材料和试剂

A. 酵素

1. 具有适当缓冲液的高保真 DNA 聚合酶（例如，platinum SuperFi II 聚合酶，Invitrogen TM ，目录号：12361010）
2. 限制酶克隆 BsmBI-v2 与适当的缓冲液（New England Biolabs Inc.，目录号：R0580 ）
3. 限制酶克隆 BsaI-HFv2 使用适当的缓冲液（New England Biolabs Inc.，目录号：R3733 ）
4. 具有适当缓冲液的 T4 DNA 连接酶（例如，Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：EL0014）
5. Gateway LR clonase II 酶与适当的缓冲液混合（Invitrogen TM ，目录号：11791100）
6. GoTaq 绿色预混液（Promega TM ，目录号：M7122）

B. 克隆载体

1. attL位点的载体（例如， pENTR TM /D-TOPO TM ）
2. LM22_ attL1 （Addgene，目录号：184008）
3. LM22_ attL2 （Addgene，目录号：184010）
4. 通用 GoldenBraid 受体（例如， pUPD2）
5. Golden Gate 受体载体（例如，pICSL86900OD）
6. 选择的网关表达载体

C. 套件

1. 凝胶提取试剂盒（例如， QIAEX II、QIAGEN TM ，目录号：20021）
2. 质粒小量制备试剂盒（例如，GeneJET、Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：K0702）

D. 其他

1. dNTP，10 mM（Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：R0192）
2. PCR引物
3. DN无硒水和 RN无硒水
4. PCR 管，0.2 mL（Axygen TM ，目录号：14-222-262）
5. 6 ×加载染料（New England Biolabs Inc.，目录号：B7024S）
6. 1 Kb 加 DNA ladder（例如， Invitrogen TM ，目录号：10787018）
7. 琼脂糖 1.5% 凝胶（BioBasic，目录号：AB0014）
8. SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂（Invitrogen TM ，目录号：S33102）
9. 大肠杆菌DH10α 化学感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：18265017）
10. 具有适当抗生素的 LB 板、IPTG（Fermentas，目录号：R0392）和 X-gal 底物（Fermentas，目录号：R0401）
11. 氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
12. Esp31（Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：ER0451）
13. Eco31I（Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：ER0291）
14. GoldenBraid (GB) 反应（TV = 10 µL）（参见食谱）
15. LB 培养基（见食谱）
16. 金门反应（TV = 10 µL）（参见食谱）
17. LR 反应（TV = 5 µL）（参见食谱）

设备

1. PCR 循环仪（Mastercycler® nexus，目录号：6330000021 ）
2. 微波炉
3. 凝胶电泳室
4. 蓝光透照仪（Safe Imager TM 2.0，目录号：G6600）
5. NanoDrop TM OneC Microvolume UV-Vis 分光光度计（Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：13-400-519）
6. 加热块 42 摄氏度
7. ColiRollers TM电镀珠， Novagen ® （Sigma-Aldrich TM ，目录号：71013-3）
8. 37 °C培养箱

软件

1. 基准研发云 ( https://www.benchling.com/ )

程序

A. 引物设计

1. 引物应根据 GoldenBraid 句法设计，包括 BsmBI (Esp3I) 限制位点，然后是 pUPD2 和双肢的 GoldenBraid 融合位点（图 1A）。
2. 如果感兴趣的基因或 DNA 片段的序列存在 BsmBI (Esp31) 或 BsaI 限制性位点，则应将该片段分成子片段，在引物中插入同义突变以使限制性位点沉默（Patron等人，2015 年） ).
3. 或者，可以使用带有 BsaI 位点而不是 BsmBI 位点的引物扩增目标基因，带有正向悬垂 GGGGTCTCAAATG 和反向悬垂 GGGGTCTCAAAGC（图 1B）。 PCR 产物可直接用于 Golden Gate 反应，无需 pUPD2 克隆步骤。

图 1.根据Vazquez-Vilar 的说法，将attL序列和目标基因克隆到 GoldenBraid 砖中的引物设计等。 (2017)。引物旨在使用标准 (A) 或替代 (B) BiG 协议。绿框：BsmBI 识别位点与 pUPD2 融合位点（下划线）；橙色框：融合站点遵循Golden Gate汇编语法；紫色框：扩增attL或目标基因的特定序列；蓝框：BsaI识别位点； RC：反向补码。

