材料与试剂

A. 蝇株和果蝇幼虫培养

1. mdr65-mtd：番茄（Benmimoun 等人，2020 年和图 1）

部分腹神经索中果蝇BBB的俯视图 (A) 和横截面正交视图 (B) 的共聚焦图像

2. 产卵板（50 毫米，深）（ Thermo Scientific，目录号：124-17），参见图 2A
3. 飞蛋产卵笼（自制，见图 2B）
4. 幼虫收集板（60 毫米培养皿）（Corning-Falcon，目录号：353004），参见图 2C

图 2. 苍蝇幼虫采集和培养材料

5. 活性干酵母（Genesee Scientific，目录号：62-103）
6. 玉米粉（ Limagrain ，目录号：WFMZ01HS）
7. 琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002-1KG）
8. 糖（Dominique Dutscher ，目录号：067508B）
9. 有机葡萄汁
10. 丙酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5561-1L）
11. 4-羟基苯甲酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：H3647）
12. 乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：24105）
13. 产卵培养基（见食谱）
14. 飞食（见食谱）

B. 病原体制备

1. 病原体生长培养基 [Brain Heart Infusion broth (BHI)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 或 de Man Rogosa Sharpe (MRS)]（BD Difco ，Millipore，目录号：237500、242820 或 288130）
2. 带盖圆底管（Fisher Scientific，Falcon，目录号：352059）
3. 用于分光光度计的微比色皿（ Dutscher ，Greiner Bio-One，目录号：613101）
4. 微量离心管（Fisher Scientific，Eppendorf，目录号：10708704）
5. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
6. 果蝇Schneider 培养基（Fisher Scientific，Gibco，目录号：21720-024）

C. 果蝇解剖

1. 细镊子（Fine Science Tools，Dumont #5，目录号：11252-20）
2. 组织培养皿（Fisher Scientific、Corning、Falcon，目录号：3530001）
3. 玻璃腔盘（Atom Scientific，目录号：SDCE4040-1）
4. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
5. 乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：493511）
6. 果蝇Schneider 培养基（Fisher Scientific，Gibco，目录号：21720-024）

D. CNS外植体培养

1. 24 孔细胞培养板（Fisher Scientific，Corning Falcon，目录号：353047）
2. 果蝇Schneider 培养基（Fisher Scientific，Gibco，目录号：21720-024）
3. l-谷氨酰胺（Fisher Scientific，Gibco，目录号：25030-032）
4. l-抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A4034）
5. 胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
6. CNS 培养基 I（见食谱）
7. CNS 培养基 II（见食谱）

E. 体内 CNS 感染

1. 细镊子（Fine Science Tools，Dumont #5，目录号：11252-20）
2. 移液器 Drummond Scientific 3.5''（ Dutsher ，Drummond Scientific，目录号：3-000-203-G/X）
3. 纳米注射器Nanoject III（ Dutsher ，Drummond Scientific，目录号：075250）
4. 矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
5. 显微镜载玻片（Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号：10219280）

F. 渗透性测定

1. 果蝇Schneider 培养基（Fisher Scientific，Gibco，目录号：21720-024）
2. 葡聚糖、德克萨斯红、赖氨酸可固定 10 KDa （ ThermoFisher ，目录号：11530236，Invitrogen D1863）
3. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
4. 4% 无甲醇甲醛（ ThermoFisher Scientific，目录号：28908）

G. 免疫组织化学

1. 4% 无甲醇甲醛（ ThermoFisher Scientific，目录号：28908）
2. Bouin 的解决方案（Sigma-Aldrich，目录号：HT10132）
3. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
4. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
5. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3608）
6. 正常山羊血清（Invitrogen，目录号：10000C）
7. Mowiol 封固剂（自制）或等效物
8. 显微镜载玻片（Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号：10219280）
9. 盖玻片（Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号：15707592）
10. 抗 GBS 抗体（Benmimoun 等人，2020）

H. 基因表达

1. 细镊子（Fine Science Tools，Dumont #5，目录号：11252-20）
2. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
3. 玻璃腔盘
4. RNeasy 迷你套件（QIAGEN，目录号：74104）
5. QuantiTect Rev. 转录试剂盒（QIAGEN，目录号：205311）
6. TaqMan 基因表达测定（ ThermoFisher ，目录号：4331182）
7. TaqMan Universal PCR Master Mix II（ ThermoFisher ，目录号：4440042）
8. 96 孔 PCR 板（例如，Bio-Rad，目录号：MLL9601）
9. PCR 板密封件（例如，Bio-Rad，目录号：MSB1001）

