材料和试剂
A. 组织准备
1. 啮齿动物的大脑（我们使用了 n = 6 个来自 Charles River 的雌性 Wistar 大鼠的成年大脑，目录号：003）
2. 异氟醚、USP 或任何其他麻醉剂（Piramal Critical Care，目录号：6679401710；或任何其他品牌）
3. 250 mL 玻璃烧杯（ Fisherbrand ，目录号：FB101250；或任何品牌）
4. 铝箔（Reynold Wraps，目录号：458742928317；或任何品牌）
5. 带不锈钢探头的超低温数字温度计（ Fisherbrand ，目录号： 15-077-32)
6. 2-甲基丁烷（异戊烷） ReagentPlus® ≥99%（Sigma-Aldrich，目录号：M32631；或任何品牌）
7. 干冰颗粒
8. （ Thermo Scientific，美国， Cryostar NX50；或任何能够生产 10 µm 切片的品牌）
9. 费雪布兰德 Superfrost Plus 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
10. Tissue-Tek OCT 化合物（Sakura，目录号：4583）
11. Tissue-Tek 手动载玻片染色套装（Sakura，目录号：4451）
12. 多聚甲醛 32% 水溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15714S）
13. 蒸馏水
14. 费雪布兰德 Superslip盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-545-89P）
15. Fluoro -Gel II（Electron Microscopy Sciences，目录号：17985-50）

B. RNAscope准备
1. RNAscope ®荧光多重试剂盒 v1（Advanced Cell Diagnostics，目录号：320850），适用于新鲜冷冻应用。请注意，对于固定脑准备，需要额外的产品： RNAscope Target Retrieval 和RNAscope Protease III（在RNAscope通用预处理试剂盒中提供，Advanced Cell Diagnostics，目录号：322380）
2. RNAscope® RTU 蛋白酶 IV 试剂（Advanced Cell Diagnostics，目录号：322340 ）
3. RNAscope目标探针（目录号根据需要而变化；我们使用了 Rn -Hcrtr1- C1、Rn- Th -C2和 Rn- Fos - C3）。请注意，为了在多重检测中独立检测 mRNA 转录本，每个目标探针必须位于不同的通道（C1、C2 或 C3）中，并且其中一个目标探针必须位于 C1 通道中。通道 C1 目标探头是即用型 (RTU)，而通道 C2 和 C3 探头作为 50 ×浓缩库存发货。 C2 或 C3的 50 ×探头必须与 C1 RTU 探头混合使用。如果没有使用特定的 C1 探针，则使用空白探针稀释剂（取决于测定）来稀释探针。可以根据研究人员的要求更改通道的分配。
4. RTU 探针稀释剂（可选，见上文；Advanced Cell Diagnostics，美国，目录号：300041）
5. RNAscope 3 重阴性对照探针（Advanced Cell Diagnostics，目录号：320871）
6. Immedge®疏水屏障笔（Vector Labs，目录号：310018）
7. RNase AWAY（ Thermo Scientific，目录号：14-375-35）或任何其他去污剂（例如漂白剂）

笔记：
a. 下面列出的项目仅适用于新鲜冷冻组织采集。如果研究人员计划使用福尔马林固定的组织，则需要遵循额外的步骤（有关更多详细信息，请参阅制造商手册）。
b. RNAscope试剂盒略有不同，因为固定组织经过不同的制备和预处理。
c. 此处列出的目标探针仅供参考。为此可以使用任何类型的标记。可根据要求定制探针（来自可用的基因组数据库），但需支付额外费用。

设备

1. 脑提取工具：
直剪刀（ Roboz ，目录号： RS-6806），咬骨钳（ Roboz ，目录号：RS-8300），圆形抹刀（Millipore Sigma，目录号：HS15906），小直或弯钳（ Roboz ，目录号： RS-5136）和长镊子（ Fisherbrand ，目录号：13-820-077；见图 1 ）
2. 扫描仪（卡尔蔡司， AxioScan Z.1，德国；或任何其他能够扫描和数字化荧光载玻片的显微镜）
3. 计算机：64 位 Windows 或 Linux，至少 16 GB RAM 和快速多核处理器（例如，Intel Core i7 或 i9）
4. HybEZ II系统杂交炉[Advanced Cell Diagnostics, USA;参见图 2 。该系统包括： HybEZ烘箱（PN 321710/321720）、湿度控制托盘（PN 310012）和HybEZ加湿纸（2张，PN 310025 ）、EZ-Batch 清洗托盘（PN 321717）和 EZ-Batch 载玻片架(产品编号 321716)]

