材料和试剂
1.1.5 厘米细胞培养皿（Falcon，目录号：353025）
2.6孔细胞培养板（Greiner Bio-One，目录号：657160 ）
3.5 mL 管（Falcon，目录号： 352096）
4.PolyWAX LP TM柱（PolyLC，目录号： 104WX0510）
5.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM）（Corning，目录号： 10-013-CV）
6.不含甲硫氨酸的 DMEM（DMEM -Met ）（Corning，目录号： 17-204-CI）
7.L-叠氮基高丙氨酸 (AHA)（Click Chemistry Tools，目录号： 1066-100）
8.胎牛血清（FBS）（Sigma，目录号： F4135）
9.青霉素/链霉素（Pen/Strep）（Gibco，目录号：15140-122 ）
10.Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)（Click Chemistry Tools，目录号： 1061-100）
11.硫酸铜 (II) (CuSO 4 )（Sigma，目录号： C1297）
12.生物素-炔烃（PEG4 甲酰胺-炔丙基生物素）（Click Chemistry Tools，目录号： 1266-5）
13.Bond Elut C8 墨盒（安捷伦，目录号： 12105028）
14.DBCO（二苯并环炔）磁珠（Click Chemistry Tools，目录号： 1037-1）
15.2-碘乙酰胺（TCI，目录号： I0741，CAS 144-48-9）
16.三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）（Sigma，目录号： C4706）
17.测序级修饰胰蛋白酶（Promega，目录号： V5111）
18.乙酸乙酯（Sigma，目录号： 270989）
19.C18 离心柱（Thermo Scientific，目录号： 89873）
20.三乙胺（TEA）（Sigma，目录号： 471283）
21.88 % –91%甲酸 (FA)（Sigma，目录号： 399388）
22.乙腈（ACN）（Sigma，目录号： 271004）
23.三氟乙酸（TFA）（Sigma，目录号： 302031）
24.甲醇（Sigma，目录号： 34860）
25.氯仿（ Avantor ，目录号： JT-9180-01 ）
26.Triton X-100（Amresco，目录号： 0694）
27.DMSO （二甲基亚砜）（ Alfa Aesar，目录号： 36480）
28.链霉亲和素-HRP（Invitrogen，目录号： S911）
29.碳酸氢铵（NH 4 HCO 3 ）（Sigma，目录号： A6141）
30.尿素（ CH 4 N 2 O ）（Sigma，目录号： U5128）
31.氯化钾 (KCl)（ Avantor ，目录号：3040-01 ）
32.碳酸钠（Na 2 CO 3 ）（Sigma，目录号：230952 ）
33.氯化钙（CaCl 2 ）（MP Biomedicals，目录号： 153502）
34.裂解缓冲液（见配方）
35.0.25 M TEAF pH 3.0 （参见配方）
36.RIPA 缓冲器（见配方）
37.4 × SDS 加载缓冲液（参见配方）
38.水饱和乙酸乙酯（见食谱）

设备
1.冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
2.冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
3.SpeedVac 真空浓缩器（Thermo Scientific，Savant SPD10）
4.涡旋混合器 (VWR, G-560 Vortexer 2)
5.管旋转器（ Thermo Scientific，目录号： 05-450-127 ）
6.热块( Thermo Scientific )
7.37 °C培养箱（ Thermo Scientific ）
8.Q Exactive Plus 混合四极杆轨道阱 (Thermo Scientific)
9.-80 °C 冰箱（ Thermo Scientific ）
10.-20 °C 冰箱（ Thermo Scientific ）
11.NEB磁性支架 (NEB, S1509S)
12.安捷伦 1100 高效液相色谱仪（安捷伦）
13.用于标准免疫印迹程序的其他试剂和设备
软件
1.Thermo Scientific Xcalibur（4.4 版）
2.吉祥物（2.5.1 版）
3.图像实验室（5.2 版）
4.用于 LC 系统的安捷伦化学工作站（B.04.03 版）