设备

1. 培养箱（ Memmert 、HPP110 或同等产品）
2. 搅拌器Titramax 100（ Heidolph Instruments，目录号：544-11200-00）
3. 分光光度计（Pharmacia， Novaspec II）
4. 离心机（Sigma Bioblock scientific，1-15K）
5. 微生物安全柱 ( HeraSafe KS9)
6. 火焰/棕色微量移液器拉拔器（萨特仪器型号 P-97）
7. 纳米注射器Nanoject III（ Dutsher ，Drummond Scientific，目录号：075250）
8. 激光扫描共聚焦显微镜 [Zeiss LSM 880 with Zen software (2012 S4)]
9. 实时 PCR 仪（例如， ThermoFisher ， StepOne实时 PCR 系统，目录号：4376357）

软件

1. 禅宗软件（2012 S4）
2. 斐济（ImageJ 2020 版 2.1.0/1,53c 和 1.52p 版；可在： https ://imagej.net/software/fiji/ 获取）
3. GraphPad Prism 软件 [版本 7 和版本 2020 8.4.2 (464)]
4. R、SPSS 或类似软件

程序

A. 果蝇幼虫培养

1. 在适当的温度下，在带有葡萄汁产卵板（辅以一点酵母膏，参见图 2A 和 2B）的笼子中设置苍蝇交叉 2~3 小时，以收集苍蝇胚胎（图 3A）。
2. 25 21 小时后 °C （或 18°C 下 48 小时），从盘子中取出已经孵化的幼虫。然后，在每小时，收集和转移相等数量（约 100）的孵化第一龄幼虫到标准食品板在适当的温度（29 °C 用于 RNAi 击倒，例如）（图 2C 和 3B-C）。
3. 让幼虫生长，然后从适当的发育阶段收集它们进行实验。值得注意的是，到目前为止，第三龄幼虫已经完成了病原体感染（25°C 时 +72 小时）（图 3D）。

图 3.果蝇幼虫培养程序示意图

B. 病原体制备

1. 在适当的生长介质（BHI、YPD、MRS 等）和适当的温度（30 °C 或 37 °C）（图 4A）下，从 -80 °C 甘油库存中设置过夜细菌或 36 小时酵母预培养。
2. a) 对于细菌，在相应的生长培养基中以 1/20 稀释过夜预培养物，并让它们生长至指数中期（GBS 在 37 °C 下约 2 小时 30 分钟）（根据细菌菌株进行调整））（图 4B）。
600 = 0.2时稀释过夜预培养，并允许它们在 30 °C 下生长 5-6 小时，直到 OD 600为 1（根据菌株进行调整）（图 4B）。
3. 在 OD 600 m测量后（图 4C），通过在 3,500 x g和 4 °C 下离心 5 分钟，将病原体颗粒化。
4. g和 4 °C下离心 5 分钟以沉淀病原体。执行此步骤两次（图 4D）。
5. Drosophila Schneider 培养基中清洗病原体培养物，然后在 3,500 x g和 4 °C 下离心 5 分钟（图 4E）以沉淀病原体。
6. a) 对于离体 CNS 感染协议：将病原体重新悬浮在 750 µL 的果蝇施耐德培养基中（图 4F），以制备 10 ×感染剂量并将它们保持在 4 °C 直至使用（例如：10 × 10 8 CFU /mL 用于无乳链球菌、肺炎链球菌、无害李斯特菌和单核细胞增生李斯特菌；10 × 10 7 CFU/mL 用于脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌和光滑念珠菌， 10 × 10 5 CFU/mL 用于新型隐球菌）。
b) 对于体内 CNS 感染协议：在 100 μL 的果蝇施耐德培养基（图 4F）中重新悬浮病原体，通过注射20 nL 的浓缩病原体（例如，达到血淋巴中的感染剂量（估计为 2 μL ） : 4.4 × 10 10 GBS/mL无乳链球菌)。
600相关性计算病原体浓度（无乳链球菌、肺炎链球菌、无害李斯特菌和单核细胞增多性李斯特菌：1 OD 600 = 8.8 × 10 8 CFU/mL；脑膜炎奈瑟球菌：1 OD 600 = 10 9 CFU/mL；念珠菌白色念珠菌和光滑念珠菌：1 OD 600 = 3 × 10 7 CFU/mL；新型隐球菌：1 OD 600 = 6 × 10 7 CFU/mL）。

