材料和试剂

1. 指甲油
2. 盖玻片（Labbox，目录号：COVN-050-100）
3. 刀片（Ted Pella, Inc. St/Steel，单刃，38 毫米，目录号：121.4）
4. 载玻片托盘（Histoline，托盘载玻片染色系统，目录号：M920-1）
5. 250 mL 玻璃烧杯（VWR，目录号：213-1124）
6. 巴斯德移液器 3 mL（Deltalab，目录号：200006.C.）
7. 疏水笔（Sigma-Aldrich，目录号：Z377821-1EA），储存：室温（RT）
8. SuperFrost Plus 载玻片（ThermoFisher，Epredia TM SuperFrost Plus TM Adhesion 载玻片，目录号：10149870），储存：RT
9. SuperFrost Gold 载玻片（ThermoFisher，Epredia TM SuperFrost Ultra Plus TM GOLD Adhesion Slides，目录号：11976299），存储：RT
10. 来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25-1G），储存：-20 °C
11. MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：M8266-1KG），储存：RT
12. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C1016-500G），储存：RT
13. 1 M Tris-HCl，pH 7.5（ThermoFisher，Invitrogen，目录号：15567027），储存：2 – 8 °C
14. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750-500G），储存：RT
15. 超纯水/Milli-Q 水（通过设备 #6 获得），储存：RT
16. PBS 10 × （ThermoFisher，目录号：70011-036），储存：RT
17. 最佳切削温度（OCT）化合物（Sakura，Tissue-Tek ® ，目录号：4583），储存：RT
18. Cryomolds（Sakura，Tissue- Tek® Cryomold® Standard 25 × 20 × 5 mm，目录号：4557）
19. 多聚甲醛，4％的PBS（ThermoFisher，目录号：J61899.AK），储存：2-8 °C
20. Corning ® 50 mL 离心管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430290-500EA），储存：RT
21. Hoechst 33342染色（ThermoFisher，Invitrogen，Nucblue TM Live Cell Stain ReadyProbes TM试剂，目录号：R37605），储存：2-30 °C
22. Fluoromount（Southern Biotech，目录号：0100-01），储存：RT
23. 无绒纸（KIMTECH Science Precision，目录号：7551），储存：RT
24. 新鲜组织样本（在心脏、肺、膀胱和肾脏上进行了协议测试。测试的来源：鼠和猪）
25. DNase 溶液（见配方）
26. SD 2% 溶液（见配方）

设备

1. 镊子（rubisTech，目录号：1-SA）
2. 秤（Sartorius Lab Instruments，ENTRIS124l-1S，目录号：31603742）
3. 低温恒温器（徕卡，型号：CM3050S）
4. Vortex（Scientific Industries Inc.，Vortex Genie 2，型号：G-560E）
5. 轨道摇床（IKA，型号：KS 130 basic，目录号：0002980000）
6. Milli-Q 梯度（Millipore，目录号：ZMQ55V001）
7. 倒置显微镜 (Leica, SP5) 配备 CCD 相机 (Hamamatsu Photonics C9100) 并使用 10 × Plan Fluor 物镜 (Nikon, Tokyo, Japan)
8. 培养箱（Nuaire，型号：NU-4750）

软件

1. ImageJ（美国国立卫生研究院，LOCI，威斯康星大学， https: //imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

A. 样品制备和 OCT 嵌入
提示：在 -80 附近工作 °C冰箱。
1. 从动物/患者身上取出组织后，将样品放入适当的容器中，并在冰上冷藏长达 2 小时。对于更长的时间，将样品冷冻在-80 °C ，并在 OCT 嵌入之前将其从冰箱中取出，直到样品完全解冻。
2. 为您的样品选择合适尺寸的低温模具，使样品与低温模具壁之间至少有 0.5 厘米的距离。
3. 将一滴 OCT 化合物放在低温模具的中心。
4. 在镊子的帮助下，将新鲜组织样本放在中间。
注意：对于某些应用，组织也可以相对于刀片定位在特定方向。
5. 用 OCT 覆盖整个组织样本，而不会溢出 cryomold。
提示：倒入 OCT 化合物时不要挤压管子，以免产生气泡，气泡会干扰冷冻切片。确保样品顶部有一层厚厚的 OCT，使 OCT 的表面尽可能光滑。如果形成任何气泡，请用移液器缓慢吸出，轻轻去除它们。
将带有样品的低温模具放在冰箱中的平坦表面上。
提示：根据所用组织的类型，样本会漂浮在 OCT 上，因此尽快冷冻很重要。
注：其他冷冻程序，如用液氮、干冰、液氮蒸气快速冷冻，或在 -20 下冷冻 °C，也与该协议兼容。
6. 让样品冷冻过夜。

