材料和试剂

图 1 显示了下面列出的几个必需项目以及常见的实验室设备。

1. 200 目低温电磁网格（例如，SPI Supplies，目录号：4220C-CF）
注意：网格需要额外涂上约 20 nm 厚的碳层。虽然可以使用最常用的网格材料，但我们通常使用 200 目铜网格。较大和较小的网格尺寸将分别减小和增加薄片尺寸。网格箔类型并不重要，因为它会被磨穿。
2. 网格盒（例如， SubAngstrom ，目录号：GBV01）
3. 冷冻板（帽子）“B”型（例如，Ted Pella，目录号：39201）
4. SEM pin stub（例如，Ted Pella，目录号：16261）
5. 或类似的砂纸（例如ADVcer 、ADV_Sandpaper_Sheets_S01_5_10BUGY）
6. HPF 支架（例如， Technotrade International，目录号：290-1）
7. POL Metallpflege金属抛光剂（已停产，由例如 Ted Pella 替代，目录号：892）
8. 滤纸（例如，Whatman，目录号：1004090）
9. Kimwipe 组织（例如， Kimtech ，目录号：34155）
10. C形夹环（ Thermo Fisher Scientific，目录号：1036173）
11. Cryo-FIB AutoGrid （ Thermo Fisher Scientific，目录号：1205101）
12. 酵母、细菌、哺乳动物细胞、蛋白质或蛋白质复合物
13. 集中供应
a. 对于细胞或生物体，锥形无菌聚丙烯离心管（例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：339652）
b. 对于纯化的蛋白质和蛋白质复合物，基于蛋白质大小的具有 MWCO 的蛋白质浓缩器（例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：88513）
14. 各自的细胞培养或酵母培养基
15. 工业级干氮罐
16. 工业级液氮罐
17. 1-十六碳烯（例如，Millipore Sigma，目录号：822064）

图 1. 华夫饼制备仪器。
“材料和试剂”部分中的项目以其相应的编号显示。对于华夫饼组件，请参阅 Kelley 等人的原始华夫饼纸。（2022 年）。其他常见的cryoEM实验室设备包括在内（右下角的黑框）：带有相应吸头的 P10 移液器、细尖镊子和AutoGrid开箱工具。

设备

1. 用于液氮工作的个人防护设备（例如手套、护目镜、氧气监测仪）
2. 立体镜（例如，Zeiss，目录号：455053-0000-000）
3. 剪辑站和剪辑工具（例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：1000068）
4. 移液器和吸头（10 μL 、200 μL 、1,000 μL ）
5. 离心机（例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：75004240）
6. 镊子（例如，Ted Pella，目录号：5220）
7. AutoGrid镊子（例如，Ted Pella，目录号：47000-600）
8. 网格转移杜瓦瓶（例如，Thomas Scientific，目录号：5028M40）
9. 4升容量的液氮杜瓦瓶
10. 液氮杜瓦瓶或冰球系统（例如， SubAngstrom ，目录号：GSS02-E）
注意：在我们的案例中，将薄片与其他样品分开存放可以减少污染。
11. CCU-010 HV 高真空镀膜机（例如， Safematic ，目录号：100001)
12. CT-010碳纤维蒸发头模块（例如， Safematic ，目录号：100003）
13. 等离子清洗机（例如Gatan Inc.、 Gatan Solarus II 型号 955)
14. Wohlwend Compact 01 HPF 或类似产品 (M. Wohlwend GmbH)
15. Cryo-FIB/SEM 双光束显微镜，包括相关的网格穿梭 ( Thermo Fisher Scientific, Aquilos 2)
注意：标准Aquilos 2 穿梭机具有 45° 预倾角。我们发现随 TFS iFLM模块提供的 27° 预倾斜梭更便于执行预清洁（程序 B，步骤 30），因为预倾斜允许更高的铣削角度而无需降低载物台。
16. 抗污染低温屏蔽/低温快门系统（例如， Delmic CERES Ice Shield，目录号：DM-2707-999-0003-1）
注意：这种低污染设置是可选的。我们发现它在减少自动研磨过程中的薄片污染和实现自动过夜研磨方面很有用。