程序
A.美国心脏协会标记新合成的蛋白质

1.在 15 厘米细胞培养皿中接种2.5 × 10 7 个HEK 293T 细胞，然后在含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的完全 DMEM 培养基中于 5% CO 2气氛中在 37 °C下培养过夜，以达到 80% – 90% 的汇合度。
2.从细胞中吸出培养基，用 10 mL 室温 (RT) 1 × PBS 洗涤一次，然后加入 10 mL 预热的 DMEM -Met ，并在 5% CO 2气氛中于 37 °C孵育30 分钟.
3.在 1 × PBS中制备 0.4 M AHA（100 ×库存，在 -20 °C 下稳定至少 2 个月）。轻轻地从细胞中取出 DMEM -Met ，然后轻轻加入 10 mL 预热的 DMEM -Met以及 4 mM AHA (1 × ) 和 10% FBS。在 5% CO 2气氛中于 37 °C孵育2 小时，以使用 AHA 标记新合成的蛋白质。
4.去除培养基，用 10 mL 的 1 × PBS 洗涤两次，然后通过上下吹打收集细胞（注意：其他贴壁细胞类型可能需要轻轻刮擦收集）。将细胞转移到 15 mL 管中，以 800 x g和 RT离心3 分钟，然后轻轻吸出上清液。
注意：此时样品可以快速冷冻并在-80 °C下储存1–2 个月。

B.验证 AHA 标记和基于 C8 列的大小选择

1.特别是如果是第一次进行 BONCAT 标记，在进行蛋白质组分析之前，确认 AHA 并入细胞蛋白质组非常重要。为了检测 AHA 标记的蛋白质，我们建议对来自 6 孔细胞培养板的单个孔的细胞，以及来自未标记或载体处理细胞的蛋白质浓度标准化裂解物作为阴性对照，进行点击化学与商业可用的生物素-炔烃，然后是链霉亲和素-HRP 印迹，如图 1 所示。此步骤可以在与用于蛋白质组学分析的细胞平行制备的单独样品上执行。
a.× PBS 中加入 200 µL 1% w/v SDS到细胞沉淀中，然后在 100 °C 下煮沸 10 分钟。与所有步骤并行，处理相同数量的相同细胞的未标记（非 AHA 处理）颗粒作为阴性对照，以评估背景上的标记效率。
b.在细胞裂解液中加入 1.8 mL的1 × PBS，其中含有 0.2% Triton X-100。
c.对于 1 mL的总裂解物，通过在水中加入 2 μL 的 350 mM CuSO 4库存、1 μL 的 200 mM TBTA 库存在 DMSO 中和 3.5 μL 的 0.5 M TCEP 库存在水中来制备混合物。在 RT 下混合并孵育 10 分钟，以原位形成点击化学催化剂。
注意：剩余的 1 mL 裂解物可在 -20 °C 下保存 1 – 2 天，如果需要重复分析；如果不需要剩余的裂解物，则可以将其丢弃。
d.将 DMSO 中的 1 µL 25 mM 生物素-炔烃添加到步骤B 1c的混合物中，然后将此混合物添加到步骤B 1c的 1 mL 细胞裂解物中 B 1b 。在 RT 下旋转孵育 6 小时，通过点击化学将 AHA 标记的蛋白质与生物素衍生化。
e.将 100 µL 的点击化学反应转移到新的 1.5 mL 管中，加入 400 µL甲醇，涡旋 5 秒。
f.添加 100 μL的氯仿和涡流 5 s。
g.加入 300 µL ddH 2 O 并涡旋 5 秒，然后在室温下以 18,407 × g 离心2分钟。
h.移除并丢弃顶层，在剩余的底层中加入 400 μL 甲醇，涡旋 5 秒，并在 RT 下以 18,407 x g离心2 分钟。您应该观察蛋白质颗粒的形成。
i.在不干扰颗粒的情况下去除上清液，并在 RT 下干燥 5 分钟。要重悬含有标记细胞蛋白的颗粒，添加 50 µL 1 × SDS 加载缓冲液，然后在 100 °C 下煮沸 10 分钟。
j.将重悬的标记蛋白加载到12% SDS-PAGE 凝胶上，然后转移到硝酸纤维素上，并使用链霉亲和素-HRP 进行蛋白质印迹，如前所述（ Cao 等。 , 2021 年）。转移后对膜进行丽春红染色，以确认上样量相等。

