材料和试剂

1. Eppendorf 1.5 mL 微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：T6649）
2. 200 μ L 移液器吸头（Sigma-Aldrich，Corning，目录号：CS4860）
3. 油漆刷（任何细刷）
4. 剪刀
5. 100% 乙醇（200 标准）（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
6. 去离子/无菌水（Sigma-Aldrich，目录号： 8483331000 ）
7. 5% Lugol 溶液（Fisher Scientific，Spectrum Chemical，目录号：18-611-063）
8. 牙科蜡矫正托盘条（Kerr， Benco 目录号： 1021-752 ）
9. 昆虫标本
10. 70% 乙醇（见食谱）

设备

1. Bruker Skyscan 1272 微型计算机断层扫描仪
2. 可运行软件的电脑（见下方注1）

软件

1. Skyscan Micro-CT 扫描软件（版本 1.1.10，Bruker； https: //www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/3d-x-ray-microscopes/skyscan-1272.html ）
2. NRecon 重建（Bruker，3D.SUITE 软件包括 Dataviewer、CTAn、CTVol、CTVox）（Bruker， https: //www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/micro-ct/3d-suite -软件.html ）

程序

A. 样品制备和染色

1. 从 70% 乙醇中提取固定昆虫。
2. 在 70% 乙醇中冲洗样品一次或两次，然后在分级系列乙醇（70% 乙醇、50% 乙醇、25% 乙醇、100% 去离子水）中对昆虫进行再水化。
3. 去除液体，将昆虫样品置于新鲜的 Eppendorf 微量离心管中，并用 5% Lugol 溶液覆盖（约 300 μ L；体积是主观的，但样品应被淹没）。
4. 放置在黑暗的柜子里过夜，从 12 到 24 小时。
5. 在用 70% 乙醇替换溶液之前用水冲洗或冲洗样品。
6. -20 冷冻保存 °C直到扫描。

B. 微型计算机断层扫描：准备扫描样本

1. 将移液器尖端修剪到大约 12.5 mm 的高度，以适应扫描室中的可用空间。
2. 用牙科蜡密封修剪过的移液器尖端的底部，确保形成液密密封。
3. 在底座上涂上一个小蜡球，然后将修剪过的移液器的蜡密封底部放在蜡球上。施加轻微压力，使蜡从两个表面粘在一起；可以添加额外的牙科蜡以确保移液器可以直立在基座上。
4. 定位移液器尖端，使其笔直并居中。将基座放在柜台上并缓慢旋转以目视检查移液器尖端的移动。调整移液器尖端在蜡中的方向，直到旋转运动减少并且它出现在中心。
5. 将 70% 乙醇移入修剪过的移液器中（大约 50 – 80 μ L；可以从较低的体积开始，并在放置样品后添加更多的乙醇）。
6. 用画笔从存储管中取出染色的昆虫样本，并将其放入修剪过的移液器的乙醇中。如果样品未被淹没，请添加更多乙醇。
7. 轻轻敲击柜台上的底座底部（移液器保持直立）以去除移液器内的任何气泡并将样品沉淀在试管底部。
8. 用蜡轻轻密封修剪管的顶部；将一个小蜡球滚成一个扁平的圆圈，涂在移液器的开口顶部，然后轻轻按压移液器吸头外壁周围的边缘。
9. 最后一次检查方向移液器尖端，以确保它位于底座的中心。
10. 打开 Bruker Skyscan 微 CT 扫描软件。如果微型 CT 上的灯闪烁并且 X 射线源对话框打开，如果机器最近未使用，则 X 射线源可能需要时间预热。
11. 确保 X 射线源已关闭，并使用 Bruker 扫描软件顶部菜单栏打开扫描仪门。
12. 将基座放在扫描仪平台上并拧紧环。
13. 使用 Bruker 软件关闭扫描门。

C. 微型计算机断层扫描：扫描

1. 在 Skyscan Micro-CT 软件中，打开顶部栏上的抓取设置（电视图标）和视觉相机（灯泡图标），以在扫描设置期间查看微 CT 机内的样本（图 1）。

图 1. 菜单栏的屏幕截图。活动功能以橙色标记。

2. 将电压和安培数调整为 50 kV 和 200 μ A。
3. 通过单击底部工具栏上的此设置（位于右下角，带有蓝色箭头的蓝色框图标旁边的尺寸，图 2），将分箱更改为 2,016 × 1,344。

图 2. 底部工具栏的屏幕截图

4. 底部工具栏上分箱设置的右侧是过滤器设置。将过滤器设置设置为“无过滤器”。
5. 使用鼠标左键和 Control 键，单击并拖动主图像以使示例居中。将出现一条线来指示移动的方向和程度。释放将在 Skyscan 单元内移动样本。
6. 将样品旋转 360 ° ，以确保它在所有旋转角度都是直立的并且在扫描区域的范围内。如果样品倾斜或旋转到摄像机视图之外，请关闭源并打开腔室以重新定位基座上的样品。如果移液器方向发生任何变化，请重新居中样品（图 3）。