软件

1. FIB-铣削软件：
a. 显微镜操作平台。 TFS 的仪器通常使用xT 操作。在这里，我们使用了 xT v. 20.1.1。
b. 适用时用于定义 ROI 和对齐荧光信号的软件。在这里，我们使用了 MAPS v. 3.16-3.17。
c. 铣削自动化软件。在这里，我们使用了 AutoTEM 低温诉 2.2。

程序

注意：使用液氮有潜在的危险，应小心并采取适当的保护措施（即冷冻手套、防护眼镜、氧气监测仪等）。

A. 高压冷冻 (HPF) 样品玻璃化
注意：有关程序 A 的其他说明和演示，请参阅视频 1 。

视频 1。使用华夫饼法制备样品。
使用华夫饼法制备 HPF 样品，包括 HPF 平板抛光 (0:22)，然后使用 1-十六碳烯 (2:25)，在 HPF 吸头支架中组装华夫饼 (2:50)，以及 HPF 本身 (4:10) ; 程序 A)。有关更多信息，包括平板的中间状态，请参阅原始华夫饼纸中的补充图 6（Kelley 等人，2022 年）。

1. 用一层额外的碳来刚性化网格：
将网格放在载玻片上，网格条朝下。将载玻片放在碳蒸发器的舞台上，将20 nm 的碳蒸发到网格的薄膜侧。
2. 打磨和抛光烤盘：
a. 在 1,200、7,000 和 15,000 号砂纸上打磨 B 型底板的平面，以去除制造过程中存在的同心环。
b. 的平面浸入 POL metallpflege金属抛光剂中，然后在一张滤纸上以圆周运动的方式用手擦拭。
c. 用 Kimwipe 纸巾擦去多余的抛光剂，然后在一张滤纸上再次擦拭木板，以确保所有抛光剂都消失了。
3. 在 1-十六碳烯中涂上大衣：
a. 将所有的烤盘平放在一张滤纸上。
b. 将一滴 1-十六碳烯 (4–6 μL ) 涂抹在平板顶部，然后拖动移液器吸头，使液滴扩散到滤纸上。
c. 在平板顶部应用另一滴 1-十六碳烯。
d. 将烤盘涂在 1-十六碳烯中至少 15 分钟，直到华夫饼组装的时间。
4. 准备浓缩样品。
注意：样品通常应尽可能浓缩，同时保持移液器可用。然而，样品不一定需要是粘性的。
5. 等离子清洁碳硬化网格：
2气体和 20% H 2气体的配方，以 50 W 的正向射频 (RF) 目标进行等离子清洁网格，使网格条朝上（额外碳面朝下）。
6. 华夫饼组装：
a. 从平板帽上吸去 1-十六碳烯，并将其放在 HPF 支架尖端上，平面朝上。
b. 将网格放在平板帽上，网格条朝上。
c. 将 5 μL 的样品应用于网格。
d. 从第二个 planchette 帽子上吸干 1-Hexadecene，并将其放在样品顶部，平面朝下。
e. 如有必要，轻轻擦掉从平板帽中挤出的多余样品。
f. 关闭 HPF 尖端。
g. 用镊子拧紧组件。
7. 高功率过滤器：
注意：通常，使用我们的设置 (Wohlwend Compact 01 HPF)，HPF 压力为 2,100 bar 。
a. 将组装好的华夫饼样品转移到 HPF 室。
b. 玻璃化样品。
c. 将 HPF 支架转移到液氮室中。
d. 松开 HPF 支架尖端，然后卸下华夫饼组件。
注意：理想情况下，planchettes 将与网格完全分离。如果组件粘在一起，用镊子在两个板之间按压；另一对镊子可用于将组件固定到位。如果只有一个平面帽分离，抓住外缘的网格并小心地将其从另一个平面帽上提起。
8. 剪裁华夫格网格
注意：在冷冻 FIB/SEM 减薄之前，在添加立体镜的情况下，华夫饼剪裁与传统样品网格的剪裁相同。
a. 标记AutoGrid ：在槽口处，与槽口相对，与两侧的槽口成 90°（图 2A ）。这有助于 FIB/SEM 中的网格条对齐和加载期间薄片相对于 TEM 倾斜轴的方向。
b. 在立体镜下和用 c 形夹环夹之前，用镊子旋转网格，直到网格条与AutoGrid的槽口呈正方形（图 2B，C ）。剪切时网格可能会轻微移动，这对方法没有害处，因为网格条对齐主要是为了最大化薄片尺寸。