注意：此协议预期适用于功能较弱的计算机或内存较低的计算机，但分析速度会很慢，并且可能会遇到内存错误。

图 1. 大脑提取工具。指出了直剪刀、咬骨钳、圆形抹刀和弯曲的长镊子。

图2.HybEZ II 系统。杂交烘箱、湿度控制托盘、加湿纸、载玻片染色/清洗套件（EZ-Batch 清洗托盘和 EZ-Batch 载玻片架）和疏水笔。

软件
1. 用于图像采集和导出的 Zeiss ZEN blue v2.6 或更高版本 ( https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#downloads )
2. QuPath 0.3.2 开源软件 ( https://qupath.github.io/ )
3. Microsoft Excel 或类似软件

4. GraphPad Prism 9.4.1 ( https://www.graphpad.com/ ) 或类似版本

程序
A. 大脑收集（新鲜冷冻）和储存
1 在无 RNase 的条件下（通过使用 RNase AWAY 或任何其他去污剂（如低浓度漂白剂）清洁该区域来实现），准备一个装有 300 mL 2-甲基丁烷的烧杯，将其放在立体泡沫容器中的干冰颗粒上化学罩。 2-甲基丁烷的温度用超低温温度计监测。允许 2-甲基丁烷达到 -30 °C 的温度 30-45 分钟，这是保护大脑在低温恒温器切片过程中不破裂和 mRNA 不降解的最佳选择（见注释 1 ）。
2. 用异氟醚（或任何其他麻醉剂）深度麻醉大鼠，并通过斩首进行牺牲。快速从头骨中取出大脑，去除可能损坏组织的骨骼和膜残留物。
3. 立即将大脑放入冷冻的 2-甲基丁烷 (-30 °C) 中并快速冷冻 25 秒（见注2）。
4. 用长镊子抓住快速冷冻的大脑，立即用铝箔包起来。避免组织解冻，并立即将大脑储存在干冰上或 -80 °C（见注释 3 ）。
5. 将大脑储存在 -80 °C 下长达 12 个月。不建议使用长期储存的大脑，因为 mRNA 会逐渐降解。

注意：如果研究人员打算使用福尔马林修复大脑，则必须遵循不同的方案，包括经心灌注。用福尔马林灌注的大脑应在一夜之间用福尔马林后固定，转移到 30% 蔗糖以冷冻保护组织，并在 2-甲基丁烷中快速冷冻以便长期储存。
1. 组织中的裂缝会使切片样品难以进行后续检测。在液氮（超低温）中冷冻大脑也会产生裂缝，使组织无法使用。
2. 这段时间对于防止大脑半球分裂和 mRNA 降解至关重要。此过程允许均匀快速地冷冻脑组织并保留形态和 100% 的目标 mRNA，特别是如果目标是低到中等表达的。
3. 避免接触之前未净化的工具。

B. 新鲜冷冻脑切片的制备

1. 将大脑从-80 °C 移动到 -20 °C。根据实验室条件，加热组织将需要更短或更长的时间（30 分钟到几个小时）。
2. 将大脑从-20 °C 转移到低温恒温器的腔室，其温度先前已优化（-13 °C）。在开始切片之前，将大脑留在低温恒温器内 2~3 小时。大脑切片的最佳低温恒温器温度取决于设备的型号（用户手册通常提供此信息）。上述平衡时间足以让切片无裂纹。如果大脑还没有准备好，增加平衡时间。当大脑在低于 -40 或 -50 °C 的温度下快速冷冻时，通常需要更长的时间。
3. 放置 SuperFrost ® Plus 载玻片的外部低温恒温器区域进行净化。建议将载玻片放在低温恒温器外，以避免它们太冷并防止切片后组织粘连（这一步在很大程度上取决于环境和低温恒温器）。
4. 在标本阶段添加 2–3 滴 OCT 化合物，并立即将冷冻大脑置于正确的方向和角度，以提供准确的切片。确保组织垂直于舞台以避免切片不均匀。
5. 从所需的感兴趣区域切下 10 µm 的冠状切片 [此处，我们收集了包含黑质 (SN) 的切片]，并立即通过粘附将它们安装到SuperFrost ® Plus 载玻片上。每张幻灯片最多可包含三个（取决于方向）大鼠脑切片。用组织切片过度拥挤载玻片将阻碍为随后的RNAscope测定绘制疏水屏障所需的区域。
6. -80°C的铝箔包裹的密封滑动盒中。
7. 在三个月内使用切片组织。切片组织更容易发生更快的 mRNA 降解。