图 1. 使用链霉亲和素-HRP 印迹进行 AHA 标记验证。 (A) AHA 标记验证的实验方案。 (B)链霉亲和素-HRP 印迹反映 AHA 标记，丽春红染色用作上样对照。
注意：如果 AHA 标记效率低下，可以优化 AHA 处理时间和浓度。

2.如果 AHA 标记在复制样品中成功，将 2 mL 裂解缓冲液（参见食谱）添加到来自步骤A 4和涡流的 15 厘米培养皿中标记为 AHA 的 HEK 293T 细胞沉淀，然后在 100 °C 下煮沸10 分钟重复涡旋和沸腾三到四次，直到细胞裂解液变得澄清。我们通常将裂解物等分到四个 1.5 mL Eppendorf 管中用于沸腾步骤，以适应我们的加热块的孔，然后重新组合裂解物以进行步骤下面的B3c ，但这可以适应任何合适的管尺寸或沸腾设备。
3.size select 用两根C8柱来富集小蛋白，如下（ Ma 等人， 2016 年）：
a.向两根 C8 柱中的每根柱中加入 500 µL 甲醇，以 200 x g离心1 分钟，然后丢弃流过液。
b.将 1 mL 的 0.25 M TEAF pH 3.0（参见配方）添加到两个 C8 柱中的每一个，然后以 200 x g离心1 分钟，并丢弃流过液。
c.将 1 mL 的细胞裂解物从步骤B 2加载到两个 C8 柱中的每一个（例如，每个 C8 柱的两个 Eppendorf 管的组合裂解物），然后以 200 × g离心2 分钟，并丢弃流过物。
d.将 1 mL 0.25 M TEAF pH 3.0 添加到两个 C8 柱中的每一个，然后以 200 x g离心2 分钟，并丢弃流出液。
e.将 0.5 mL 的 3:1 ACN:0.25 M TEAF pH 3.0 添加到两个 C8 柱中的每一个中，以 200 x g离心2 分钟，并保留洗脱液。重复此步骤一次，并合并所有列的所有洗脱液。
f.Speedvac 溶液在室温下干燥。此步骤最多可能需要 3 小时。

C.点击捕获珠子

1.用 1 mL RIPA 缓冲液（参见食谱）清洗 50 µL DBCO 珠浆，将管放在磁性支架上，取出并丢弃RIPA 缓冲液。
2.将 1.2 mL 的 RIPA 缓冲液添加到步骤B 3f中选择的大小的细胞裂解物中，涡旋 10 s，然后将洗过的 DBCO 珠重新悬浮在细胞裂解物中。在 RT 下旋转1 小时，然后将管子放在磁性支架上，取出并丢弃上清液。
3.按如下方式清洗 DBCO 珠子：
a.向珠子中加入 1 mL 的 RIPA 缓冲液，在 RT 下旋转 3 分钟，然后将管子放在磁性支架上，然后去除上清液。
b.ddH 2 O中加入 1 mL 的 1 M KCl到珠子中，在 RT 下旋转 3 分钟，然后将试管放在磁性支架上，并去除上清液。
c.将 1 mL 的 0.1 M Na 2 CO 3的ddH 2 O添加到珠子中，在 RT 下旋转 1 分钟，然后将试管放在磁性支架上，并去除上清液。
d.ddH 2 O中加入 1 mL 的 2 M 尿素到珠子中，在 RT 下旋转 1 分钟，然后将管子放在磁性支架上，并去除上清液。
e.向珠子中加入 1 mL 的 RIPA 缓冲液，在 RT 下旋转 1 分钟，然后将管子放在磁性支架上，然后去除上清液。重复此步骤一次。
f.将 1 mL 的 1 × PBS 添加到珠子中，在 RT 下旋转 1 分钟，然后将管放在磁性支架上，并去除上清液。再重复此步骤五次。