B. 组织切片
1. 为要切片的组织样本设置适当的低温恒温器温度。
注意：必须根据使用的设备和要切片的组织优化低温恒温器温度。在所描述的设置中，产生肺和心脏最佳组织切片的温度为 -18 °C至 -20 °C ，膀胱为 -20 °C至 -22 °C，肝脏为 -15 °C至-18摄氏度。
2. 使用前至少 20 分钟将刀片放入低温恒温器中。
3. 从冰箱中取出样品并将其放入低温恒温器中 30 分钟，然后切片。
4. 修剪冷冻块的开头，直到到达样品。
5. 选择所需的厚度。
注意：对于机械测试，我们建议使用 20 – 30 µm 的切片，而对于组织染色和成像，我们建议使用 10 µm。
6. 切片样品。
7. 小心地使载玻片的阳性区域与组织切片接触（根据样品的大小，您可以在一张载玻片中放置 1-3 个连续的组织切片）。
注意：对于较厚的部分（50 µm 和更高），请考虑使用粘性更强的载玻片，如 Superfrost Gold。
8. 让样品在室温下干燥 10 – 20 分钟。
9. 将样品储存在 -80 摄氏度。

C. 组织切片脱细胞（10 – 70 μm 样品厚度）
1. 从冰箱中取出样品并将它们放在载玻片托盘上（样品面朝上）。
2. 让样品在室温下解冻 20 分钟。
3. 用疏水笔追踪样品的边缘，让墨水完全干燥 1 分钟。
4. 使用巴斯德移液器，在 PBS 1 ×中覆盖样品 20 分钟 (RT) 以去除 OCT 化合物。请注意，根据组织大小，覆盖样品所需的体积可能从 100 µL 到 1 mL 不等。
提示：在脱细胞过程中倒入液体时，切勿将其直接倒在样品顶部，以免损坏或分离组织。还要避免以液滴形式添加液体，因为这也可能产生过多的湍流。取而代之的是，将移液器的尖端靠近样品的附近裸露的玻璃区域，并在连续流动中缓慢沉积液体。
5. 通过将载玻片倒置在玻璃烧杯上，移除 PBS（以及整个脱细胞过程中的所有其他孵化）。
警告：两次清洗之间要快，以免样品完全干燥。
6. 在 Milli-Q 水中覆盖样品 10 分钟以引发细胞裂解。
7. 通过倒置去除 Milli-Q 水并重复步骤 C6。
8. 通过倒置去除 Milli-Q 水。
9. 在 SD 2% 溶液中覆盖样品 15 分钟。
10. 通过反转去除 SD 2% 的溶液。
11. 在 SD 2% 溶液中再次覆盖样品 15 分钟。
12. 通过反转去除 SD 2% 的溶液。
提示：在以下步骤中，将载玻片倒置在玻璃烧杯上时要小心，因为带有细胞残余物的 SD 溶液非常粘稠，如果操作过快可能会损坏样品。
13. 用 PBS 1 ×孵育5 分钟，然后通过倒置样品将其移除。
14. 重复步骤 C13 三次。
15. 使用巴斯德移液器吸出并释放 DNase 溶液以确保其均匀（并且 DNase 不会沉到底部）。
16. 在 DNase 溶液中覆盖样品，并在 RT 下孵育 20 分钟。
17. 去除DN ase并重复步骤C13 3次。
18. 将样品留在 PBS 中，直到进一步染色或测试。不要让其干燥。

D. 组织切片去细胞化（70 – 100 μm 样品厚度）
对于较厚的组织切片的去细胞化，请按照 C 部分对以下步骤进行这些更改：
（代替步骤 C2） —让样品在室温下解冻 40 分钟。
（代替步骤 C4） —要从样品中去除 OCT 化合物，将样品覆盖在 PBS 1 ×中并孵育 30 分钟。
（代替步骤 C16） —将样品覆盖在 DNase 溶液中并在 37 ℃孵育 °C 40 分钟。

对于短期储存（<24 小时），非固定脱细胞样品可在 PBS 中放置 4 摄氏度。对于长期储存（ 1-10天），我们建议将样品在 PFA 中固定 15 分钟，然后用 PBS 去除 PFA，然后将样品留在 50 mL PBS 管中，温度为 4 摄氏度。不要冷冻薄脱细胞样品，以避免冰晶形成和样品结构损坏。