图 3. 带有样品的扫描仪内部

7. 单击底部工具栏上的高程设置（在右侧显示“mm”设置，位于两个绿色箭头旁边）以打开“放大倍数”和“位置”菜单。逐步逐步减小像素大小，直到达到 4.26 μ m，确保样品不接触内部摄像头。
8. 重复步骤C6 以确保整个样本仍在屏幕的可见范围内。如有必要，重复步骤 C5 和 C 6。
9. 右键单击样品的中心以调出样品的透射率读数。
10. 通过单击底部工具栏上的高程设置返回放大和位置菜单。记录样品的当前高程 (mm)。
11. 通过降低样品高度数从视野中移除样品。
12. 从“选项”选项卡导航到“扫描模式”菜单以更新平场校正。调整曝光时间以获得大约 60% 的平均传输，同时关闭平场。在以前的示例中，600 毫秒是豚草甲虫扫描的最佳时间。
13. 通过在“放大率和位置”菜单中输入记录的高程编号，将样本返回到视野。
14. 单击顶部工具栏上的扫描图标（蓝色圆形箭头）开始设置扫描参数：旋转步长 = 0.200 度；帧平均 = ON (2);随机移动 = 关闭 (0)。给扫描一个描述性标题并使用浏览按钮指定数据目录。创建一个新文件夹来存放扫描数据（图 4）。

图 4. 扫描设置示例

15. 按“扫描”开始扫描。

数据分析

数据处理与分析

A. 微型计算机断层扫描：图像处理、裁剪和重建

1. 打开 NRecon。
2. 加载扫描文件。
3. 在主程序界面的右侧，从“开始”选项卡中选择“微调”按钮。通过微调界面逐步调整对齐后、光束硬化校正和环形伪影减少设置。一次选择这些选项之一。建议将步数保留为 5，将参数步长保留为 1.0 以进行初始微调。在 Fine Tuning 窗口中按 Start 开始校正预览。
a. 对于每个设置，程序将估计所需的校正级别；即便如此，还是建议单独输入以使用此功能在提供的预览范围内移动以选择最佳校正因子。在工具栏上，单击箭头以检查每个设置对图像预览的更改。检查这些设置如何改变您的扫描数据并选择优化的图像。请注意每种校正类型的理想设置，并在必要时更改此数字以进行重建。
b. 在继续之前，对三种更正类型中的每一种重复此过程。如有必要，调整微调窗口中的参数增量以检查校正因子的较小变化。
4. 在“输出”选项卡中，移动直方图周围的线性边界以优化扫描的对比度。
5. 在“输出”选项卡中的直方图设置下方，通过单击“浏览”在计算机上选择“保存目标”。建议将重建文件与初始扫描数据一起保存，但保存在具有特定名称（例如Reconstruction ）的新子文件夹中。
6. 导航回“开始”选项卡，然后按“开始”重建扫描数据（如果批量更正，则按“开始批量”）。
7. 重建完成后，关闭 NRecon 并打开 Dataviewer。
8. 选择并打开在上一步中保存的重建文件。
9. 将选定的横截面移动到扫描中的一个点，该点显示移液器尖端内扫描样本的全长和宽度。
10. 调整图像的边界以裁剪任何不必要的空白区域；尝试从扫描中移除尽可能多的移液器尖端或周围空间，而不裁剪昆虫的部分。
11. 通过在扫描数据中选择新点来仔细检查裁剪信息，以确保保留所有特征。
12. 将裁剪后的图像保存在另一个新的子文件夹中（标题文件夹与之前一样具有描述性名称，例如Cropped ）并关闭应用程序。
13. 打开 CTVox。
14. 选择在上一步中处理的裁剪、重建的图像文件。
15. 如有必要，通过修改左侧面板中的对比度直方图来调整扫描数据的亮度和透明度。