C. RNAscope分析

多重化验是根据制造商的协议进行的（我们在下面概述了具体细节）。所有孵育均在 40°C 下使用湿度控制室（ HybEZ烤箱，Advanced Cell Diagnostics）进行。除非另有说明，否则下面列出的步骤与 mRNA 目标探针和阴性对照相似。建议在每批组织中运行阴性对照（一个或两个切片就足够了）。目标探针使用如下：
RNAscope 3 重阴性对照探针组 (320871)：细菌DapB （在 C1、C2 和 C3 探针组中）
RNAscope探针组：Rn- Hcrtr1 -C1 、Rn- Th -C2 和 Rn- Fos -C3 。请注意，应根据所需目标的表达水平选择探针通道和荧光团。例如，可以为样品中具有高自发荧光的波长选择更高表达的基因（例如，488/绿色）。
下面，我们描述了此过程中最具代表性的步骤。除非另有说明，否则每一步都将载玻片浸入载玻片染色/清洗装置中。

1. 固定切片：取出先前储存在-80°C的切片，并立即将它们浸入4°C的预冷固定液[4%多聚甲醛（通过将多聚甲醛的32%储备溶液稀释成1 × PBS制备） ] 40 分钟鉴于多聚甲醛的毒性，此步骤必须在通风橱中进行。
2. 将切片脱水：将切片置于 50% (1 × )、70% (1 × ) 和 100% (2 × ) 乙醇中，室温下各放置 5 分钟。
3. 在每个大脑部分周围创建一个疏水屏障，让它在室温下干燥 1 分钟。
4. 准备运行检测所需的材料（洗涤缓冲液、目标探针、试剂和杂交炉）。
5. 通过在室温下在加湿托盘内应用蛋白酶 IV（直接从瓶中滴下约五滴；无需稀释）预处理样品 30 分钟，然后盖上盖子。
6. 将所需的探针添加到每个部分，并在加湿托盘内在 40°C 下孵育 2 小时（此温度对于所有类型的探针都是相同的，包括阴性对照）。重要的是，每次运行检测时，将阴性对照探针应用于一个部分。
7. 在 40°C 下使用 Amp FL-1、-2、-3 和 -4（我们使用 Amp FL-4-Alt A）杂交探针 15 或 30 分钟（参见制造商的说明）。每个扩增步骤都发生在增湿盘内。在每个扩增步骤之后，通过载玻片溶液孔用洗涤缓冲液洗涤切片来去除 Amp 试剂。
8. 使用Fluoro -Gel II 和 DAPI 进行复染，并用盖玻片覆盖切片。在应用安装介质之前确保部分几乎完全干燥，以避免产生气泡，气泡会阻止目标识别并因此进行量化。
9. 将幻灯片存放在4°C 的黑暗中，直到图像评估（最佳时间最长为一周）。

注意：可以将RNAscope与 IHC 技术相结合，使研究人员能够进一步阐明细胞身份。在这种特殊组合中，只能使用福尔马林固定的脑组织，IHC 将作为第二步进行。 Advanced Cell Diagnostics 为此提供了技术说明，可在此处找到： https ://acdbio.com/system/files_force/gated/TN_323100_TechNote_Dual_ISH_IHC_manual_Multiplex_Fluorescent_V2_06222017.pdf.pdf?download=1 。
不需要进一步细胞表征的纯RNAscope应用，建议使用新鲜冷冻组织分离，如本协议中所述。优点包括： 1) 所需耗材较少，这是一个节省成本的因素； 2）实现相同结果所需的步骤更少； 3) 更好的组织质量可能转化为高质量的 mRNA 靶向，这将简化量化过程。在福尔马林固定的组织中，有必要添加目标检索步骤（在高温下执行），这会导致组织损伤并阻止成功的探针靶向。使用新鲜冷冻组织分离的缺点包括无法结合需要福尔马林固定组织的 IHC 检测（更多详细信息，请参见本说明开头）。