图 4. 病原体制备程序示意图

C. CNS外植体培养和离体中枢神经系统感染

1. 在 PBS 和乙醇 70% v/v 水中依次洗涤分阶段的幼虫，并将它们转移到冷水中果蝇Schneider 培养基在解剖孔内。
2. 通过 (a) 从后气门切割约四分之一处切割幼虫，以尽量减少对运动神经的损害，(b) 将前部由内而外翻转以暴露中枢神经系统 [图 5A 并观看视频（Hafer 和 Schedl，2006） ].保留除肠道以外的所有幼虫组织（以避免被肠道共生病原体污染）。
3. 将八只幼虫转移到一口井（24 孔细胞培养板）中，并在 750 μL的 CNS 培养基 I中轻轻旋转搅拌（275 rpm）培养它们在 30°C 和 60% 湿度下（图 5B）。
注意：选择 30°C 的温度作为折衷温度，以允许果蝇发育，同时培养更接近其通常环境的哺乳动物病原体。
4. 将 CNS 培养基 I（图 5C）中每种病原体制备的 10倍感染剂量的1/10 稀释，以达到适当的感染剂量（参见步骤 B6a）。
5. 果蝇施耐德培养基替换受感染的培养基，辅以 2 mM l-谷氨酰胺、0.5 mM 钠l-抗坏血酸钠和 1%胎牛血清。将培养物置于 30°C 和 60% 的湿度下，在温和的旋转搅拌（275 rpm）下放置一段规定的时间（GBS 为 3 小时；在没有致病性接种的情况下，控制条件必须保持相同的时间）。
6. 3 小时后和每 10 小时更换一次培养基，用新鲜培养基（果蝇施耐德培养基补充 2 mM l-谷氨酰胺、0.5 mM 钠l-抗坏血酸钠和 1%胎牛血清）
注意：在这些条件下，CNS 外植体可以在 30°C 下保存长达 48 小时。
7. 继续进行每个不同分析（D、E 和 F）所需的处理。

图 5. 体外 CNS 感染程序的示意图

D. 致病显微注射和体内中枢神经系统感染

1. 拉注射用微量移液器（热：350-360 ，拉：60-80，速度：100，时间：150）。这一步可以提前完成。
2. 使用针头和注射器（图 6A），用矿物油填充完全准备好的微量移液器。
3. 将装满矿物油的微移液器连接到喷油器头上（图 6A）。
4. 弹出部分矿物油，并用准备好的浓缩病原体填充微量移液器（图 6A）（通过在微量移液器中形成两个不同的阶段，这将避免注射器头被病原体污染）。
5. 在 PBS 和乙醇 70% v/v 中依次清洗分阶段的幼虫，并将它们转移到解剖井内的冷果蝇施耐德培养基中。
6. 一个接一个地干燥幼虫，将它们放在一张幻灯片上，然后使用纳米注射器（图6B）轻轻注入 20 nL的果蝇施耐德培养基（模拟控制）或在其后部准备好的病原体。这种注射应该非常温和地完成，只刺穿角质层而不影响其他组织。我们选择注射后部，因为它远离中枢神经系统。
7. 在 30°C 和 60% 湿度的培养箱中，将注射的幼虫放在标准的苍蝇食物板上，直到进行分析。
笔记：
a. 所有注射过的幼虫都会出现黑色化斑点，它会封闭和治愈被注射刺破的角质层。
b. 以及潜在的温度引起的压力 (30 °C)的结合，模拟注射本身会导致致命性。在我们手中，大约 10% 的 GBS 注射幼虫在注射后 4 小时存活（所有动物在注射后 4 到 6 小时之间死亡），而大约 40% 的模拟注射幼虫在注射后 4 小时存活（Benmimoun 等人）等人，2020 年）。

图 6. 体内 CNS 感染程序的示意图

E. 血脑屏障通透性测定

1. 在 CNS 培养基 II 中制备 10 KDa葡聚糖德克萨斯红 (50 mM) 的溶液。
2. 改变 CNS 培养基，并在搅拌（275 rpm）下用该溶液孵育 CNS 外植体 30 分钟。
3. CNS 外植体立即在 4% 无甲醇甲醛中固定 4 × 5 分钟（以洗掉多余的葡聚糖）。
4. 清洗 3 × 10 分钟。
5. 解剖 CNS 并将样品安装在安装介质中。
6. 使用激光扫描共聚焦显微镜进行可视化，每个切片之间的最佳距离为 0.38 μm 。