E. 核染色和封片
注意：任何像 DAPI 或 Hoechst 33342 这样的核染色剂都可以用于脱细胞量化。
1. 在 RT 解冻连续组织切片 20 分钟。
2. 用疏水笔追踪样品的边缘，让墨水完全干燥 1 分钟。
3. ×中覆盖 20 分钟，从原生样品中去除 OCT 化合物。
4. 根据制造商的说明（每毫升 PBS 2 滴）准备 Nucblue Hoechst 33342 染色溶液。
5. 在 Nucblue 溶液中覆盖原生和脱细胞样品，并保护载玻片托盘免受光照。
6. 在 RT 使用轨道摇床以 80 rpm 的速度孵育 20 分钟。
7. 通过倒置去除 Nucblue 溶液，并用 PBS 清洗样品 3 次，每次清洗 5 分钟。
注意：在两次清洗之间尽可能让您的样品避光。如果没有不透明的载玻片托盘盖，铝箔纸就足够了。
8. 通过倒置从载玻片中取出多余的 PBS。
9. 从容器中加入一滴 fluoromount 并将其放在样品顶部，以免直接接触它。
提示：使用黄色移液器吸头执行此步骤以避免形成气泡。
10. 用镊子从容器中取出盖玻片，非常小心地将盖玻片的一个边缘放在样品的一侧。慢慢降低另一边，直到它盖住样品。避免将盖玻片放在样品顶部，因为这会在样品上产生气泡。
11. 使用指甲油，描绘盖玻片的边缘并将盖玻片固定到载玻片上。
12. 等待它干燥并储存在 4 °C避光。

F. 图像采集和脱细胞量化
提示：使用低倍率物镜尽可能多地成像组织区域 (5 × – 20 × )。
1. 在成像前 30 分钟将样品置于室温下。
2. 用无绒纸和乙醇 70% 清洁载玻片。
3. 对原生组织样本进行成像，并将 UV（420 nm）曝光设置得尽可能高，而不会导致像素饱和（图 1B）。
4. 获取 5-10个相位对比和紫外荧光图像集（图 1A 和 1B）。
5. 使用相同曝光设置的图像去细胞样本（图 1C 和 1D）。

图1。小鼠膀胱（20 μm）去细胞化的代表性图像。
原生 (A) 和脱细胞 (C) 20 µm 小鼠膀胱组织切片的相差图像和相应的 UV 图像（分别为 B 和 D）。为了可读性，增加了相衬图像的对比度。

数据分析

1. 打开 ImageJ。
2. 将相位对比图像及其相应的 UV 图像拖动到 ImageJ。
3. 使用手绘选择工具，在相差照片中追踪样本的边缘。
4. 编辑 > 选择 > 创建蒙版，以获得图 2B。
5. 编辑 > 选择 > 创建选择。
6. 在 UV 图像上：Shift+E 应用选择（图 2C）。

图 2。脱细胞量化。
A. 20 µm 小鼠膀胱组织切片的相差图像，手绘轮廓为黄色。 B. 相应 UV 图像的 AC 感兴趣区域选择轮廓的掩码。比例尺 = 200 µm。

7. 分析 > 设置测量值 > 平均灰度值 > 确定。
8. 分析 > 测量。
9. 对所有原生和脱细胞图像重复此过程，以获得两组核染色的平均信号强度（图 3）。
提示：本协议中描述的方法是手动的。对于自动方法，您可以使用先前描述的脱细胞量化算法（Narciso 等人，2021）。

图 3。膀胱脱细胞的代表性信号量化结果。
左栏代表用 Hoechst 33342 染色的天然膀胱样本的平均紫外线强度信号 (± SD)，标准化为 100%，而右栏代表脱细胞膀胱切片的平均强度信号。

食谱

1. DNA酶溶液
试剂终浓度数量
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶 I 0.3毫克/毫升 3毫克
Tris-HCl（1 M，pH 8.0） 10% 100 µL
氯化镁2 10毫米 9.5 毫克
氯化钙2 10毫米 11 毫克
H 2 O（超纯）不适用 9.9 毫升
全部的不适用 10毫升