D.珠上消化

1.× PBS 中将400 µL 的 6 M 尿素添加到步骤中的 DBCO 珠中 C 3f ，然后在ddH 2 O中添加 20 µL 的 0.2 M TCEP 。
2.在 60°C 下孵育珠子10分钟，然后冷却至 RT。
3.ddH 2 O中加入 20 µL 的 0.4 M 2-碘乙酰胺，然后在 37 °C 下摇动孵育15分钟。
4.× PBS稀释溶液，然后将管放在磁性支架上，并去除上清液。
5.添加 300 µL 2 M 尿素在 1 × PBS 中的预混合溶液，在ddH 2 O中添加 3 µL 0.1 M CaCl 2和 10 µL 0.5 µg/µL 胰蛋白酶；在 37°C 的培养箱或水浴中孵育 14-16 小时。
6.将管子放在磁性支架上，并将上清液转移到新管中。用 50 μL 的水清洗珠子两次，以释放任何剩余的结合肽，并将洗涤液与上清液结合起来。
7.添加 15 μL 的 88%–91% FA 以停止消化。
8.Speedvac 溶液在室温下干燥。此步骤最多可能需要 3 小时。
注意：此时样品可在-80 °C下储存1 – 2 个月。

E.用乙酸乙酯去除洗涤剂

1.ddH 2 O中的 100 mM NH 4 HCO 3的100 µL 添加到步骤中的消化肽中 D 8 ，涡旋10 s。
2.向消化的肽溶液中加入 1 mL 水饱和乙酸乙酯（参见食谱），涡旋 10 秒，然后在室温下以 18,407 × g离心30 秒。移除并丢弃上层。重复此步骤一次。剩余的底层包含消化的肽。
3.Speedvac 溶液在室温下干燥。此步骤可能需要 1 小时。

F.使用 C18 离心柱对肽进行脱盐

1.ddH 2 O中的0.5% TFA到步骤 E3中的消化肽，并涡旋 10 s。
2.将 200 µL 50% 甲醇的ddH 2 O添加到 C18 离心柱中，然后以 200 × g离心2 分钟，并丢弃流过液。
3.ddH 2 O中加入 150 µL 5% ACN + 0.5% TFA到 C18 自旋柱，然后以 200 × g离心2 分钟，并丢弃流过液。重复此步骤一次。
4.将消化后的肽溶液添加到 C18 离心柱中，以 200 x g离心2 分钟，并丢弃流出物。
5.用 150 µL 5% ACN + 0.5% TFA 在ddH 2 O中清洗 C18 自旋柱，在 200 × g下离心2 分钟，然后丢弃流过液。重复此步骤一次。
6.2 O洗脱消化的肽，在 200 × g下离心2 分钟，并保留洗脱液。重复此步骤一次，并合并两个洗脱液。
7.Speedvac 溶液在室温下干燥。此步骤最多可能需要 2 小时。
注意：此时样品可在-80 °C下储存1 – 2 个月。

G.新生小蛋白的质谱分析

1.可选步骤：使用 Agilent 1100 HPLC 使用 PolyWAX LP 柱进行 ERLIC 分馏，如图 2 所示。
a.将 55 µL 的 85% ACN/0.1% FA 在ddH 2 O中添加到步骤F 7中的消化肽中，涡旋 10 秒，并将其中的 50 µL 加载到 PolyWAX LP 柱（150 × 1.0-mm；5 µm 300一种）。保留 10% 的总肽悬浮液用于预分馏 LC-MS/MS 分析，作为质量控制步骤。
b.用 80 分钟梯度分离肽，如下所示（溶剂 A：ddH 2 O 中的 80% ACN 0.1% FA ；溶剂B ： ddH 2 O中的 30% ACN 0.1% FA ）：将流速设置为 300 μL/分钟，从 0% B 开始持续 5 分钟，然后在 17 分钟内从 0% B 到 8% B，在 25 分钟内从 8% B 到 45% B，在 10 分钟内从 45% B 到 100% B。将等度流量保持在 100% B 5 分钟，然后在 10 分钟内从 100% B 梯度到 0% B，并将等度流量保持在 0% B 8 分钟。
c.以 1 分钟的间隔收集分数 1-10，以 10 分钟的间隔收集分数 11-13，以 20 分钟的间隔收集分数 14-15。
d.在 LC-MS/MS 分析之前将每个样品重新悬浮在ddH 2 O中的 10 µL 0.1% FA 中。

