材料和试剂

克隆
解剖刀
移液器吸头，过滤，无菌，0.5–1,250 µL ( Biozym 超人)
1.5 mL 管（Eppendorf，目录号：0030121872）
96 孔 PCR 板（ Biozym Scientific，目录号： 710880）
96 孔深孔板，2.2 mL，V 形底（ Biozym Scientific，目录号： 710850)
LentiGuide-Puro-P2A-EGFP ( Addgene , Plasmid #137729) (Panda et al. , 2020)
BsmBI-v2（新英格兰生物实验室，目录号：R0739L）
NEBuffer r3.1（新英格兰生物实验室，目录号：B6003S）
双蒸水 (ddH 2 O)
南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289L）
南极磷酸酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0289S）
琼脂糖（Sigma Aldrich，目录号：A9539）
Monarch® DNA凝胶提取试剂盒（New England Biolabs，目录号： T1020L)
T4 DNA 连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
T4 DNA 连接酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S）
T4 多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201L）
NEB 稳定感受态大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C3040H）
LB 培养基（Carl Roth，目录号：X964.4）
LB 琼脂（Carl Roth，目录号：6671.2）
羧苄青霉素（Carl Roth，目录号：6344）
培养皿，方形，12 × 12 厘米（Greiner Bio-One，目录号：688161）
接种环（ Sarstedt ，目录号： 86.1562.050）
Monarch质粒小量制备试剂盒（New England Biolabs，目录号： T1010L)

细胞培养
无菌平底 96 孔板（Greiner，目录号：655180）
圆底 96 孔板（Greiner，目录号：650188）
10 厘米2 个盘子（Greiner，目录号：655160）
24 孔细胞培养板（ Stölzle Oberglas ，目录号：GR-662160）
注射器过滤器 0.45 µm，直径 33 mm（M&B Stricker，目录号：99745）
无菌蒸馏水（ Ecotainer ，Braun，目录号：82479E-E）
DMEM 高葡萄糖，无谷氨酰胺，10 × 500 mL（Life Tech，目录号：11960085）
胎牛血清（FBS），热灭活（Sigma-Aldrich，目录号：F9665-500ML）
L-谷氨酰胺 200 mM（100 × ），液体（Gibco，目录号：25030024）
青霉素-链霉素，10,000 U/mL（Life Tech，目录号：15140122）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，10 × ，pH 7.2 – 10（Life Tech，目录号：70013065）
胰蛋白酶，0.25%（1 × ），含 EDTA 4Na，液体（Gibco，目录号：25200056）
Lenti -X 293T 细胞（Takara bio，目录号：632180）
psPAX2（包装质粒）（ Addgene ，目录号：12260）
pMD2.G（包装质粒）（ Addgene ，目录号：12259）
聚乙烯亚胺HCl MAX，线性，MW 40,000 (PEI)（ Polysciences Europe，目录号：24765-1）
PEI 库存：根据供应商的协议，水中 1 mg/mL
聚凝胺转染试剂（Merck，目录号：TR-1003-G）
寡核苷酸
来自 Integrated DNA Technologies (IDT) 的 96 孔板预混 DNA 寡核苷酸引物
hU6 prom_fwd GACTATCATATGCTTACCGT
聚凝胺原液：10 mg/mL 无菌水

设备

单通道移液器，0.5–1000 µL（Eppendorf Research）
多通道移液器，1–200 µL ( Thermo Scientific Finnpette F2)
热混合器（Eppendorf，目录号：5355）
热循环仪 S1000（Bio-Rad，目录号：1852196）
培养箱（ Thermo Scientific，目录号：51029323）
摇床（GFL，目录号：3015）
台式微量离心机 (Eppendorf 5424)
Vortex（Scientific Industries，型号：Vortex Genie 2）
分光光度计（Spark、Tecan）
培养箱（ Thermo Scientific Heraeus，BBD 6220）
培养箱设置：37 °C，5 % CO 2 ，95 % 相对湿度
离心机（Eppendorf，5810，配备位于 BSL2 实验室的气溶胶密封桶）
设备齐全的生物安全 2 级实验室，经授权可处理病毒颗粒 (BSL 2)
IQue Screener Plus [ Intellicyt ，配备读板器、蓝色 (488 nm) 和红色 (640 nm) 激光]