图 2. HPF 后的华夫格剪裁。
正确定位网格条有助于最大化薄片尺寸，但对成功执行此协议无害。 (A)带有缺口标记和相对两侧两个点的低温 FIB AutoGrid示例。 (B)在没有样品的立体镜中看到的网格条的对齐和(C)与网格剪裁室中的样品的对齐。

B. 使用 cryo-FIB 铣削进行样品稀释
}注意：
• 步骤 B1 – B6、B8 – B12、B14 – B23、B25 和 B29 – B30 在xT软件中完成，B7、B13 和 B23 – B24 在 MAPS 中完成，B25 – B28 和 B31 – B32 在AutoTEM中完成。
• 有关如何在自动铣削前准备薄片位点的其他说明和演示，请参阅视频 2 。视频 3演示了自动铣削的过程。
• pA的电子束 (EB) 设置在整个协议中保持不变。离子束 (IB) 起始设置为 30 kV 和 10 pA 。虽然 IB 电压在整个协议中保持不变，但电流会根据文本发生变化。对于成像，我们通常使用 ETD 检测器。

视频 2。设置铣削场地。
xT 、MAPS 和AutoTEM窗口的两个屏幕记录，用于在华夫饼薄片的自动铣削前进行场地准备（程序 B）。在 MAPS 中创建新项目后，记录 SEM 网格概览 (0:08)，然后在仪器室内进行铂溅射和气体喷射系统 (GIS) 涂层，然后定义初步薄片位置 (1:09)。接下来，将网格与 IB 正交放置，并对几个薄片位置 (1:24) 进行预切割。完成预切割后，将网格放回映射位置，并记录新的网格概览 (3:12) 并用于定义最终薄片位置 (3:33)。然后，创建一个AutoTEM项目，并定义每个站点的偏心位置、铣削角度和初步薄片位置 (3:35)。从 5:25 开始显示预清洁和缺口铣削。最终薄片放置显示在 8:40。

视频 3。 AutoTEM铣削。
AutoTEM中记录自动铣削（步骤 B32d）。首先，对每个薄片（0:01）进行粗铣、中铣、精铣和精铣。然后，对每个薄片进行抛光1 和抛光 2 (0:45)。参数列于表 3。

1. 在加载样本之前，清除 GIS 线路。此步骤可以在 FIB/SEM 系统冷却时完成。在 GIS 吹扫过程中不应存在样品。
2. 唤醒系统并打开两个光束，然后确保启用了“触摸警报”。
3. 对 EB 和 IB 应用 180° 的扫描旋转。
4. 选择网格，然后转到预定义的“映射”位置。
5. 降低放大倍率，以网格为中心，并将 EB 聚焦在网格上。
6. 增加放大倍率直到一个正方形可见，聚焦 EB，然后链接 Z 高度（按“链接 Z 到 FWD”）。
7. 创建一个新项目并在 EB 中获取网格的概览图像：
a. 创建并命名一个新层。
b. 创建并命名一个新的Tileset 。
c. 定义瓦片集参数（表 1 ）。