F. 免疫组织化学

该协议是对果蝇幼虫 CNS进行免疫化学的经典通用协议。对于感染，我们使用它来评估病原体在 CNS 内的定位，方法是使用针对感兴趣菌株的特异性抗体（ Benmimoun等人，2020 年），以及细胞命运（抗 Deadpan、抗 Repo 和抗ElaV抗体）、形态学和增殖（抗磷酸化组蛋白3）。它还可以检测融合蛋白（抗 GFP 抗体）。抗原和抗体存在一种变体（使用Bouin 的溶液，见下文），它们不适用于经典的甲醛固定（例如，抗 Neurexin-IV 抗体， Babatz 等人，2018 年）。
1. Fix （由内而外的幼虫离体，或解剖并由内而外翻转体内注射的幼虫）。
a. 在室温下在 4% 无甲醇甲醛中放置 30 分钟，或在 4°C 下放置过夜。
b. 在Bouin溶液中室温放置 3 分钟。
2. 清洗 3 × 10 分钟。
3. 渗透 3 × 10 分钟。
4. 我在 4°C 的封闭溶液（PBS-Triton 0.3%、牛血清白蛋白 5%、正常山羊血清 2%）中与初级抗体孵育 18-36 小时。
值得注意的是：某些致病菌株（例如，乳酸病原体，如 GBS 或肺炎链球菌）感染后可能会发生培养基酸化。如果是这样，应使用抗 GFP 抗体检测所有 GFP 融合。
5. 清洗 3 × 10 分钟。
6. 在封闭液中孵育二抗在室温下放置 3 小时，或在 4°C 下放置 18-24 小时。
7. 清洗3 × 10 分钟。
8. 解剖 CNS 并在Mowiol安装介质中安装样品。
9. 使用激光扫描共聚焦显微镜进行可视化，每个切片之间的最佳距离为 0.38 μm （图 7）。

图 7. 使用特定 GBS 抗体显示 GBS（附着在 BBB 或大脑内部）的共聚焦图像

G. 病原体负荷（CFU 量化）

1. 在没有组织固定的情况下，用 70% 的乙醇在纸上清洗五只注射过的苍蝇（按条件）。
2. μL的PBS中打开并放血幼虫，并将它们的血淋巴汇集（放在冰上）。
3. μL的 PBS中解剖、转移和均化 CNS （保持在冰上）。
4. μL的 PBS中转移和均化其余的幼虫尸体（除肠道外的其他组织）（保持在冰上）。
5. 在 20 μL的 PBS 中为每个测试的组织（血淋巴、CNS、尸体）准备七次连续十倍稀释，其中 2 μL 。
6. 板 2 x 4 μL ，用于病原体培养基琼脂糖板上的每个稀释度。
7. 在量化之前，将板在 37°C 下孵育 16 小时。
注意：虽然这些步骤是针对体内感染进行描述的，但只有 CNS 细菌负荷才能确定用于体外感染。为此，请仅执行步骤 3 和 5 – 6。

H. 用于基因表达的 qPCR

1. 在所需时间（GBS 感染后 3 小时或 6 小时）用细镊子解剖 9–12 CNS，并将每个解剖的 CNS 直接转移到冰上 RNeasy Mini 套件的裂解缓冲液中。
2. 根据制造商的说明分离 RNA。
3. 直接进行cDNA合成。每个反应使用 450–600 ng RNA。将剩余的分离 RNA 储存在-80°C。
4. 设置最终体积为 10 μL 的 qPCR 反应。
5. 仔细密封板并在离心机中以 3,000 rpm 的速度将它们旋转约 2 分钟。
6. 运行 qPCR。
7. 分析 qPCR 数据（参见数据分析）。
注意事项：
a. 每个反应 50 ng cDNA 通常足以获得合理的循环阈值 (Ct) 值。
b. Rpl32 可用作管家基因。

数据分析

A. 果蝇中枢神经系统的病原体定量

成像后（免疫组织化学）
1. mdr65- mtd:: Tomato）边界内包含的每个细菌进行计数，手动确定每个分析的 CNS 病原体的确切数量。
2. t检验（两种条件）或单向方差分析，然后进行 Tukey 事后分析（超过两种条件），比较病原体进入中枢神经系统).否则，使用非参数 Mann–Whitney 检验（两个条件）或 Kruskal–Wallis 检验（两个以上条件）。

致病负荷后（CFU 量化）
1. 计算每个稀释度的细菌菌落 (CFU)（如果可能，即当可检测到分离的单个菌落时）。
2. 按条件计算 CFU/µL（细菌负荷）的平均值。
3. 以 log10 比例表示每个幼虫的细菌负荷。
4. 对于体内感染，计算原始计数的比率并以 log10 比例表示：
a. 血淋巴比率= log10（每个 CNS的cfu /每个血淋巴的cfu ）
b. CNS/其他组织比率 = log10（每个 CNS的cfu /每个其他组织的cfu ）
c. CNS /（血淋巴+ 其他组织）比率 = log10 [每个 CNS 的 cfu /（每个血淋巴的cfu +每个其他组织的cfu ）]。