软件

Geneious Prime 2022.0.2
Forecyt标准版 7.0 (R2) (7.0.7035)
微软Excel
R工作室版本：1.3.1056

程序

指导 RNA (gRNA) 设计

使用用户友好的 VBC 分数在线工具 ( https://www.vbc-score.org/ ) ( Michlits et al., 2020) 选择靶向目标基因的 gRNA。建议每个目标选择两到三个 gRNA 基因。高 VBC 分数表示高靶向效率和低脱靶效应。克隆所需的完整寡核苷酸序列可在该工具提供的 Microsoft Excel 文件的“ GeCKO_cloning_FW ”和“ GeCKO_cloning_RV ”列中找到。寡核苷酸序列如下：

寡核苷酸正向：5'- CACCG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
反向寡核苷酸：3'- C NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA -5'

注意：PAM 序列不包含在引物中，但在“sgRNA + NGG”列中指定。

https://eu.idtdna.com )订购 96 孔板格式的预混合 gRNA（正向和反向）寡核苷酸，如下所示：

印版规格
规模： 25 nmol DNA
纯化：标准脱盐
板材类型：聚合酶链反应
加载方案井中正向/反向混合
船运：
正常化： nmol/孔
每孔用量： 4个纳米
如果潮湿：终浓度 40 微摩尔
最终卷 100 微升/孔
缓冲： IDTE 缓冲液 pH 8.0

gRNA表达载体的制备

使用限制酶 BsmBI-v2 （图 2A）在 55°C 下消化 5，000 ng LentiGuide-Puro-P2A-EGFP 骨干（图 1）2 小时。
零件体积/数量
LentiGuide-Puro.P2A-EGFP 5,000 纳克
BsmBI-v2 3 µL
NEBuffer 3.1 5 µL
DDH 2 O 高达 50 µL （= 最终体积）

Addgene的 LentiGuide-Puro-P2A-EGFP （质粒 #137729）

对于去磷酸化，将以下试剂添加到步骤 B1 的消化反应中，并在 37°C 下孵育 1 小时。
零件体积
南极磷酸酶 1 微升
南极磷酸酶缓冲液 6 µL
DDH 2 O 3 µL
全部的 60 微升

在 0.7% 琼脂糖凝胶上将主干（约 9，000 bp）与填充片（1，885 bp）分开。将未消化的主干等分试样添加到单独的凝胶袋中进行比较，并验证主干的成功消化。用手术刀切除大约 9 kb 的条带，并用凝胶提取套件进行纯化。在 30–50 µL ddH 2 O中洗脱 DNA。
注意：由于在凝胶纯化过程中通常会丢失相当一部分 DNA，因此我们建议平行进行三到四次消化反应，并使用单个纯化柱从所有条带中纯化 DNA。这将确保获得足够数量的骨干 DNA。
测量洗脱 DNA 的浓度，并用 ddH 2 O稀释至 100 ng/µL。
96 孔板形式的 gRNA 克隆

图 2. 96 孔格式的 gRNA 克隆工作流程。使用 BioRender.com 创建。

图 3. AE 板概览和相应的寡核苷酸终浓度

在室温 (RT) 下解冻来自 IDT 的预混合 gRNA 正向和反向引物（图 A）。
对于寡核苷酸的磷酸化和退火（图 2B）：
准备以下主组合：
零件体积（ × 1）体积（ × 96）
T4 DNA 连接酶反应缓冲液 0.4 µL 38.4 微升
T4 PNK 0.2 µL 19.2 µL
DDH 2 O 1.4 µL 134.4 微升
主混音 2 µL 192 微升

在新的 96 孔板（板 B）中每孔添加 2 µL 主混合物。
根据板布局（最终浓度：20 μM）（图 3），从 A 板中每孔添加 2 μL的寡核苷酸。
密封板 B 并转移到热循环仪并应用以下条件：
温度时间
37℃ 30分钟
95℃ 30 秒
以 5 °C/分钟的速度降至 25 °C

