和 11100V111、11061895）
涡流混合器（Scientific Industries Inc.，型号：Vortex Genie 2，目录号：SI-0236）
水浴（ Julabo ，CORIO C-BT5，目录号：9011305）

软件

ImageLab 软件版本 5.2.1 (Bio-Rad)

程序

当使用不基于此处描述的预制脂质体的其他脂质体重组程序时，请跳过 A 和 B 部分并从 C 部分开始。

脂质体制备
由于脂质会粘在塑料器皿上，因此必须使用玻璃器皿直到脂质体形成。此外，氯仿可以从塑料器皿中提取成分，增强了使用玻璃器皿的必要性。玻璃管和 Hamilton 注射器用于脂质膜的制备。为了减少移液过程中不必要的氯仿蒸发，脂质储存在冰上处理。
注意：氯仿是一种危险溶剂。穿着适当的防护服，在通风橱中进行所有工作。

脂质在氯仿中接收包装在密封的玻璃安瓿瓶中；储存在 -20 °C 直至使用。
注意：对于长期储存，蒸发溶剂并将脂质储存在-80°C，以避免不饱和脂质的氧化。
要制备脂质储备，将 10 mg 等分试样从 Avanti 玻璃安瓿转移到玻璃螺旋颈小瓶中。在 250 毫巴的干燥器中蒸发玻璃瓶中的溶剂 3 小时，在 30 毫巴下再孵育 1 小时。用螺帽关闭小瓶并储存在-80°C，直到进一步使用。
从冰箱中取出所需的脂质库存，置于冰上，溶解在甲醇：氯仿（1：1，v/v）中，最终脂质浓度为 10 mg/ mL。
注意：除 POPC 和 POPG 以外的脂质在氯仿：甲醇中的溶解度可能有限或非常差，需要氯仿/甲醇/水的混合物。
对于 9:1 的比例，转移 450 µL 的 10 mg/mL POPC 和 50 μL 的 10 mg/mL POPG 放入接地的圆底玻璃管中，最终脂质膜为 5 mg。
在 150 mbar 的旋转蒸发器中干燥脂质膜，直到没有残留溶剂可见。
降低到可能的最低压力（此处为 30 mbar）并干燥脂质膜额外 1 小时。
μL的重组缓冲液（见配方 1 ）重新水合脂质膜（5 mg，管底部的油膜，外观从透明到发白，具体取决于脂质成分），最终脂质浓度为 15 mg/mL （约 20 mM 总磷脂）。通过添加玻璃珠并涡旋直到管底部不再可见脂质膜，但至少持续 5 分钟，实现完全再水化。
注意：脂质膜与水溶液的混合会导致脂质体的自发形成。
通过将管交替放入液氮中 30 s 进行冷冻，并在 50°C 的水浴中 90 s 进行解冻，使脂质溶液经受五个冻融循环。
注意：处理液氮时，请佩戴面罩和绝缘手套。使用抗热震性高的玻璃管。
根据手册组装 Avanti 迷你挤出机，每个位置有两个过滤器支架，中间有两个 200 nm 孔径的聚碳酸酯膜。
通过用 1 mL 的重组缓冲液冲洗检查密封性（参见配方 1 ），即在注射器之间来回传递三到四次。仅当每次通过的缓冲量保持相同时才继续。
注意：在第一个通道中，缓冲体积可以减少到挤出机的空隙体积。
用大约 334 μL 的脂质体溶液填充一个汉密尔顿玻璃注射器，并将填充的注射器放入迷你挤出机的一端。
小心地将空注射器放入迷你挤出机的另一端。柱塞的
空注射器应完全移入注射器筒中。
通过具有 21 个通道的组装 Avanti 迷你挤出机进行手动挤出。
注意：通道数需要不均匀才能在另一个注射器中完成，因为起始注射器中的残留悬浮液可能从未通过挤出机。
最终的脂质体可以储存在冰箱中的 1.5 mL 微量离心管中长达两周。