2. SD 2% 溶液
试剂终浓度数量
脱氧胆酸钠 2% 0.2克
H 2 O（超纯）不适用（直到达到总量 10 mL）
全部的不适用 10毫升

致谢

该协议源自先前发表的作品“Novel Decellularization Method for Tissue Slices” in Frontiers in Bioengineering and Biotechnology in March 2022 (Narciso et al., 2022) 。
作者承认收到的资金：IA 由 Ministerio de Ciencia e Innovación (PID2019-108958RB-I00) 资助 / AEI/ 10.13039/501100011033) 和 SEPAR (900-2019)。 MN 和 CJ 由 H2020 欧洲研究与创新计划根据 Marie Skłodowska-Curie 赠款协议“Phys2BioMed”合同号资助。 812772. 西班牙科学部资助了 RF、JO 和 NG，Innovation and Universities，分别为 PID2020-113910RB-I00-AEI/10.13039/501100011033、PGC2018-097323-A-I00 和 PID2020-116808RB-I00 AEI-Retos .

利益争夺

不存在利益冲突或利益冲突。

伦理

所有动物程序均由巴塞罗那大学机构委员会和地区当局动物实验委员会（Generalitat de Catalunya，OB 168/19 和 10972）批准。

参考

1. Burgstaller, G.、Oehrle, B.、Gerckens, M.、White, ES、Schiller, HB 和 Eickelberg, O.（2017 年）。肺的指导性细胞外基质：慢性肺病的基本组成和改变。欧洲呼吸杂志 50(1)：1601805 。
2. Elowsson Rendin, L., Lofdahl, A., Ahrman, E., Muller, C., Notermans, T., Michalikova, B., Rosmark, O., Zhou, XH, Dellgren, G., Silverborn, M.,等。（2019）。特发性肺纤维化中支架直接成纤维细胞的基质特性。国际分子科学杂志20(16)：4013。
3. Gattazzo, F.、Urciuolo, A. 和 Bonaldo, P. (2014)。细胞外基质：干细胞生态位的动态微环境。 Biochim Biophys Acta 1840(8)：2506-2519。
4. Junior, C.、Narciso, M.、Marhuenda, E.、Almendros, I.、Farre, R.、Navajas, D.、Otero, J. 和 Gavara, N.（2021 年）。基线硬度调节肺纤维化中细胞外基质拉伸的非线性反应。国际分子科学杂志22(23)：12928。
5. Marhuenda, E.、Villarino, A.、Narciso, ML、Camprubi-Rimblas, M.、Farre, R.、Gavara, N.、Artigas, A.、Almendros, I. 和 Otero, J. (2022)。肺细胞外基质水凝胶增强原代肺泡上皮细胞 II 型表型的保存。国际分子科学杂志23(9)：4888。
6. Mendibil, U.、Ruiz-Hernandez, R.、Retegi-Carrion, S.、Garcia-Urquia, N.、Olalde-Graells, B. 和 Abarrategi, A.（2020 年）。组织特异性脱细胞方法：实现再生化合物的基本原理和策略。国际分子科学杂志21(15)：5447。
7. Narciso, M.、Otero, J.、Navajas, D.、Farre, R.、Almendros, I. 和 Gavara, N. (2021)。量化组织切片去细胞化的基于图像的方法。国际分子科学杂志22（16）：8399。
8. Narciso, M.、Ulldemolins, A.、Junior, C.、Otero, J.、Navajas, D.、Farre, R.、Gavara, N. 和 Almendros, I. (2022)。组织切片的新型脱细胞方法。 Front Bioeng Biotechnol 10：832178。
9. Ohata, K. 和 Ott, HC (2020)。基于脱细胞基质支架作为生物平台的人体肺再生。今日外科杂志50（7）：633-643。
10. Wishart，AL，Conner，SJ，Guarin，JR，Fatherree，JP，Peng，Y.，McGinn，RA，Crews，R.，Naber，SP，Hunter，M.，Greenberg，AS 等。（2020 年）。脱细胞细胞外基质支架将全长胶原 VI 鉴定为肥胖和转移中乳腺癌细胞侵袭的驱动因素。科学进阶6（43）：eabc3175。
11. Wüthrich ，T.，Lese，I.，Haberthur，D.，Zubler，C.，Hlushchuk，R.，Hewer，E.，Maistriaux，L.，Gianello，P.，Lengele，B.，Rieben，R.，等。（2020 年）。使用灌注脱细胞和再细胞化开发血管化神经支架。 Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 117: 111311。
12. Zhu, M., Li, W., Dong, X., Yuan, X., Midgley, AC, Chang, H., Wang, Y., Wang, H., Wang, K., Ma, PX, et al . （2019）。体内工程化的细胞外基质支架，具有用于定向组织再生的指导性壁龛。国家通讯10（1）：4620。