B. GoldenBraid brick组装成 pUPD2 载体

1. DNA 聚合酶（如铂金 SuperFi II 聚合酶）通过触地式 PCR单独扩增attL1和attL2片段以及目标基因。
a. 使用 pENTR TM /D-TOPO TM载体作为 DNA 模板来扩增attL1和attL2序列。
b. 根据酶制造商的说明，以 50 μL 的最终体积进行 PCR 反应。
c. Touchdown PCR 步骤：98℃ 1 分钟，98℃ 30 秒，合适的熔解温度 30 秒，65℃ 1 分钟，从 66℃ 熔解温度开始，递减 1° 共 9 个循环C 每个循环，加上 30 个循环，98°C 30 秒，54°C 30 秒，65°C 1 分钟，并以 65°C 结束 3 分钟。
2. 将上样染料添加到 PCR 样品中至终浓度为 1倍，并使用总 PCR 反应体积和 1 Kb 加 DNA 梯度在 1.5% 琼脂糖和 0.002% SYBR TM Safe DNA 凝胶染料中进行电泳。
3. 通过在蓝光透射仪中进行可视化，确认 PCR 扩增和扩增子大小 150 pb。
4. attLs或目标基因片段对应的 DNA 条带，并使用凝胶提取试剂盒将其从琼脂糖中纯化。
注意：可以直接从中国产品中进行纯化。
5. 使用分光光度计量化 DNA 浓度。
6. 通过使用 BsmBI 限制酶和 T4 DNA 连接酶的组装反应，将attL1、attL2和目标基因片段克隆到 GoldenBraid 受体载体（例如pUPD2）中（图 2）。
a. 根据配方 1（参见配方）设置 GoldenBraid 反应。
b. 热循环仪步骤：37 °C 10 分钟，然后是 37 °C 3 分钟和 25 °C 4 分钟的 30 个循环，最后以 37 °C 10 分钟和 80 °C 5 分钟结束。

图 2. GoldenBraid积木组装示意图。 attL和靶基因单个 PCR 片段（顶部）两侧是 BsmBI（深绿色框）、pUPD2 融合位点（浅绿色框）和金门融合位点（浅蓝色框）以及 pUPD2 载体（中间）提交给 GoldenBraid 反应以获得第一块砖（底部）。所有融合位点都在有义方向。

7. 转化大肠杆菌DH10α 化学感受态细胞与总组装反应体积。
8. 使用 LB 上的电镀珠（参见配方 2）与氯霉素 (25 μ L/mL)、IPTG (1 mM) 和 X-gal (200 μ g/mL)对细胞进行镀层，并在 37 °C 下孵育细胞板过夜。
9. 从两到五个分离的白色菌落中选择，并使用 GoTaq 绿色主混合物挑选它们来执行 PCR 菌落，以确认组装结构。
使用每个克隆的 DNA 序列的特定引物执行 PCR 菌落。
10. 用氯霉素（25 μL/mL）在液体 LB 培养基中接种单个阳性菌落，并在 37°C 下孵育过夜。
11. 使用质粒 Miniprep 试剂盒从液体培养物中提取质粒 DNA，并用分光光度计量化 DNA 浓度。

C. 金门大会

1. 使用 BsaI 限制酶和 T4 DNA 连接酶（图 3），使用attL1 -pUPD2、 attL2 -pUPD2、目标基因 pUPD2 和 GG 受体载体（例如pICSL86900OD）执行金门 (GG) 组装。
a. 根据配方 3（参见配方）设置 Golden Gate 反应。
b. 热循环仪步骤：37 °C 10 分钟，然后是 37 °C 3 分钟和 25 °C 4 分钟的 30 个循环，最后以 37 °C 10 分钟和 80 °C 5 分钟结束。

图 3. 产生 BiG 入口向量的示意图金门组装。使用 pICSL86900OD 载体将带有attL和目标基因的单个brick提交给金门反应。

2. 如前所述，将具有总组装反应体积的大肠杆菌DH10α化学感受态细胞和具有适当抗生素的选择性 LB 培养基上的平板转化。
3. 通过执行 PCR 菌落从两到五个分离的白色菌落中选择。然后，一个菌落可用于在质粒 DNA 提取后在液体 LB 培养基中培养细胞。
a. 使用每个克隆的 DNA 序列的特定引物执行 PCR 菌落。

D. LR反应

1. 使用 GoldenGate 进入向量执行 LR 反应，该向量包含两侧有attL站点的感兴趣的基因和选择的网关表达向量。
过夜孵育，使用制造商方案指示的一半体积进行 LR 反应（参见配方 4）。
2. 如前所述，用 LR 反应转化大肠杆菌DH10α 化学感受态细胞，并在选择性 LB 培养基中加入适当的抗生素。
3. 从 PCR 菌落选择的阳性菌落中提取质粒 DNA 可用于进一步的实验。