2 O（稀释系数：100；最终浓度：200 nM ）（图 3），在新的 96 孔板（C 板）中稀释磷酸化和退火寡核苷酸。
在新的 96 孔板（板 D）中进一步稀释板 C，将板 C 中的 5 µL 稀释寡核苷酸添加到 ddH 2 O 的 95 µL（稀释系数：20；总稀释：1:2,000；最终浓度：10 nM ）（图 3）。
设置连接反应：
准备以下主组合：
零件体积（ × 1）体积（ × 96）
消化的骨架 100 ng/ µL 0.4 µL 38.4 微升
T4 DNA 连接酶反应缓冲液 0.4 µL 38.4 微升
T4 DNA连接酶 0.2 µL 19.2 µL
DDH 2 O 1 微升 96 微升
全部的 2 µL 192 微升

将每口主混合物的 2 µL 添加到新板（板 E）中。
从板 D 中每孔添加 2 µL 退火寡核苷酸（最终浓度：5 nM ）（图 3）。
让 E 板在 RT 处站立 20 分钟，以允许发生结扎反应（图 2C）。

细菌转化

2 O 来稀释结扎反应。
在冰上解冻主管大肠杆菌。
在冰上的 96 孔板中，每孔接种 10 μL 的细菌。
将 2 µL 的结扎反应添加到细菌中，然后上下移液两到三次。
在冰上孵育 5 分钟。
使用热循环器在 42°C 下进行 45 秒的热冲击。
在冰上孵育 1 分钟。
在每口井中加入 180 μL 的 LB 介质。
用铝箔松散地盖住盘子，在 37°C 下孵育 30 分钟。
× 12 cm 培养皿上播种 5 μL 的回收细菌（图 2D）。
注意：使用多通道移液器分配 5 µL 细菌，并使用接种环将它们划线。
在 37°C 下孵育过夜。

质粒分离（骨架 + gRNA）

在 96 深孔板的每个孔中加入 2 mL 的 LB 介质 + 羧苄青霉素。
使用接种环或移液器吸头挑选单个菌落。
在摇床上 37°C 孵育过夜。
第二天，根据制造商的说明使用 Monarch ®质粒小量提取试剂盒分离质粒 DNA。
使用分光光度计测量质粒 DNA 浓度。
使用 hU6 prom_fwd测序引物 (GACTATTCATATGCTTACCGT) 将质粒 DNA 提交给 Sanger 测序。
例如Geneious Prime）检查测序结果（图 4）。

Geneious Prime的序列分析示例

细胞培养

笔记：
对于排列的 CRISPR/Cas9 屏幕（图 5），我们建议从您感兴趣的细胞系中生成功能性 SpCas9 表达克隆。为了进行验证，使用控制 gRNA 进行如下所述的竞争测定。例如，在人类细胞系中，靶向 AAVS1 的 gRNA 应用作阴性对照，因为将插入缺失引入该位点预计不会对细胞适应性产生任何影响。靶向 RPL17 的 gRNA 可用作阳性对照，因为该基因在大多数人类细胞中必不可少。
建议至少在三个生物复制中执行所有功能实验。

转染Lenti -X 细胞

图5 。病毒生产、96 孔板形式的靶细胞转导以及使用基于流式细胞术的竞争测定法进行基因敲除功能分析的工作流程。使用 BioRender.com 创建。

第一天：
确定所有 gRNA 构造的浓度，并在 96 孔板中的ddH 2 O 中稀释至 20 ng/µL。该板可以储存在 -20 °C 以备后用。
培养Lenti -X 293T ( Lenti -X) 在 DMEM 中的 10 cm 2培养皿中，辅以 10% FBS、4 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。确保培养物不会超过汇合度 (≥60%–80%)。对于转染，去除上清液，用 5–10 mL 的 PBS 清洗一次，然后在培养箱中将细胞在 1 mL 胰蛋白酶溶液中孵育 3–5 分钟以分离细胞。分离后，将细胞重新悬浮在 10 mL 的新鲜培养基中。
将细胞稀释至 1.4 × 10 5 个细胞/mL，并将每孔 100 µL 转移至平底 96 孔板。