图 2. 消化肽的 ERLIC 分级

2.如果尚未执行 ERLIC 分馏，则将ddH 2 O中的 0.1% FA 的 35 μL 添加到步骤F 7中的消化肽中。在 18,407 × g和 4°C 下离心 30 分钟，然后丢弃沉淀物。
3.如果进行了 ERLIC 分馏，则将 5 µL 的每个分馏物以及 5 µL 的 10% 未分馏肽直接注入连接到 nanoAcquity UPLC（Waters）的预装柱上，并与 Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid QuadrupoleOrbitrap 联机质谱仪。如果未执行 ERLIC，则会注入 5 µL 的总消化肽。
4.用 130 分钟的梯度分离肽如下（溶剂 A：ddH 2 O 中的 0.1% FA ；溶剂 B：ddH 2 O中含0.1 % FA 的 ACN ）：将流速设置为 0.1 μL/min，从 1 开始% B 持续 40 分钟，然后在 2 分钟内从 1% B 到 6% B，在 48 分钟内从 6% B 到 24% B，在 5 分钟内从 24% B 到 48% B，以及在 48% B 到 80% B 5分钟。将等度流量保持在 80% B 5 分钟，然后在 5 分钟内从 80% B 梯度到 1% B，并将等度流量保持在 1% B 10 分钟。
5.将质量范围设置为 300–1,700 m/z，分辨率为 70,000，将自动增益控制 (AGC) 目标设置为 3 × 10 6 。在数据相关模式下使用前 10 高碰撞能量解离 (HCD) 碎片方法收集 MS/MS 数据，归一化碰撞能量为 27.0 eV 和 1.6 m/z 隔离窗口，分辨率为 17,500 MS/MS，根据制造商的说明，90 年代的动态排除。
笔记：质谱参数可能需要优化实验者可用的仪器，例如与质谱核心设施协商。

数据分析

多肽和蛋白质鉴定
1.将原始数据文件转换为 Mascot 通用文件 (MGF) 文件，并且，对于组合注释和未注释的蛋白质识别，根据 RNA-seq 数据的组装转录本的三帧翻译组成的数据库搜索数据，如前所述（ Khitun和 Slavoff，2019 年），加上 Mascot 提供的污染物数据库，使用 Mascot（版本 2.5.1）。分别针对 UniProt 人类蛋白质组数据库和污染物数据库搜索相同的数据集，以进行质量控制：在没有 ERLIC 分馏的小蛋白质 BONCAT 实验中，典型的运行检测到 1,968 种带注释的人类蛋白质，4.88% 通常 <100 个氨基酸。
2.将甲硫氨酸的氧化和 N-末端乙酰化设置为可变修饰，将半胱氨酸的氨基甲基化设置为固定修饰。将酶特异性设置为 semiTrypsin，并允许最大漏裂 2。将肽电荷设置为 2+、3+ 和 4+。将肽质量公差设置为 20 ppm，将碎片质量公差设置为 0.02 Da，如图 3 所示。单击“运行”。搜索最多可能需要 8 小时。
笔记：在搜索过程中，我们没有将叠氮基高丙氨酸设置为变量修饰，因为那些含有叠氮基高丙氨酸的片段仍然与珠子结合，并在消化肽提取过程中被去除。我们将从同一蛋白质中鉴定出其他胰蛋白酶肽。