数据分析

为确认核苷酸序列和 DNA 结构的正确组装，可将小量制备样品送去进行 Sanger 测序。

笔记

1. attL -pUPD2 GoldenBraid砖块的大肠杆菌液体培养物可用于制备甘油原液并储存在 -80 °C 下，以备将来与不同目标基因组装。此外，这些载体在质粒库Addgene 中作为LM22_attL1 （目录号：184008）和 LM22_attL2 （目录号：184010）提供。
2. BsmBI 限制酶可以替代Esp31（Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：ER0451）。
3. BsaI 限制酶可以替代Eco31I（Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：ER0291）。
4. Golden Gate 融合位点是根据 GoldenBraid 标准（Vazquez-Vilar等人， 2017）定义的。然而，可以使用不同的融合位点。

食谱

1. GoldenBraid (GB) 反应（TV = 10 µL）
试剂终浓度数量
T4 DNA 连接酶缓冲液 (10 × ) 1 × 1.0 微升
限制酶特异性缓冲液 (10 × )。 1 × 1.0 微升
T4 DNA连接酶 -- 1.0 微升
BsmBI 限制酶 -- 1.0 微升
GB 受体载体（例如，pUPD2） 10 微升-1 100纳克
DNA片段 5 – 10 微升-1 50 – 100 纳克
不含 DNase 和 RNase 的水 -- 适量 10 微升

2. LB 培养基 (TV = 1L)
试剂终浓度数量
胰蛋白胨 -- 10克
酵母抽提物 -- 5克
氯化钠 1M 5克
对于固体培养基，添加终浓度为 8% 的琼脂。

3. 金门 (GG) 反应（TV = 10 µL）
试剂终浓度数量
T4 DNA 连接酶缓冲液 (10 × ) 1 × 1.0 µL
限制酶特异性缓冲液 (10 × ) 1 × 1.0 微升
T4 DNA连接酶 -- 1.0 微升
BsaI限制酶 -- 1.0 微升
GG 受体载体（例如，pICSL86900OD） 15 微升-1 150纳克
attL1 -pUPD2 5 – 10 微升-1 50 – 100 纳克
attL2 -pUPD2 5 – 10 微升-1 50 – 100 纳克
靶基因-pUPD2 5 – 10 微升-1 50 – 100 纳克
不含 DNase 和 RNase 的水 -- 适量 10 微升

4. LR 反应（TV = 5 μL）
试剂1 终浓度数量
LR 克隆酶 II 混合物 (5 × )。 1 × 1.0 微升
网关表达载体 15 微升-1 150纳克
大入口向量 15 微升-1 150纳克
Tris-EDTA (TE) 缓冲液 pH 8.0 -- 适量 5 µL
1室温过夜孵育。

致谢

这项工作得到了圣保罗研究基金会 - FAPESP（2018/17441-3、2019/20157-8、2020/12940-1、2021/14640-8）和高等教育人员改进协调会 - CAPES 的支持（88882.461731/2019-01；88887.309513/2018-00 和 88887.613665/2021-00）。该协议改编自我们最近的工作（Ferigolo等人，2022）。

利益争夺

作者声明非金融竞争利益。

参考

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Ferigolo, LF、Vicente, MH 和 Nogueira, FTS (2022)。 Brick into the Gateway (BiG)：一种结合 Golden Gate 和 Gateway 方法的快速克隆新方法质粒121： 102630。
Gibson, DG、Young, L.、Chuang, RY、Venter, JC、Hutchison, CA, 3rd 和 Smith, HO (2009)。高达数百个碱基的 DNA 分子的酶促组装。国家方法6(5)：343-345。
Geu-Flores, F.、Nour-Eldin, HH、Nielsen, MT 和 Halkier, BA (2007)。 USER 融合：一种快速高效的同时融合和克隆多个 PCR 产物的方法。核酸 Res 35(7): e55。
Hansen, NB、Lübeck, M. 和 Lübeck, PS (2014)。将 USER 克隆推进到简单的 USER 和切口克隆。 J Microbiol Methods 96 ：42-49。
Karimi, M.、Depicker, A. 和 Hilson, P. (2007)。用植物网关载体进行重组克隆。植物生理学145(4)：1144-1154。
Marillonnet, S. 和 Grützner, R. (2020)。使用金门克隆和分层模块化克隆管道的合成 DNA 组装。 Mol Biol 130 (1)中的 Curr Protoc 。 https://doi.org/10.1002/cpmb.115 。
Patron, NJ、Orzaez, D.、Marillonnet, S.、Warzecha, H.、Matthewman, C.、Youles, M.、Raitskin, O.、Leveau, A.、Farre, G.、Rogers, C. 等阿尔。 (2015)。植物合成生物学标准：DNA 部分交换的通用语法。新植醇208(1)：13-19。
Zhu, B.、Cai, G.、Hall, EO 和 Freeman, GJ (2007)。 In-Fusion TM组装：多结构域融合蛋白、模块化载体和突变的无缝工程。生物技术43 (3)：354-359。