第 2 天：
准备转染主组合如下：
零件体积（ × 1）体积（ × 96）
psPAX2 100纳克 9600 纳克
pMD2.G 10纳克 960 纳克
DMEM（普通） 25 µL 2.4 毫升

在 96 孔板的每个孔中添加 25 μL 的主混合物和 10 μL 的每个构造 [20 ng/μL]。
在普通培养基中按 1:10 稀释 PEI，每孔加入 12.6 µL，并彻底混合。
在 RT 孵育 25 分钟。
小心地将每种混合物的 30 μL 添加到预播种的Lenti -X 细胞中，并孵育过夜。
注意：从这一步开始，需要 BSL2 环境才能处理病毒颗粒。

第 3 天：
小心地去除上清液，并用每孔新鲜培养基 170 μL 代替。
注意：根据待转细胞系的生长培养基选择新鲜培养基。由于所选载体包含荧光报告基因，例如 GFP，因此您可以在更换培养基后使用荧光显微镜检查转染是否成功（图 6）。

转染后 24 小时Lenti- X 细胞的明场（左）和荧光（右）显微镜照片（10 ×），显示 GFP 的表达

第 4/5 天：
要收获病毒颗粒，请小心地将 150 µL 上清液从Lenti -X 细胞转移到 96 孔板中，储存在 4 °C，然后将相同培养基的每孔 170 µL 添加到Lenti -X 细胞中，以进行可选的第二次收获第二天。在 -80 °C 下，将第二个与第一个收获和冷冻病毒一起放入 100 μL 的等分试样中。
注意：慢病毒颗粒的感染能力在冷冻后可能会降低。然而，此步骤有效地消除了Lenti -X 细胞，Lenti -X 细胞最终可能存在于上清液中，并在转导过程中用Lenti -X 细胞污染目标细胞。

目标悬浮细胞的转导和基于流式细胞术的竞争测定的设置

计数目标细胞并通过离心收集所需数量的细胞。
注：经 0.45 µm 滤膜离心过滤后得到的上清液可保存在 4 °C，用作转导后补充细胞的条件培养基。对于特别容易受到外部扰动（例如慢病毒感染）压力的细胞，建议使用此方法。可选地，在转导过程中可以在培养基中补充 20% FBS 以增加细胞活力。
在培养基中重悬细胞沉淀以达到 2 × 10 6 个细胞/mL 的浓度，并将每孔 100 µL 转移到平底 96 孔板（= 2 × 10 5 个细胞/孔）。
在目标细胞的生长培养基中将聚凝胺预稀释至 100 μg/mL，将 8 μL 添加至 100 μL 病毒，并将混合物（病毒 + 聚凝胺）添加到每 100 μL 细胞中（聚凝胺最终 = 4 μg/mL） .
将板在气溶胶密封桶中以 1,000 x g 离心 90 分钟。接种后，将板转移到培养箱中。
注意：对于可选的第二次旋转接种，小心去除每孔 100 µL 的上清液，解冻新的 100 µL 病毒等分试样，添加新鲜的预稀释聚凝胺，将混合物添加到细胞中，然后再次离心。
对于贴壁细胞，可以省略聚凝胺的添加和旋转接种。
接种后 6-24 小时去除病毒。离心板（300 × g，5 分钟）并小心去除大部分上清液。可选择用 PBS 洗涤细胞，然后再将它们重新悬浮在新鲜的生长培养基中。
照常培养细胞。
注意：在转导后的几天内，细胞可能会出现生长减慢和细胞死亡增加的情况。
三天后，通过流式细胞术确定每孔转导细胞的百分比，例如，通过荧光报告蛋白（如 GFP）。成功转导后，每两到三天测量每口井中 GFP 阳性细胞的百分比，并根据需要拆分培养物。
注意：除了监测 GFP 信号外，分析还可以扩展到任何其他可通过基于流量的测量获得的参数，例如分化、细胞凋亡和细胞周期分析，以更深入地了解基因敲除的细胞效应。
典型的监测时间是转导后两到四个星期，但取决于目标细胞系的生长特性和基因敲除的效果。我们建议将细胞转移到 24 孔板中进行培养并监测GFP阳性细胞的百分比。使用 12 通道移液器仅使用第二个吸头即可有效地分离培养物。在每次分裂事件中，将等分的细胞转移到 96 孔板中，并在IQue Screener Plus 流式细胞仪或类似设备上进行分析。