表格1。在 MAPS 中获取 EB 网格概览的参数

8. 单击“准备溅射”并使用表 2中的参数运行导电铂沉积。

表 2。铂溅射镀膜参数

9. 完成后单击“从溅射中恢复”以关闭溅射功能（“运行”按钮应再次处于活动状态）。
10. 转到预定义的“沉积”位置。
11. 添加一层有机金属铂（也称为 GIS 铂）：在低温GIS 沉积选项卡中，选择一个网格并定义时间。使用我们的铣削设置，2 分钟的 GIS 可以很好地铣削到 200 nm 厚度的薄片，或者 2 分钟 15 秒可以铣削到 150 nm 厚度。
12. 回到“映射”位置。
13. 定义 ROIs 和初步的薄片位点。
笔记：
• 对于荧光标记的目标，ROI 和薄片位点是根据荧光信号的存在来定义的。这可以通过使用外部低温 FLM 系统或内部 FLM 模块预先获取的网格概览来完成。在这两种情况下，MAPS 都允许导出荧光图像，这与 EB 网格概览对齐。在 FIB-SEM 中使用荧光的一般工作流程在其他地方进行了描述，例如Gorelick 等人。（2019）。
• 在大多数情况下，网格将具有不同的特征，可用于对齐（例如，虚线正方形或网格中心标记）。我们通常执行三点对齐。首先，使用三个点进行粗对准；然后，MAPS 允许进行微调。对准通常在铂溅射和 GIS 涂层之后进行。
14. 从“映射”位置，将网格与 IB 正交：
笔记：
• 确保在所有步骤中都启用了“触摸警报”。此外，可以降低载物台，然后旋转载物台、倾斜载物台并向上移动载物台以移动到正交位置。
• 数值显示为具有 45 °预倾角的标准 TFS Aquilos 2 穿梭机。对于配备iFLM的系统，梭预倾角为 27°，这需要在步骤 B14a 中将载物台倾斜至 25°。
a. 将载物台旋转到实际值 108.1°，或从 Mapping 位置相对 180°，然后将载物台倾斜到 7°，因此 IB 角与样品成 90°。
b. 保存穿梭机位置，并将此保存的位置用于未来导航。
15. 唤醒系统，溅射后自动关闭。
16. pA电流的 IB ，导航到步骤 B13 中定义的初步薄片位点之一。
17. 调整对比度，使薄片部位表面的任何特征都清晰可见，然后获取图像，并在获取图像时聚焦 IB。这将最大限度地减少充电。
18. 检查表面质量。理想情况下，表面应该是“平坦的”并且没有污染。
注意：这是对表面质量的初步评估。在定义的铣削角度（本协议中为 20°）下，表面可能看起来不平坦。
19. 找到网格条。如果它们不可见，则在您期望网格条所在的高电流下将小窗口铣入表面（图 3 ）。如果您击中两个或更多正交网格条，请绘制相应的线，延伸到具有初步薄片位置的所有正方形。
20. 预切：
a. 对于在裁剪期间网格条对齐的 200 目网格，将 { x,y } 中的矩形铣削图案定义为 {22 µm, 37 µm}（顶部）和 {20 µm,17 µm}（底部），距离框之间设置为 25 µm。 xT的预切图案可作为补充文件 1获得。
注意：我们建议在最初实施华夫饼方法时使用这些经过广泛测试的图案尺寸，以确保冷冻 ET 成像可访问的一致薄片。
b. 以 15 nA铣削图案（铣削的预切如图 3D所示）。

图 3 。使用视频 2 中的相应时间铣削预切
初始铣削模式（补充文件 1 ）被放置在感兴趣的区域(A) 。在铣削之前，另一个较小的图案（黄色图案）用于定位网格条位置(B) 。然后调整预切图案以避免网格条(C)。完成的预切割显示在面板(D)中。

21. 改回 10 pA ，缩小，导航到下一个初步薄片站点，然后重复步骤 B16-B20。
22. 回到“映射”位置。
23. 表 1中相同参数的新Tileset 。
24. 删除旧的初步薄片位点，并根据预切位置在新网格概览上定义新的薄片位点。
25. 打开AutoTEM并选择在 MAPS 中创建的具有相同项目名称的项目。
26. 选择相应的铣削模板，并将其应用于所有薄片位点（表 3 ）。

表 3. AutoTEM中的铣削参数低温。
该模板可作为补充文件 3 找到。最初，我们建议设置对于 10 μm薄片厚度，深度校正为 100% （参见注释以获取更多讨论）。