重组
注意：此处通过使用去污剂介导的囊泡失稳进行重组（Rigaud 等人，1988）。该方法针对所用蛋白质的需要进行了优化。有关此主题的详细评论，请参阅 Amati 等人。（2020 年）。
在 1.5 mL 微量离心管中用 124 μL重组缓冲液（参见配方 1 ）稀释 66 μL脂质体悬浮液（ 4-5 mM 脂质浓度）。
9 μL的洗涤剂（45 mM 最终浓度，OG 库存，参见配方 2 ）使脂质体不稳定，头顶旋转 5 分钟。
注意：加入适量的清洁剂可以通过使用分光荧光计测量含脂质体溶液在 600 nm 处的光散射来监测。随着添加到囊泡中的去污剂浓度增加，吸光度开始降低（去污剂饱和点），直到囊泡完全溶解。 AHA2 蛋白质插入的最佳阶段是在洗涤剂饱和和脂质体总溶解之间的转折点。
将 25 μg纯化的 AHA2（在储存缓冲液中，参见配方 3 ）添加到脂质体-去污剂混合物中，并在头顶旋转的情况下再孵育 5 分钟。
同时，准备 G50 过滤柱：从侧面到中间切开两个过滤器支架，放入一次性 2 mL 注射器中，不带柱塞，形成塞子。将注射器放入一次性 15 mL 反应管中，加入 3 mL Sephadex G50 细浆（见配方 5 ），以 180 × g离心 5 分钟，然后将色谱柱转移到新的 15 mL 反应管中（参见图 2）。

图 2 。 G50 柱的制备。
(1) 将两张滤纸从一边向上剪到中间。 (2) 用重组缓冲液润湿纸后，将它们插入没有柱塞的塑料注射器中。 (3) 将预先浸泡好的 G50 浆液涂在注射器上，注射器置于 15 mL 管中。 (4) 离心后 (180 × g 5 分钟）将 G50 柱转移到新的 15 mL 管中，即可使用。

在柱顶部加入脂质-蛋白质-去垢剂悬浮液并孵育 5 分钟。
× g离心8 分钟。
注意：此尺寸排除柱捕获游离洗涤剂，即 OG。
将流通液转移到 2 mL 微量离心管中。
注意：与 1.5 mL 管相比，2 mL 管的底部更宽对于在下一步中更好地旋转和混合液体很重要。
中加入 50 mg 预洗过的BioBeads （参见配方 6 ）并孵育 60 分钟，头顶旋转。
注意： BioBeads具有疏水性，可通过吸附从脂质体中提取剩余的洗涤剂。
用 26 号针头在 2 mL 微量离心管底部打一个小孔，并将其放入 15 mL 反应管中。
注：底部中心处塑料最厚；在此旁边打孔以便于处理。
在 2 mL 微量离心管的盖子上打一个孔以进行压力平衡，并以 180 × g离心30 秒，以将脂质体样品与预洗的BioBeads 分离。
将流经移动到新的 1.5 mL 微量离心管中。在冰箱中存放最多四天，尽快使用。

不对称蛋白质标记和分析
含有重组 SNAP 标记膜蛋白的脂质体分别或依次用膜不可渗透和可渗透的 SNAP 染料标记，如图 3 所示。

图 3 。双标检测工作流程。
蛋白脂质体样品分为条件 I、II 和 III。样品 I 仅标有膜不可渗透的 SNAP-Alexa488，稍后用作渗透校正。样品 II 用可渗透膜的 SNAP-647-SIR 进行标记，以获得 100% 的标记信号。样品 III 首先用膜不可渗透的 SNAP-Alexa488 标记，以阻断所有向外的蛋白质，然后在第二步中用细胞可渗透的 SNAP-647-SIR 标记，以获得对应于向内蛋白质的信号。样品一式两份制备并加载到 SDS-PAGE 上。凝胶在绿色和红色通道中按凝胶内荧光顺序成像，随后通过胶体考马斯染色对总蛋白量进行染色。