D. 成像

1. 打开扫描仪和计算机。
2. 启动 ZEN v2.6 软件。
3. 将载玻片装入托盘并插入扫描仪内部。
4. 检查载玻片盒的准确性。
5. 单击向导开始扫描设置。
6. 选择感兴趣区域 (ROI)——在此协议中，我们分析了 SN。选择 ROI 时，不要只包括所需的部分，而是要扩展以包括部分相邻区域。
7. 在明场视图中，检查相邻的大脑区域以确保您处于正确的 ROI 中。
8. 在荧光视图中，根据RNAscope测定选择所需的通道。我们有 DAPI（蓝色）、GFP（绿色）、Cy3（红色）和 Cy5（远红色）。
9. 对于粒子计数，计算曝光时间以允许清楚地检测所有通道中的小焦点。这些是我们扫描仪的最佳设置（见注释 1）：
a. DAPI：6–8毫秒
b. EGFP：1,400–1,800毫秒
c. Cy3：600–800毫秒
d. Cy5：1,000–1,400毫秒
10. 聚焦每个通道并设置 z 堆叠参数。
11. Z 轴堆叠： RNAscope切片最初为 10 µm 厚度;然而，切片从原始厚度后处理中损失了几微米。我们不需要将 z 堆叠深度设置为 10 µm，因为该深度不再准确。为了获得大量包含高分辨率转录本的有价值的切片，我们将 z 堆叠设置如下：
a. 深度：5.20 微米
b. 切片间距：0.85 µm
c. 片数：7
12. 开始扫描——扫描所有部分需要几到几个小时，具体取决于所选的 ROI。
13. QuPath中保存文件以供后续分析（见注释 2）。

在 ZEN 软件环境中使用 Zeiss Axioscan Z.1对我们的部分进行成像所遵循的步骤。任何能够产生 z 堆栈切片的高分辨率荧光或共聚焦显微镜都可以用来获得类似的结果。对于所有分析，图像都是通过 20 倍物镜捕获的，这些物镜很容易识别与各个转录本相对应的离散焦点，同时保留足够的轴向分辨率以允许组织切片的所有元素保持良好聚焦。虽然我们使用这些特定参数来捕获较小的大脑区域（例如 SN），但相同的设置可用于较大的区域，从而获得类似的结果。成像较大区域的局限性与较长的扫描会话和要选择的焦点数量增加有关。
1. 建议不要在单批幻灯片中更改设置。这将有助于通过自动量化保持一致性，最大限度地减少亚细胞阈值的可变性，并识别较旧部分中 mRNA 信号的潜在损失。
2. ZEN 软件自动将扫描的图像保存在 . czi格式，其中包含多种类型的信息，因此创建需要特定数据管理的大文件。对于下一步最重要的是，CZI 文件可以在QuPath中打开，而无需使用其他软件合并或处理图像（特别是如果选择了 ROI）。 QuPath将创建与 ZEN 中扫描的场景数量一样多的文件。如果选择了较大的 ROI，并且缺少唯一的焦点，则可能需要合并 z 堆栈切片（具有最大投影）以在每个图像拼贴中达到所需的焦点。

E. QuPath进行RNAscope亚细胞定量（用户手册： https ://qupath.readthedocs.io/en/stable/ ）

1. 打开 QuPath-0.3.2。
2. 在屏幕左侧的Project选项卡下，单击C reate project或O pen project以检索以前的项目（图 3 ）。
笔记：
a. 在搜索文件时，您可能需要将文件类型从“ QuPath文件”更改为“所有文件”才能访问。
b. 如果创建一个新项目，请命名并保存您的文件，然后通过选择文件 -> 项目 -> 添加图像 -> 选择文件 -> 导入来导入图像（您可能必须将窗口扩展到全屏才能看到所有选项）。

图 3. QuPath的屏幕截图。指示创建或打开项目的路径。

3. 从图像列表中双击要分析的图像。
a. 在“视图”选项卡下，选择“亮度/对比度” 。检查 DAPI、EGFP、Cy3 和 Cy5 通道（参见图 4 ）。
b. 使用鼠标上的滚轮放大和缩小。
c. 放大显示来自所有 DAPI、Cy3 和 Cy5 通道的大量活动的区域。使用图像左上角的可调滚动工具（ z 切片选择器）更改您正在分析的区域的图层。在分析细胞和亚细胞成分时，必须尽可能获得最清晰的图像以提供最准确的计数。