笔记

1. 由于 3D 图像是从许多高分辨率图像重建的，因此首选高性能计算机来运行该协议中使用的软件。 Bruker 推荐配备双 6 核 Intel 处理器、32 GB RAM 和 6 TB 可用磁盘空间的普通工作站计算机。
2. 样本之间可能会发生变异，每次扫描都需要重新定向。扫描前将样品旋转 360 °可确保它们不会歪斜，并允许进行扫描前检查。如果在旋转过程中发生过多的移动，移液器吸头可以重新定向以尽量减少潜在的伪影。
3. 如果使用相同的相机位置，改变样本合并将改变推荐的像素大小；始终以小增量减小像素大小，以免损坏内部摄像头。应根据样品的传输情况考虑扫描参数的优化。通过样品的理想透射率是 20 % – 40% 的最小强度。通过更改过滤器、曝光时间和电压进行调整。
4. 使用相同参数扫描样本可以允许编译模型之间的比较。
5. 对于 SkyScan 1272 显微 CT 样本加载和 Dataviewer 的概述，布鲁克公司发布了介绍这些软件包的简短培训视频（布鲁克公司，2015 年和 2018 年）。这些视频可能是基本使用和熟悉软件界面的良好资源。这些视频中的说明针对其他样本类型进行了优化，因此应与上述说明结合使用，以针对昆虫样本定制数据处理。
6. Dataviewer 使用和重建过程的视频也可以从我们的团队获得（ McLaughlin 等人，分别为 2022a 和 2022b）。
7. 从该协议生成的重建扫描数据的示例可以在 Spahr 等人中找到。（2020）。此出版物的 3D 模型视频可在以下链接中查看： https ://doi.org/10.6084/m9.figshare.12221981.v1

食谱

70% 乙醇可以从 190 或 200 proof stock 制备如下：

1. 70% 乙醇，来自 200 标准乙醇库存
试剂终浓度数量
乙醇（绝对） 70% 700 毫升
氢气_ _ 30% 300 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

致谢

我们要感谢来自 WVU 动物模型成像设施的 Karen Martin 对 Bruker Skyscan 1272 Micro-CT 和随附软件的培训和使用。这项研究得到了 USDA-NIFA (HATCH) WVA00712 提供的资金的支持。该协议是在 Spahr 等人中开发和使用的。（2020）。

利益争夺

本文未声明任何利益冲突。

参考

Fraedrich, SW、Harrington, TC、Rabaglia, RJ、Ulyshen, MD、Mayfield, AE、3rd、Hanula, JL、Eickwort, JM 和 Miller, DR (2008)。红海湾豚草甲虫的真菌共生体在美国东南部的红海湾和其他樟科植物中引起致命的枯萎。植物诊断92(2)：215-224。
Freeman, S.、Sharon, M.、Maymon, M.、Mendel, Z.、Protasov, A.、Aoki, T.、Eskalen, A. 和 O'Donnell, K.（2013 年）。 Fusarium euwallaceae sp。 11 月 - 一种 Euwallacea sp. 的共生真菌，一种在以色列和加利福尼亚的侵入性豚草甲虫。真菌学105(6)：1595-1606。
Li, Y.、Simmons, DR、Bateman, CC、Short, DP、Kasson, MT、Rabaglia, RJ 和 Hulcr, J. (2015)。新的真菌-昆虫共生：培养、分子和组织学方法确定 Ambrosiodmus Ambrosia 甲虫的腐生多孔菌共生体。 PLoS 一10(9)：e0137689。
Li, Y.、Ruan, Y.、Kasson, MT、Stanley, EL、Gillett, C.、Johnson, AJ、Zhang, M. 和 Hulcr, J.（2018 年）。豚草甲虫（鞘翅目：象鼻虫科）Mycangia 的结构通过显微计算机断层扫描揭示。 J Insect Sci 18（5）。
O'Donnell, K., Sink, S., Libeskind-Hadas, R., Hulcr, J., Kasson, MT, Ploetz, RC, Konkol, JL, Ploetz, JN, Carrillo, D., Campbell, A.,等。 (2015)。不一致的系统发育表明 Fusarium-Euwallacea 豚草甲虫共生中反复发生宿主转变。真菌基因组生物学82：277-290。
Spahr, E.、Kasson, MT 和 Kijimoto, T. (2020)。显微计算机断层扫描允许增强真华科豚草甲虫在发育过程中和两性之间的肌血管的可视化。 PLoS 一15(9)：e0236653。
Yuceer, C.、Hsu, C.-Y.、Erbilgin, N. 和 Klepzig, KD (2011)。南方松甲虫 Dendroctonus frontalis（鞘翅目：象甲科、Scolytinae）的菌囊超微结构：复杂相互作用的复杂形态。动物学报92(3)：216-224。
布鲁克公司。 (2015)。 Bruker microCT 培训视频：dataviewer 简介。 [视频]。优酷， https://youtu.be/qs-ec2v3tuo
布鲁克公司。 (2018) SKYSCAN 1272：开始分析吧。 [视频]。 YouTube， https://youtu.be/HBZuBlg9qhg
McLaughlin, S.、Spahr, E.、Kasson, M. 和 Kijimoto, T. (2022a)。使用 Dataviewer 裁剪数据文件。无花果共享。媒体。 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21273327.v1
McLaughlin, S.、Spahr, E.、Kasson, M. 和 Kijimoto, T. (2022b)。使用 NRecon 进行 µCT 重建。无花果共享。媒体。 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21273342.v1