笔记：
建议转导率在 20%–80% 之间；最佳值为 50%。
仅使用几个结构（例如，一组控件）测试程序，并在需要时进行调整。
可选更改包括：
调整Lenti -X 细胞的浓度（例如，每孔 1 × 10 4 –2 × 10 4 个细胞）。
调整靶细胞的浓度（例如，缩小至每孔 1 × 10 5 个细胞）。
或多或少地稀释病毒以分别降低或提高转导率）。
增加/减少spinoculations的数量。
放大至 24 孔格式以进行转染和/或转导。
通常，每个配备了测量报告蛋白所需的激光和检测器系统的流式细胞仪都可用于监测转导细胞的百分比。我们建议使用带有板加载器模块的设备，以最有效地分析通常存在于排列的 CRISPR/Cas9 屏幕中的大量样本。

竞争分析分析

在IQue Screener Plus 的Forecyt软件中，使用图 7 所示的门控策略将转导细胞的数量识别为“汗衫的 GFP 阳性细胞百分比”。

图7 。将 GFP 阳性细胞识别为每孔所有活单线体的百分比的门控策略

生成每个测量板的热图，其中 GFP 阳性细胞占每个孔的所有单细胞的百分比。这些值可以通过 .csv 格式的度量函数导出，并在 Microsoft Excel 中进一步分析。
在 Microsoft Excel 中，将所有数据标准化为第一次测量，例如，在转导后第 3 天 (Day3pt) 和阴性对照 (sgAAVS1)。
注意：在 Day3pt 之后，GFP 阳性细胞的百分比可能仍然上升。如果是这种情况，请归一化到稍后的时间点，例如 Day5pt 或 Day7pt。

测量开始 Day3pt ( normDay3 ) 的标准化：
公式：
〖%GFP〗_normDay3= 〖%GFP〗_DayXpt/〖%GFP〗_Day3pt *100

Microsoft Excel 中的示例计算：

控制 sgAAVS1 (normAAVS1) 的标准化：
公式：
〖%GFP〗_(Sample, normDay3 + normAAVS1)= 〖%GFP〗_(Sample,normDay3)/〖%GFP〗_(sgAAVS1,normDay3) *100

Microsoft Excel 中的示例计算：

来自有限数量样本的数据可以显示在条形图中（图 8）。靶向细胞增殖所必需的基因将导致 GFP 阳性细胞的百分比随时间降低。靶向非必需基因将导致 GFP 阳性细胞的百分比不变。

图 8. a) GFP 阳性细胞百分比随时间变化的原始数据和 b) 标准化为转导后第 3 天和 sgAAVS1（阴性对照）的条形图

热图格式可用于以易于理解的方式呈现大数据集的结果（图 9a）。为了进一步压缩结果，可以使用以下 R 脚本计算每个 gRNA 的曲线下面积 (AUC)。
创建一个 excel 文件，其中包含标准化为测量起点的 GFP 值百分比和具有以下结构的负控制（例如 sgAAVS1），并将其保存为 .csv 文件。

在 R studio 中，应用以下代码计算每个基因/目标的 AUC 值。根据您的数据调整文件名、天数和列数。

图 9b 显示了具有 AUC 值的热图示例。

图 9. 热图表示 a) 每个目标标准化为 sgAAVS1 和 Day3pt 的 %GFP 和 b) 每个目标的曲线下面积 (AUC) 值

致谢

该协议改编自以前的工作（ Schmidt等人，2019 年； Heyes等人，2021 年）。我们感谢Grebien实验室的所有成员进行讨论。该项目已获得欧盟 Horizon 2020 研究与创新计划（Marie Sklodowska -Curie grant agreement No 813091）、奥地利科学基金（项目 P-35628 和 TAI-490 至 FG）的资助，以及Fellinger的资助 Krebsforschungsverein 。 ST 是奥地利科学院 DOC 奖学金的获得者。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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