27. 在“引导”模式下为所有薄片站点运行“准备”。
28. 将铣削角度定义为 20°。
29. 在步骤 B31 中定位薄片以引导槽口放置。
30. 准备“预清洗”（图 4 ）：
注意：一定要磨足够长的时间以避免双薄片。用 EB 图像确认薄片位置下方的材料被完全磨掉（补充图 1 ）。
笔记：
• 步骤 B30b、d 假设孔对齐良好，因此改变电流后铣削图案之间没有偏移。
• 如果铣削窗口在 10 pA和 7 nA或 3 nA之间有显着变化，请对相关铣削电流进行快速快照，以准确定位矩形铣削图案。
a. 将梭子倾斜到一个高铣削角度，这样每个薄片下方的任何材料的底部都是可见的。
注意：标准Aquilos 2 穿梭机具有 45 °的预倾角，最大角度通常在 25 – 30 ° 左右。要到达薄片下方材料的底部，标准穿梭机可能需要将载物台沿 z 方向向下移动。
iFLM梭具有 27 °预倾斜，倾斜载物台以实现高铣削角度不需要向下移动载物台。对于iFLM梭，可以以 45 °的铣削角为起点，然后以 30 ° 铣削，最后在步骤 B30c 的铣削角处。
b. pA处定义铣削矩形图案，然后在 7 nA处铣削，直到散装材料的底部消失（图 4A、B ）。
c. 倾斜到最终的铣削角度（本协议中为 20°）。
将铣削矩形图案定义为 10 pA ，并将它们放置在距离板边缘几微米的位置。在 3 nA下研磨，直到多余的材料消失（图 4C ）。

图 4.预清洗。
使用相应的时间进行铣削预清洁，如视频 2中所示。 (A, B) 7 nA的铣削是在高铣削角度下进行的。 (C)舞台倾斜到铣削角 (在本协议中为 20 ° ) , 并在 3 nA电流下进行进一步的预清洁。在所有情况下，将铣削图案放置在略低于板坯边缘（红色箭头）的位置，并确保将潜在薄片下方的多余材料完全铣削掉，这一点很重要。

31. 缺口铣削
a. xT中的凹槽图案与AutoTEM中的初始薄片位置对齐 (图 5A) 。此步骤不必准确，因为稍后将重新定义薄片位置。
b. 凹口图案的总尺寸在 x 方向为 3.5 µm，在 y 方向为 8.1 µm，在 z 方向为 3 µm。垂直图案的大小，除了侧面的框外，x 方向为 3.5 µm，y 方向为 0.2 µm，水平图案反之亦然。图案之间的重叠为 0.1 µm。侧面图案在 x 方向为 0.2 µm，在 y 方向为 1.3 µm。顶部和底部之间的间距为 1.1 µm（图 5B ）。该模式可以作为补充文件 1找到。
c. 以 0.3 nA 研磨。使用步骤 B31b 中定义的 z 深度，铣削总共需要约 2 分钟 15 秒。对于较厚的样品，考虑增加研磨时间，直到研磨完全穿过材料（图 5C）。

图 5 。用视频 2 中的相应时间铣削槽口。
(A)缺口图案(补充文件 2 ) 根据步骤 B29 中的预定义薄片位置和完成预清洁后放置。 (B)对图案进行数字缩放后，将具有定义尺寸的槽口图案的位置调整为靠近板的边缘。 (C)完全分离前的铣削缺口示例。

32. 最终薄片定位：
a. 重新运行“图像采集”和“薄片放置”。
b. 将薄片放置在距离槽口约 1 μm 的位置，顶部和底部磨盒与槽口重叠，如图 6 所示。
c. 典型的薄片尺寸为 12 µm × 15–20 µm × 150–200 nm。
d. 表 3中的AutoTEM模板以逐步模式运行，补充文件 3 。
注意：逐步模式用于最大限度地减少研磨后薄片上的污染增长。如果系统的污染率较低，则可以使用逐点模式来最大程度地减少站点之间的载物台移动。

图 6 。在AutoTEM中的准备步骤中的最终薄片放置，相应的时间在视频 2 中。
典型的薄片尺寸为 12 μm宽和 150 nm 厚。深度校正参数与每个步骤中的铣削时间相关，在本协议中定义为 10 μm 。

33. 过度倾斜或最终抛光：
注意：此步骤是可选的，根据最终薄片厚度和薄片质量执行。
a. 如果薄片或 GIS 层损坏，请勿执行自动铣后操作。
b. 否则，在抛光 2 步骤中定义正的 0.5°过倾（铣削角度为 20.5°），并仅针对该步骤运行自动铣削。或者，在薄片顶部手动放置 CCS 铣削图案。在这两种情况下，研磨 1-2 分钟就足够了。