使用补充有 1 mM DTT（从0.5 M DTT 库存添加，参见配方 4 ）的重组缓冲液以 1:100 稀释 SNAP 染料库存，以产生 10 µM 稀释库存。
在六个 1.5 mL 微量离心管中吸取 10 μL 脂质体悬浮液（约 62.5 – 125 μg 蛋白质，5 – 10 pmol ）。这对应于一式两份的三种不同样品类型（I、II、III）。
将不可渗透的 SNAP 染料以 1:2（mol蛋白：mol染料）过量（从 10 μM SNAP-Surface Alexa488 稀释原液中加入 1-2 μL）添加到样品 I 和 II 。
在 25°C 下孵育 2 小时。
注意：要实现蛋白质的最大标记，请使用过量的染料（至少1:2，mol蛋白质：mol染料）并测试不同的孵育时间，直到标记强度不再增加。与绿色染料 SNAP-Surface Alexa488 相比，红色 SNAP-Cell 647-SIR 的标记速度较慢。
在样品 II 和 III 中加入膜渗透染料（10 µM SNAP-Cell 647-SiR 稀释原液中的 1 – 2 µL）。
在 25°C 下孵育 2 小时。
笔记：考虑测试不同的时间以达到最大标记。
通过添加 5 µL 的 Laemmli 缓冲液停止反应（参见配方 7 ）。
将样品直接加载到 10% 1.5 mm SDS 凝胶上（参见配方 10 ）。
注意：膜蛋白样品在上样前不要煮沸，以防止聚集。
使用分子量标记（例如，3 µL PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder，10–250 kDa ）。
在 100 V 下运行 SDS-PAGE 约 2 小时，直到运行前端距离凝胶末端 0.25 厘米。
将凝胶从暗盒中取出，并使用带有 Alexa488（460–490 nm、530/28 nm 滤光片）和 Alexa647（625–675 nm、695/50 nm 滤光片）的预编程选项的Chemidoc成像仪进行成像。
注意：调整曝光时间，使信号不饱和，因为我们想量化它。由于某些 SNAP 染料暴露的信号较弱，可能会使用长达 10 秒的时间。首先，拍摄整个凝胶的图像以查看游离染料；大多数实际的蛋白质-染料结合物尚不可见。然后，切割含有游离染料的下部。拍摄第二张曝光时间较长的图像，以正确显示蛋白质染料条带。
将图像保存为ImageLab内置数据格式“. scn 。”双色标记实验的示例性结果如图 5 所示。

胶体考马斯染色，根据Dyballa 和 Metzger (2009)
将凝胶转移到装有 ddH 2 O 的碗中，摇晃两次，每次 10 分钟，以去除残留的 SDS。
在 Coomassie 胶体溶液（参见配方 13 ）中摇晃染色剂长达 4 小时。
脱色溶液脱色几个小时（见配方14）。
Chemidoc中使用考马斯染色凝胶（白色反式照明）的预编程选项。
将图像保存为ImageLab内置数据格式“. scn 。”

数据分析

ImageLab软件提取信号强度
用红色染料、绿色染料打开凝胶图像，考马斯图像为“. scn ”与ImageLab版本 5.2.1。
从每个图像中，提取波段强度：
点击“车道和乐队”菜单。
单击“车道”选项卡并使用车道查找器（在“手动”字段中输入车道数）来检测车道。调整车道位置，以适应实际车道位置。
注意：所有通道应具有相同的宽度，以便将背景校正中的错误降至最低。
单击“波段”选项卡并通过单击“检测波段”使用“波段查找器”（默认设置：波段灵敏度 - 低；车道 - 全部）。因此，检测到所有显着条带。通过“Bands”-“add”添加额外的乐队。
使用“Lane Profiler”检查您的结果：车道上的条带强度显示为强度函数。
进行质量控制：带峰下的整个区域必须被带边界覆盖。通过移动波段边界进行调整（参见图 4）。
注意：重要的是要平等对待所有波段，因此应选择相同的面积分数。为避免手动选择带边界的错误，请包括整个区域。
通过返回“通道”选项卡并更改“背景减法”来调整背景校正。指定磁盘大小，因为背景校正是通过滚球方法完成的（参见图 4）。不要勾选“适用于选定的车道”，因为所有车道都应平等对待。
注意：磁盘尺寸太大会导致未分离的峰或太长的尾部过多地增加面积。太小的磁盘大小可能会导致峰值下的区域被裁剪，部分被认为是背景。