图 3. Mascot 参数设置

3.运行完成后，打开结果文件 URL。识别和验证未注释的肽，如我们之前发表的协议文件（ Khitun 和 Slavoff，2019 年）中所示。简而言之，通过 Zenodo ( https://doi.org/10.5281/zenodo.5921116 )提供的自定义脚本删除与注释蛋白质的肽谱匹配，通过与包含当前人类蛋白质组注释的本地下载文件进行匹配。剩余的肽谱匹配针对非冗余 (NR) 人类蛋白质数据库进行 NCBI 蛋白质 BLAST，使用短输入序列的默认参数来确认它们相对于注释蛋白质的独特性。任何发现与最近的注释蛋白质（不包括具有 NP 或 XP 名称的预测蛋白质）匹配不同的少于两个氨基酸的肽将被丢弃，以消除由于突变或翻译后修饰导致的假阳性匹配的可能性。我们注意到氨基酸 I 和 L 是同量异位的，不能通过质谱法区分，因此将注释蛋白质与两个氨基酸不同的肽，但其中一个氨基酸是 I 或 L，也应丢弃。由于小蛋白质的鉴定通常仅依赖于单一的肽谱匹配，因此需要手动检查 MS/MS 谱图中的五个额外关键参数（图 4，右）。不符合这些标准的肽谱匹配将被丢弃。来自最近发现的一种名为 MINAS-60 的替代蛋白的高质量 MS/MS 谱图( Cao 等。 , 2022 )如图 4 所示，作为示例。
4.通过过滤器的肽谱匹配通过计算映射到它们的编码转录本和独特的基因组位点。简而言之，提取与步骤 3中识别的候选未注释肽相对应的转录序列，可以在用于生成 3 帧蛋白质组学搜索数据库的转录数据库中找到，然后以适合的格式翻译成三帧的氨基酸序列使用 ExPASy 翻译工具进行可视化分析。编码每个未注释的胰蛋白酶肽的 smORF 是根据对应于 smORF 的翻译区域内胰蛋白酶肽序列的存在来识别的。如前所述（Khitun和斯拉夫夫，2019 年）。

图 4. MINAS-60 的高质量 MS/MS 谱图。 Y 和 b 离子是母体胰蛋白酶肽裂解产生的产物离子。 y 离子是在 C 末端带电荷的电离肽片段，而 ab 离子是在 N 末端带电荷的肽片段离子。

食谱
1.裂解缓冲液
50 毫米盐酸
0.01% β-巯基乙醇 (v/v)
0.05% Triton X-100 (v/v)

2.0.25 M 茶叶 pH3.0
要配制 50 mL 溶液，请将 2 mL 三乙胺和 2 mL 甲酸添加到 46 mL ddH 2 O中。

3.RIPA 缓冲器
10 mM Tris-HCl (pH = 7.4)
1% Triton X-100 (v/v)
0.1% 脱氧胆酸钠 (w/v)
0.1% SDS（重量/体积）
140 毫米氯化钠

4.4 × SDS 上样缓冲液
240 mM Tris-HCl (pH = 6.8)
40% 甘油 (v/v)
8% SDS（重量/体积）
5% β-巯基乙醇 (v/v)
0.04% 溴酚蓝 (w/v)

5.水饱和乙酸乙酯
要配制 50 mL 溶液，请将 5 mL ddH 2 O 添加到 45 mL 乙酸乙酯中。

致谢
这项工作得到了马克基金会癌症研究新兴领袖奖 ( 21-055-ELA) 、Paul G. Allen Frontiers Group 杰出研究者奖、斯隆研究奖学金 ( FG-2022-18417) 、Searle 学者计划奖的支持，理查德和苏珊史密斯家庭基金会的奥德赛奖，以及耶鲁大学西校区（SAS）的启动资金。 XC 得到了耶鲁大学 Rudolph J. Anderson 博士后奖学金的部分支持。 AK 得到了 NIH 博士前培训补助金 (5T32GM06754 3-12) 的部分支持。

利益争夺
作者声明没有竞争利益。

参考
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