材料和试剂
1. 1.5 mL 微量离心管 (Axygen)
2. 2.0 mL微量离心管（Axygen）
3. 培养皿（直径 9 厘米）
4. 40 µm 细胞过滤器（Xiyan Co., Ltd.，目录号： 15-1040 ）
5. 针头过滤器（ Pall Corporation ，目录号： 4612 -0.2 µm ）
6. 无菌刀片（上海联汇医疗器械有限公司）
7. 50 mL 离心管
8. 50 mL 锥形瓶
9. 100 mL 锥形瓶
10. 250 mL 锥形瓶
11. KCl（BIODEE，目录号：DE-0395A-250 G）
12. CaCl 2 （BIODEE，目录号：DE-0556A-500 g）
13. 琼脂 A（BBI Life Science，目录号：A600010-500 g）
14. 马铃薯葡萄糖肉汤（Solarbio Life Sciences，目录号： P9240)
15. D-山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S3889-500 g）
16. Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T6666-500 g）
17. 蔗糖（ BBI Life Science ，目录号：A100335-250 g）
18. 酵母提取物（ BBI Life Science ，目录号：A515245-500 g）
19. 潮霉素 B（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10687010 -20 mL ）
20. Glucanex （Sigma-Aldrich，目录号：L1412-5 g）
21. 聚乙二醇 3500（Sigma-Aldrich，目录号： 25322-68-3-250 g ）
22. 亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：05292-1 mL）
23. 肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149-500 KU）
24. 酪蛋白氨基酸（Sangon Biotech，目录号：A603060-100 g）
25. KCl 缓冲液（pH = 6 – 6.5）（参见配方）
26. 0.5% Glucanex（见配方）
27. Phanta 超保真 DNA 聚合酶（Vazyme，目录号： P501-d2）
28. STC 解决方案（参见配方）
29. SPTC 解决方案（参见配方）
30. PDA 培养基（见食谱）
31. PDB 培养基（见食谱）
32. RM 培养基（见食谱）
33. RMA 培养基（见食谱）

设备
1. 1,000 µL 微量移液器 (Eppendorf)
2. 200 µL 微量移液器 (Eppendorf)
3. 10 µL 微量移液器 (Eppendorf)
4. 离心机（Eppendorf ，型号：5424R ）
5. 离心机（Eppendorf，型号：5810R）
6. 血细胞计数器（Devan Scientific Co.，Ltd.，目录号：AP-0650010 ）
7. 细菌摇床培养箱（Crystal Technology & Industries，型号：IS-AX-190L）
8. 生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司，型号：HPX-B400）
9. 蔡司 Axio Observer （蔡司）

程序

A. 核盘菌菌丝体的培养与富集

1. 核盘菌生长三天的 PDA 培养基（参见食谱）切成菌丝体块（约 1 毫米长 × 1 毫米宽）（图 1）。
注意：理想的切割区域最好是在真菌菌落的边缘，那里是核盘菌菌丝活跃生长的地方。

图 1. 理想的切割区域

2. 将菌丝块收集到含有 100 mL PDB 介质的 250 mL 锥形瓶中，然后摇动烧瓶将它们混合在一起。
注意：最好将大约 200 个菌丝体块添加到 100 mL PDB 培养基中。这个比例保证了核盘菌吸收足够的营养并产生足够的新鲜菌丝体。
3. 将锥形瓶固定在摇床（180 ×g ，25 °C ）上，培养14-20小时，直到菌丝体块长出新鲜菌丝体（图 2）。

图 2. 培养 14 – 20 小时后的新鲜菌丝体。比例尺 = 1厘米。

4. 使用镊子，将新鲜菌丝体与菌丝体块分开，并将它们收集在 50 mL 离心管中。
5. 20 mL KC l 缓冲液重悬菌丝体， 1,500 ×离心 g和25 °C 5 分钟，然后丢弃上清液。
6. 再次重复步骤 A5。

B. 原生质体制备

1. 将20 mL 的 0.5% Glucanex [来自木霉(Sigma)的裂解酶] 添加到含有 1 g 菌丝体材料的 50 mL 离心管中。在室温下黑暗中轻轻摇动（旋转器上 120 × g ）孵育2-3 小时。
2. 酶消化后，使用细胞过滤器过滤消化混合物，并将滤液收集到50 mL 离心管中（图 3A）。
注意：将在冰上过滤并小心谨慎地进行下一步，因为原生质体很脆弱，很容易破裂（图 3B）。

图 3. 过滤原生质体并将滤液置于冰上

3. 以 1,200 × g离心滤液 4 °C 10 分钟，小心弃去上清液。
4. 5 mL预冷的KCl 缓冲液轻轻洗涤原生质体，以 5000 × g离心和 4 °C 2 分钟，然后小心地丢弃上清液。
5. 再次重复步骤 B4。
注意：步骤 B4 和 B5 可有效去除残留的酶混合物。
6. 1 mL 预冷的 STC重悬沉淀物，以5,000 × g离心和 4 °C 2 分钟，并通过慢慢倾析管来丢弃上清液。
7. 800 µL预冷 STC 缓冲液轻轻重悬沉淀物，并用移液器逐滴添加200 µL预冷 SPTC 缓冲液。
8. 原生质体溶液置于冰上，用Zeiss Axio Observer检查原生质体的状态 (Figure 4)。