B. 血脑屏障通透性测定

1. 计算三个选定的相同大小区域的德克萨斯红像素强度 (300 × 300 µm) 来自每个 CNS。
2. 计算平均像素强度的平均值。
3. 计算背景强度（空等尺寸区域 300 × 300 µm）。
4. 通过从平均像素强度的平均值中减去背景强度来计算渗透率指数。
5. t检验（两种条件）或单向方差分析，然后进行 Tukey 事后分析（超过两种条件）来比较渗透率指数。否则，使用非参数 Mann–Whitney 检验（两个条件）或 Kruskal–Wallis 检验（两个以上条件）。

C. 基因表达水平的量化

1. 使用至少三个生物和三个技术复制执行 qPCR。
2. 计算每个样本的技术重复的平均值。
3. 通过从感兴趣的基因中减去管家基因的平均 Ct 来计算 ΔCt。
4. 通过计算作为校准器的对照组（未感染）的 ΔCt 的平均值来计算 ΔΔCt。然后，从每个生物复制的每个计算的 ΔCt 中减去校准器。
5. 为了更容易表示表达水平，可以通过计算折叠基因表达水平将数据标准化为未感染的对照。为此，为每个生物复制计算两个负 ΔΔCt (2 -ΔΔCt ) 的幂。
6. 对于统计分析，首先测试计算的倍数基因表达水平的正态分布（例如，通过使用 Shapiro – Wilk 测试）。当正态分布时，执行学生的 t-检验；如果不是正态分布，则执行 Mann – Whitney U 检验。在箱线图中表示数据。

D. 体内感染果蝇的存活率

1. 对超时生存（每 30 分钟）进行评分，并使用对数秩检验比较生存曲线。当考虑两个以上的条件时，应通过 Holm– Sidak方法通过堆叠p值分析确定其统计显着性 (alpha = 0.05) 来调整p值。
2. 将数据表示为 Kaplan–Meier 曲线，误差条对应于标准误差 (SE)。

食谱

1. 产卵培养基
试剂终浓度数量
琼脂 22.2克/升 22.2 克
糖 25克/升 25 克
有机葡萄汁 25% 体积比 250毫升
4-羟基苯甲酸甲酯（20% 乙醇溶液） 0.25% 体积比 12.5 毫升
纯净水（反渗透）不适用 900 毫升
全部的不适用 ~1 升

2. 飞食
试剂终浓度数量
活性干酵母不适用 300克
玉米粉不适用 211 克
琼脂不适用 46 克
糖不适用 300克
丙酸 0.40% 体积比 25 毫升
4-羟基苯甲酸甲酯（20% 乙醇溶液） 0.25% 体积比 75 毫升
纯净水（反渗透）不适用 6.3 公升
全部的不适用 6 升（烹饪后）

3. CNS 培养基 I
试剂终浓度数量
l-谷氨酰胺 (200 mM) 2毫米 100微升
L-抗坏血酸钠 (500 mM) 0.5毫米 10微升
果蝇Schneider 培养基不适用 9.89毫升_
全部的不适用 10毫升

4. CNS 培养基 II
试剂终浓度数量
l-谷氨酰胺 (200 mM)
L-抗坏血酸钠 (500 mM)
胎牛血清_ 2毫米
0.5毫米
1% 100微升
10微升
100微升
果蝇Schneider 培养基不适用 9.79 毫升
全部的不适用 10毫升

致谢

我们感谢 S. Dramsi 、C. d' Enfert 、G. Janbon 、F. Leulier 、M.-K。 Taha、O. Disson 、M. Lecuit和 F. Schweisguth用于试剂和菌株。我们感谢 S. Liégeois在果蝇幼虫血淋巴注射和 CFU 计数方面的帮助。我们感谢 D. Briand 在 qPCR 方面的技术帮助。这项工作得到了Institut Pasteur/ LabEx Revive 的启动包和Agence的 JCJC 赠款的资助 Nationale de la Recherche（ NeuraSteNic ，ANR-17-CE13-0010-01）到 PSBB 得到了 Roux- Cantarini （巴斯德研究所）和LabEx Revive 博士后奖学金的支持。
该协议改编自之前的工作（ Benmimoun等人，2020 年；Winkler 等人，2021 年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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