图 4 。 ImageLab中的凝胶条带量化。
ImageLab图形用户界面显示数据分析。调整所选凝胶泳道的边界，以便在边界之间覆盖整个峰。此外，通过滚动球校正（上图，蓝线）完成背景减法，优化磁盘大小以使其适合红线（实际信号）。

在迭代步骤 A2e 和 A2f 直到正确标记峰值下的区域后，将峰值数据导出到 Excel 文件。
合并导出的 Excel 工作表并使用提取的体积强度。
通过除以考马斯信号（体积强度）来标准化 SNAP 染料信号（体积强度）的强度。
注意：在较新版本的软件中，需要使用背景校正数据。在此处使用的版本中，只有背景校正值以 Volume (Int) 形式给出。
内向蛋白的商是通过对来自膜可渗透的 SNAP Cell 647-SIR的信号进行分割获得的样品 II（所有蛋白质标记）衍生自样品 III（仅内部标记）的染料。

〖Protein〗_out (%)= (F_III-F_I)/F_II *100%= (0.1319- 0.0012)/0.5661*100%=23.3%

在归一化为考马斯染色信号后，此处使用红色通道的荧光值。 F III ：向内标记的蛋白质的荧光（平均值）； F II ：总标记蛋白的荧光（平均值）； F I ：没有红色染料的泳道的渗透荧光（平均值）。

注意：作为 blee d-through 的对照，还要确定来自样品 I（无标记）的膜渗透性 SNAP-Cell 647-SIR 染料信号与样品 II（所有蛋白质标记）的商数。对于稳健的检测，建议将渗透率控制在 1% 以下，以确保对图像分析的干扰最小。

图 5. 双色标记实验的示例性结果。
蛋白脂质体在样品 I、II 和 III 中分离，并且在 SNAP 标记后，在两个通道中测量凝胶内荧光。随后，进行胶体考马斯染色以对总蛋白量进行标准化。所有样品均准备好并一式两份上样。样品 I 标有膜不可渗透的 SNAP-Cell Alexa488。样品 II 用可渗透膜的 SNAP-Cell 647-SIR 进行标记，并用作 100% 蛋白质信号。样品 III 首先用膜不可渗透的 SNAP-Surface Alexa488 在外部封闭，然后仅用膜可渗透的 SNAP -Cell 647-SIR 标记面向内的蛋白质。所有荧光强度都在相应的考马斯信号上标准化。 SNAP-Cell 647-SIR 通道中的归一化信号强度用于通过将来自样品 III（仅内部标记）的信号除以样品 II（所有蛋白质标记）来确定内部定向蛋白质的百分比，此处显示 25 %。 SNAP-Cell 647-SIR 通道中的渗出可以通过将来自样品 I（无标记）的信号除以样品 II（所有蛋白质标记）来确定，此处显示小于 1%。