核盘菌的原生质体。比例尺 = 10 µ m。

C. 原生质体转化

1. 在四份 STC 和一份 SPTC 中重悬原生质体至每毫升1 × 10 8 个原生质体的浓度。
注意：根据制造商的说明，使用血细胞计数器计算原生质体浓度。
2. 1.5 mL 微量离心管中加入 5 μg 转化 DNA、5 μL 亚精胺（50 mM 库存）和 5 μL 肝素（5 mg/mL）至 100 μL 原生质体悬浮液，然后轻轻混合。
注意：通过轻弹微量离心管底部而不是使用移液器将它们混合在一起。
3. 将混合物在冰上孵育 30 分钟，然后轻轻加入 1 mL SPTC 溶液，并在室温下孵育 20 分钟。
4. 将转化混合物转移到 50 mL 离心管中，并添加 10–20 mL 再生培养基 (RM)。
5. 在25 °C 下以 100 x g搅拌培养混合物过夜。
6. 在 43°C 下将原生质体与 200 mL RMA 培养基轻轻混合，将其倒入P etri 培养皿（每道 10 mL）中，并在 25°C 下孵育 24 小时。
注意：加热 RMA 介质直至完全熔化，然后在设置为 43 °C 的水浴中冷却。
7. 潮霉素 B的 10 mL RMA 介质覆盖盘子。
8. 企业文化在25 °C 7-10 天，然后将转化体转移到含有100 µg/mL 潮霉素 B 的新鲜PDA 培养基中。
9. 潮霉素抗性转化体的菌丝尖端转移到含有 100 µg/mL潮霉素B的 PDA 培养基中。重复选择至少三次 (图5A) 。
注：用无菌刀片挑取回收的潮霉素抗性转化体的边缘菌丝进行第一次筛选，剪下菌丝块进行第二次筛选。

在选择性 RMA 培养基上生长的核盘菌菌落形态。 A. 表明转化成功的菌落形态。将黑色箭头标记的菌丝尖端转移至PDA培养基中进行选择。 B. 阴性对照在步骤 C2 中不添加 DNA 制成的板。

10. 提取任意菌落的总RNA并逆转录成cDNA 。通过 Phanta 超保真 DNA 聚合酶执行 PCR 以验证阳性菌落，循环如下：
a. 将 cDNA 在 95 °C 下预变性 30 秒
b. 将 cDNA 在 95 °C 下变性 30 s
c. 50 °C 15 秒
d. 72 °C 90 秒
e. 重复步骤 bd 25 – 35 个循环
f. 72 °C 10 分钟
注：设计用于检查突变体的引物如下：
SsVPS51-GT-5'-F： CTTAGAGACTTGAGGAAGTC
SsVPS51-GT-3'-R：CTATCTTCTATTGCTATTC

食谱

1. KCl buffer ( p H =6 – 6.5,针头过滤器除菌, 25 °C保存)
试剂终浓度数量
氯化钾_ 0.6 万 4.47 克
氯化钙2 50毫米 0.56克
DDH 2 O 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

2. 0.5% Glucanex（储存于 4 °C）
试剂终浓度数量
葡聚糖不适用 0.5克
氯化钾缓冲液不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

3. STC 溶液（ 121 °C 高压灭菌 20 分钟）
试剂终浓度数量
山梨糖醇 0.8M 145.74 克
Tris-HCl (pH = 8.0) 50毫米 7.88 克
氯化钙2 50毫米 5.54 克
DDH 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

4. SPTC 溶液（ 121 °C 高压灭菌 20 分钟）
试剂终浓度数量
山梨糖醇 0.8M 145.74 克
Tris-HCl (pH = 8.0) 50毫米 7.88 克
氯化钙2 50毫米 5.54 克
聚乙二醇 3500 0.11 万 400 克
DDH 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

5. PDA 培养基（ 121 °C 高压灭菌 20 分钟）
试剂终浓度数量
马铃薯葡萄糖肉汤不适用 24克
琼脂A 不适用 15 克
DDH 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

6. PDB 培养基（ 121 °C 高压灭菌 20 分钟）
试剂终浓度数量
马铃薯葡萄糖肉汤不适用 24克
DDH 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

7. RM培养基（ 121 °C 高压灭菌 20 分钟）
试剂终浓度数量
蔗糖不适用 274 克
酵母抽提物不适用 1克
酪蛋白氨基酸不适用 1克
DDH 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

8. RMA介质（ 121 °C 高压灭菌 20 分钟）
试剂终浓度数量
蔗糖不适用 274 克
酵母抽提物不适用 1克
酪蛋白氨基酸不适用 1克
琼脂A 不适用 15 克
DDH 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

致谢
这项工作得到了国家自然科学基金 (32072404) 和江苏省自然科学基金 (BK20211524) 的支持。我们感谢 Jeffrey A. Rollins 在建立此协议方面所做的工作。

利益争夺

没有任何财务、个人或专业利益影响了这项工作。

参考

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Kabbage, M.、Yarden, O. 和 Dickman, MB (2015)。核盘菌的致病特性：从生物营养型转变为坏死型生活方式。植物科学233：53-60。
Qiao, L., Lan, C., Capriotti, L., Ah-Fong, A., Nino Sanchez, J., Hamby, R., Heller, J., Zhao, H., Glass, NL, Judelson, HS , 等人(2021)。用于疾病控制的喷雾诱导基因沉默取决于病原体 RNA 摄取的效率。植物生物技术杂志19(9): 1756-1768。
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