数据分析

图 7显示了酵母细胞的最终低温 FIB 制备的华夫饼方法薄片的示例。生成的薄片进一步用冷冻 ET 进行成像。 Kelley等人中可以找到该程序的示例以及更多研磨薄片的示例。 ( 202 2 )。

图 7 。使用此协议制备的目标厚度为 150 nm 的酵母细胞华夫饼层示例
(A) ETD 检测器的电子束视图，和(B) ETD 检测器的离子束视图。

笔记

该协议在我们手中具有高度可重复性，大多数样本的成功率接近 100%。最常出现的问题是样品的玻璃化不良。在 TEM 数据采集期间，玻璃化不良变得明显，而不是在 cryo-FIB/SEM 或 cryo-FLM 期间。虽然我们在预清洁期间使用了相对较高的研磨电流，但研磨窗口远离薄片位置，因此，我们认为玻璃化不良的区域是由于 HPF 中的玻璃化不足造成的。为减少玻璃化不良问题，我们建议在 HPF 之前向样品中添加冷冻保护剂；通常我们会添加 5%–10% 的甘油（ Bauerlein等人，2021）。如果仍然出现玻璃化不良，我们建议增加样品浓度。
最初，我们建议使用补充文件 3中的设置。但是，根据样品类型，可以减少研磨时间。为了加快铣削过程，当薄片厚度定义为 10 μm时，可以将深度校正参数调整为例如粗铣和抛光 2 的 50% 。在自动铣削期间铣削薄片后面的材料时，应减少深度校正（参见补充图 1中的过铣）。
补充图 1总结了可能出现的其他潜在问题。避免过度铣削（补充图 1A、B）减少了铣削时间和薄片的镓污染。确保在预清洁期间去除第二层材料（补充图 1A、B）至关重要。我们注意到薄片变形，例如下垂（补充图 1B）和屈曲（补充图 1C），经常发生由于不完整的缺口铣削。虽然我们目前没有针对下垂的解决方案，但可以通过确保完全铣削凹槽来避免屈曲。双薄片（补充图 1B、D、E）通常是AutoTEM铣削图案位移的结果。虽然我们无法突出这种位移的确切原因，但它很可能是由重新导航到铣削现场期间的互相关误差以及不正确的漂移校正引起的。双薄片可以通过在自动研磨过程中通过切换到逐点研磨来最小化阶段移动来规避，最小化由于例如液氮杜瓦瓶重新填充而导致的研磨窗口移位，以及在 MAPS 中正确执行具有适当相关薄片位点位置的制备步骤。
我们发现，在我们的 TFS Aquilos 2 上用Delmic CERES Ice Shield替换 TFS 极片快门组件可将薄片污染率降低约 3 倍。在此更改之前，我们无法在一夜之间执行自动铣削而不产生可观的薄片上的污染（可能来自电子束极片）。此次升级后，我们当前的污染率约为 1.5 nm/h，这允许在可接受的低污染情况下在一夜之间自动研磨多达 12 个华夫饼薄片，而我们之前的限制是在 8 小时内研磨 2-4 个华夫饼薄片工作日。由于每个冷冻 FIB/SEM 仪器设置不同，我们建议在隔夜华夫饼研磨期间测试污染。根据污染率，cryo-FIB/SEM 操作员可以将自动华夫饼研磨限制在正常的 8 小时工作日，或者找到降低cryo-FIB/SEM 室中的污染率的方法，以实现显着更高的自动化隔夜华夫饼研磨吞吐量。此外，在低温下连续运行长达 72 小时期间，我们没有遇到冷却管线中的任何堵塞。
文献中的自动冷冻 FIB/SEM 工作流程（即Tacke等人，2021 年）声称在 24 小时内大约有 24 个薄片，其中每个薄片的可成像区域约为 5 μm × 5 μm ，总可成像面积约为 600 μm 2 。我们在这里描述的低污染华夫饼协议在 24 小时内产生 12 个薄片，其中每个薄片的可成像区域约为 11 μm × 16 μm ，总可成像面积约为 2,100 μm 2 。

致谢

他的工作在位于纽约结构生物学中心的西蒙斯电子显微镜中心进行，得到了西蒙斯基金会 (SF349247)、NIH NIGMS (GM103310) 和 NIH (U24GM139171) 的资助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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