食谱

重组缓冲液 (1 L)
20 mM MOPS-KOH (4.185 g)，pH 7，50 mM K 2 SO 4 (8.713 g)
1 M OG 库存
2 O中将 4.386 g OG 溶解到 15 mL 的最终体积。在 -20 °C 下冷冻等分试样。
蛋白质储存缓冲液 (1 L)
50 mM MES-KOH (9.76 g; pH 7)、50 mM KCl (3.728 g)、20% (v/v) 甘油、1 mM EDTA (0.292 g) 和 1 mM DTT（2 mL 来自 0.5 M 库存）辅以 0.04% (w/v) DDM。
0.5 M DTT 库存
将 1 克 DTT 溶解在 42.81 μL 的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）中，并添加 12.93 mL 的 ddH 2 O。在 -20°C 下冷冻等分。
注：DTT 易挥发；使用前后直接解冻和冷冻。
Sephadex G50 细浆
将 2 g Sephadex G50 溶解至最终体积为 50 mL 的重组缓冲液，在室温下浸泡 3 小时或在冰箱中浸泡过夜。
预洗生物珠
在 50 mL 反应管中重约 1 g BioBeads 。在甲醇中洗涤两次 10 分钟，在 ddH 2 O 中洗涤两次 10 分钟，在室温下在重组缓冲液中洗涤一次 10 分钟。 BioBeads可以在冰箱中保存在重组缓冲液中长达一周。使用时，将缓冲液移出以获得湿润的BioBeads 。
Laemmli 缓冲液 (100 毫升)
60 mM Tris (0.727 g)、0.75% (v/v) SDS（3.75 mL 来自 20% 库存）、10 mM DTT（2 mL 来自 0.5 M 库存）、2.6% (w/v) 蔗糖 (2.6 g)、 0.005% (w/v) 溴酚蓝 (0.005 g) 和 2 mM EDTA (0.058 g)，pH 6.8
注：DTT 易挥发；使用前后直接解冻和冷冻。
20% SDS 库存（100 毫升）
将 20 克 SDS 溶解到 ddH 2 O中的总体积为 100 毫升。
SDS-PAGE 运行缓冲液 (1 L)
25 mM Tris (3.029 g)、192 mM 甘氨酸 (14.413 g) 和 1% SDS（50 mL 来自 20% 原液），pH 8.6
SDS凝胶
10% 1.5 mm SDS-聚丙烯酰胺分离凝胶 (50 mL)
10% (v/v) 丙烯酰胺 (5 mL), 375 mM Tris , pH 8.8 (18.75 mL 1 M 原液), 0.1% (v/v) SDS (250 µL 20% 原液), 0.1% (v/ v) APS（500 µL 的 10% 库存）和 0.01% (v/v) TEMED (5 µL)
5% 浓缩胶（10 毫升）
5 % (v/v) 丙烯酰胺 (2.5 mL), 125 mM Tris, pH 6.8 (6.25 mL 1 M 原液), 0.1 % (v/v) SDS (250 µL 20 % 原液), 0.1 % (v/ v) APS（100 µL 10 % 原液）和 0.01 % (v/v) TEMED (5 µL)
10% APS 库存
2 O中溶解 1 g 至 10 mL 的总体积。
1 M Tris (100 毫升)
将 12.114 g Tris 溶解到 ddH 2 O 中的总体积为 100 mL，将 pH 值分别调整为 8.8 或 6.8。
胶体考马斯染色溶液 (1 L)
0.02% (w/v) 考马斯亮蓝 G-250 (0.2 g)、0.02% (w/v) 水合硫酸铝 (0.2 g)、10% (v/v) 乙醇 (100 mL) 和 2% ( v/v) 85% 正磷酸 (20 mL)
胶体考马斯脱色液 (1 L)
10% (v/v) 乙醇 (100 mL)、 2% (v/v) 85% 正磷酸 (20 mL)

致谢

该协议改编自我们之前的工作(Veit et al., 2022) 。这项工作的资金来自德国研究 545 基金会 (GU 1133/11-1) 和 DAAD (57386621) 向 TGP LCP 和 SV 承认由Studienstiftung des deutschen提供的资金沃尔克斯。我们感谢Huriye Deniz Uzun和 Bo Højen Justesen用于生成 AHA2-SNAP 结构。所有图形都是使用Biorender准备的。

利益争夺

作者声明不存在相互竞争的利益。

参考

Amati, AM, Graf, S., Deutschmann, S., Dolder, N. 和 von Ballmoos, C. (2020)。蛋白脂质体研究的当前问题和未来途径。 Biochem Soc Trans 48（4）：1473-1492。
Cid, A.、 Perona , R. 和 Serrano, R. (1987)。用半乳糖依赖性启动子替换酵母质膜 ATPase 基因的启动子及其生理后果。当前基因12（2）：105-110 。
NB 科尔（2013 年）。使用 SNAP 标签进行位点特异性蛋白质标记。电流 Protoc蛋白质科学73：30 31 31-30 31 16。
Deutschmann, S.、Rimle, L. 和 von Ballmoos, C. (2022)。脂质体中膜蛋白取向的快速估计。化学生化23（2）：e202100543 。
Dyballa , N. 和 Metzger, S. (2009)。对聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质进行快速灵敏的胶体考马斯 G-250 染色。 J Vis Exp (30)：1431。
Eisinger, ML, Nie, L., Dorrbaum, AR, Langer, JD 和 Michel, H. (2018)。施氏假单胞菌的 MATE 转运蛋白 NorM_PS 的异生物质挤出机制。分子生物学杂志 430（9）：1311-1323。
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