图 4. QuPath的屏幕截图。指示调整亮度和对比度的路径。

4. 一旦达到最佳清晰度，返回视图和亮度/对比度并仅使用 EGFP 或 Cy5 通道以最佳方式查看幻灯片上的解剖结构。选择顶部功能区中的一个形状并拖动以选择您的 ROI（参见图 5 ）。
a. 双击您所在区域以外的区域可使轮廓变为白色并锁定该区域。
b. 您还可以使用最小和最大显示比例来实现数据的最佳亮度。分析图像时，最好在所有通道中使用类似的设置。

图 5. QuPath的屏幕截图。顶部功能区上的形状用于勾勒出 ROI。

5. 单击Analyze选项卡，然后再次单击Cell Detection和Cell Detection （参见图 6 ）。
更改参数以匹配下面的列表，然后单击运行。
a. 背景半径：10 µm（如果考虑减去背景，0 表示不减去背景）。
b. 中值滤波器半径：2.0 µm（减少图像纹理/平滑强度振动）。
c. Sigma：2.0 µm [控制/降低噪音影响；数字越小，您将获得更多的核（更多碎片）]。
d. 最大面积：300 µm 2 （定义核大小的范围）。
e. 阈值：30（核对象的强度参数）。

图 6. QuPath的屏幕截图。指出了用于细胞检测的参数。

6. 在分析Cell Detection之后，您需要放大并检查分割的质量。一些细胞可能已经组合在一起并且只算作一个，而其他细胞可能已经被分割以算作多个细胞（参见图 7 ）。您可以更改中值滤波器半径、sigma 和阈值并重新运行细胞检测，直到实现最佳分割（参见图 8 ）。
分割不佳可能表明您需要更改运行参数，或者您需要更清晰地了解 ROI。

图 7.具有较差（左）和较好（右）核分割的代表性QuPath图像

图 8。 QuPath中的代表性探针表达和核/亚细胞分割。左上图显示黑质中 DAPI（蓝色）、 Hcrtr1 （绿色）、 Th （红色）和Fos （白色）的代表性表达。单独显示（左）或与 DAPI（中）一起显示的单个探针表达。右图显示了通过QuPath对每个通道进行的细胞和亚细胞识别。比例尺 = 20 µm。

7. 单击Analyze，然后单击Cell Detection ，然后单击Subcellular Detection （参见图 9 ）。参数设置如下；然后，单击运行。
注意：DAPI 的阈值应设置为 0；此处显示的其他阈值取决于每个通道的点强度。
a. 通道 2 阈值：600
b. 通道 3 阈值：600
c. 通道 4 阈值：600
d. 选中所有三个框，上面写着“检测前平滑”、 “按强度拆分”和“按形状拆分”。 ”
e. 预期光斑尺寸：0.5 µm 2
f. 最小光斑尺寸：0.5 µm 2
g. 最大光斑尺寸：15 µm 2

图 9. QuPath的屏幕截图。指出了用于亚细胞检测的参数。

8. 分析亚细胞检测后，再次检查数据收集的质量和准确性。改变最大光斑大小和阈值的参数以提高质量（参见图 9 ）。
您可以返回到视图和亮度/对比度并双击通道以更改其颜色，因为有时亚细胞成分和分析后识别它们的圆圈颜色相同。
9. 收集到最佳质量的数据后，转到测量并显示检测测量（参见图 10 ).选择复制到剪贴板并打开Excel以粘贴所有数据。
QuPath内部收集的唯一其他数据是细胞数量。您可以通过单击屏幕左侧的注释来访问它；在左上角，您将看到注释（椭圆）（例如，1006/3650 对象）。这两个数字中的第一个是QuPath中识别的细胞数。您可以通过查看 Excel 数据中有多少核区域来仔细检查

图 10. QuPath的屏幕截图。指出了检测测量的途径。

10. 在 Excel 中（图 11 ），您需要为数据收集保留的唯一列是：
a. 核心：面积
b. 亚细胞通道 2：单点数
c. 亚细胞通道 3：单点数
d. 亚细胞通道 4：单点数
11. 通过选择列出核面积的列的字母来查找平均核面积；在Sort and Filter下选择Sort Smallest to Largest 。在空单元格中插入平均函数，选择所有包含核区域的单元格，然后单击 enter。
12. 同样，在亚细胞通道 2 列上从小到大排序，并计算高于您设置的阈值的单点数，包括阈值（即，如果我的阈值是 5，则计算所有显示 5 个或更多点的亚细胞单点）。
重复亚细胞通道 3 和 4。

图 11. Excel 的屏幕截图。亚细胞检测针对通道 2 进行排序，高于阈值的那些细胞以黄色突出显示。

一旦上述所有参数都得到优化，就可以使用定制的自动化来加快分析工作流程（参见图 12 ）。如果将使用额外的参数或扩展（例如， Stardist — 深度学习模型），我们可以创建源自上述步骤的脚本或创建自定义脚本。为简单起见，我们描述了从现有工作流生成自动化的步骤。
a. 转到自动化 -> 显示工作流命令历史记录 -> 选择所需的步骤 -> 创建脚本 -> 保存脚本。
b. 打开生成的脚本并检查所有行的准确性。根据优化的工作流程修改通道和分析参数。保存脚本并为任何其他选定的 ROI 运行它。
自动分析可以节省几分钟的工作时间，从而可以在很短的时间内完成任务。

图 12. QuPath中用于运行自动分析的脚本示例

数据分析

每次运行RNAscope分析时，确定分析阈值至关重要，该阈值将作为处理图像中包含或排除数据的标准。如上所述，应在阴性对照探针处理组织的每个通道中量化点状表达（代表性图像参见图 13 ）。计算每个通道中 puncta 的平均值和标准偏差。这些值的总和是所有已处理图像的阈值。
在给定通道中的斑点为零；在计算阴性对照探针处理图像中的平均点状表达时，请务必仅包含 >0 的值；包含 0 值会人为地降低您的阈值并影响您的数据（参见表 1和图 14中的示例）。每个通道的阈值都是唯一的（例如，表 1 ）。

图 13。代表性阴性对照探针处理的组织图像。绿色的非特定信号- POLR2A (A)、红色- PPIB (B)、白色- UBC (C) 和显示的合并 (D) 通道。由于荧光信号低，图像显示亮度增加。比例尺 = 20 µm。

表格1。来自阴性对照探针处理的组织图像的每个通道的示例阈值计算。阈值是通过添加每个通道的 puncta 数量的平均值和标准偏差来确定的。包含零值会人为地降低此阈值。
通道 2（绿色）通道 3（红色）频道 4（远红）
puncta 的平均数量（包括零值） 0.76 1.90 0.43
标准偏差 1.48 2.92 1.16
阈值（包括零值） 2.24 4.82 1.59
puncta 的平均数量（不包括零值） 2.17 3.43 2.10
标准偏差 1.48 2.91 1.16
阈值（不包括零值） 3.65 6.34 3.26

图 14。阈值对使用RNAscope处理的组织进行细胞计数的影响。该图显示了在六只大鼠的黑质内分析的区域中被确定为Hcrtr1 （绿色条）、 Th （红色条）或Fos （紫色条）表达阳性的神经元总数。与使用由以下方法计算的更严格的阈值相比，使用通过在阴性对照探针处理图像中包含零值计算的较低阈值（参见数据分析部分）会导致更多的阳性细胞计数（较浅的条）仅在具有 ≥ 1 个斑点（深色条）的细胞中平均点状表达。

致谢

该协议改编自Avegno等人。成瘾生物学 (2021, DOI: 10.1111/adb.12990)。此处描述的工作得到了国家卫生研究院（U01AA028709、R01AA023305 到 NWG 和 K01AA028541 到 EMA）和美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发服务部（优异奖 I01 BX003451 到 NWG）的支持。

利益争夺

尼古拉斯·W·吉尔平 (Nicholas W. Gilpin) 拥有Glauser Life Sciences 的股份，这是一家致力于开发精神疾病治疗方法的公司。这些兴趣与此处包含的工作之间没有直接联系。所有其他作者报告没有利益冲突。

伦理

所有程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（NIH 出版物第 8023 号，1978 年修订）。

参考

Avegno , EM, Kasten, CR, Snyder, WB, 3rd, Kelley, LK, Lobell, TD, Templeton, TJ, Constans , M., Wills, TA, Middleton, JW 和 Gilpin, NW (2021)。酒精依赖激活腹侧被盖区投射到雄性小鼠和大鼠的中央杏仁核。瘾君子生物学26(4)：e12990。
Bankhead, P., Loughrey , MB, Fernandez, JA, Dombrowski, Y., McArt , DG, Dunne, PD, McQuaid, S., Gray, RT, Murray, LJ, Coleman, HG, 等。 (2017)。 QuPath：用于数字病理图像分析的开源软件。科学报告7(1)：16878。