材料和试剂

1.8 周 C57BL6N 雄性小鼠 (Charles River)
2.异氟醚 1000 mg/g（Piramal Critical Care，目录号：803249）
3.500 μM CTX（Merk，目录号：217503-1MG）
4.9% NaCl 2 （Merk，目录号：S3014）
5.UltraPure DNase/RNase-Free 蒸馏水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10977049）
6.70% v/v 乙醇（Merk，目录号：64-17-5）
7.异戊烷（2-甲基丁烷无水≥99%-1l）（默克，目录号：277258）
8.液氮
9.苏木精和伊红 (H&E) 试剂盒染色（Bio-Optica，目录号：04-061010）
10.最佳切割温度化合物（OCT）（Tissue-Tek，目录号：4583）

设备
1.VetFlo兽用麻醉仪
2.解剖工具：
精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14160-10 ）
细镊子（Fine Science Tools，目录号：11412-11）
标准镊子（Fine Science Tools，目录号：11150-10）
3.微量离心管 1.5 mL（ Sarstedt ，目录号：72706）
4.冷冻管（ Sarstedt ，目录号：72.694.006）
5.载玻片（ Vetrotecnica ，目录号：01.4230.34）
6.500 μ L 注射器 30 G（Vetrotecnica，目录号：11.3525.45）
7.塑料勺
8.液氮杜瓦瓶
9.低温恒温器（徕卡，型号：CM1850）

程序
根据实验设计，实验所需的小鼠数量会有所不同。为了获得具有统计学意义和可重复性的结果，我们针对每种情况（例如，未注射和注射 3、7 和 14 天）使用至少四只成年（约 8 周龄）雄性小鼠。
1.在无菌条件下，通过将 1 mg CTX 粉末（MW：6.8 g/mol）溶解在 294 μL （3.4 mg/mL）的无菌 0.9% NaCl 2中制备 CTX 储备溶液，以获得 500 μM 的 CTX 溶液。分装 CTX 库存解决方案并将其储存在 -20 °C。为避免冻融循环，准备 10 μL的等分试样。对于 TA 注射液，用无菌 0.9% NaCl 2稀释储备液以获得 10 的最终溶液每个 TA 肌肉的总体积为 50 μL的μM CTX。通过涡旋混合溶液并将其保存在冰上直至使用。
注意：CTX 不属于危险品，因此无需特别小心。在无菌条件下制备和储存溶液非常重要。
2.麻醉异氟醚的动物，直到他们睡着了。异氟醚在 100% O 2中给药。使用约 3 % – 4%的异氟醚诱导浓度。维持浓度为 1.25% – 1.75%，以避免小鼠生理学的整体改变。在这种情况下，小鼠最多可被麻醉20-30 分钟。
3.用 50 μL的 10 μM CTX填充注射器（500 μL注射器 30 G， Vetrotecnica ）并准备好使用。
4.正确约束鼠标并将其头部插入麻醉管内（图 1A）。
5.用电动剃须刀剃掉老鼠的后肢，用 70% 乙醇擦拭该区域。握紧后肢足部，将步骤3准备好的注射器的针头平行于肌肉插入TA中腹区，然后在注射CTX前轻轻拉动注射器柱塞，确保针头没有进入血液容器（图 1B）。注射部位的最佳定位如图 2 所示，将注射器的针头平行于 TA 肌肉插入。如果没有血液进入注射器，则将 50 μL CTX 缓慢注入 TA 肌肉。注入 TA 时应特别小心，以免越过肌肉组织。
6.让老鼠从麻醉中恢复过来，然后把它放回笼子里。

图 1. 麻醉管理和 CTX 注射。在对动物进行充分麻醉诱导后，腿部受到限制 (A)，CTX 注射造成的损伤可通过注射在 TA 肌肉 (B) 中造成。

图 2。 CTX 注射部位（白点）在 TA 肌肉中的最佳定位
7.在 CTX 注射后的选定时间点，通过异氟醚吸入麻醉受体小鼠，并通过颈椎脱位将其处死。
8.再生TA可以通过以下方式收集：
a.切开脚踝以下的皮肤。
b.沿着后肢内侧切开皮肤。
c.通过拉起皮肤暴露肌肉筋膜和髌骨，并去除肌外膜（图 3A）。
d.使用钳子沿着小腿的内缘分离 TA 肌肉的肌腱（图 3B）。
e.用细剪刀剪断肌腱 (图 3C)。轻轻地将 TA 肌肉从骨骼中拉出（图 3C）。在 TA 下方，您可以看到趾长伸肌 (EDL) 肌肉（图 3C）。
f.在髌骨附近切割 TA 的上部（图 3D）。您可以继续进行 TA 冻结（图 3E 和图 4）。

图3 。隔离 TA 肌肉的程序。图片描绘了 (A) 肌外膜切除后的 TA 肌肉，(B) TA 肌腱的分离，(C) TA 肌腱的切割，(D) TA 远端部分的切割，以及 (E) TA 肌肉。一种。髌骨; b.助教； C。 TA 肌腱; d. EDL 肌肉。
9.用液氮填充杜瓦瓶并取出冷冻肌肉所需的所有材料（异戊烷、塑料勺、标准镊子和冷冻管）。
10.用 70% 乙醇喷雾解剖工具和工作区。然后用异戊烷填充一个becher （图 4A），并将其放在充满氮气的杜瓦瓶表面冷却（为避免凝固的风险， becher放在液氮的表面）（图 4B） ).
11.将隔离的 TA 肌肉放在塑料勺上，然后放在含有冷异戊烷的becher内，直到肌肉完全冷冻（大约需要 30 秒）（图 4C 和 4D）。用标准镊子取一个冷冻管，将其浸入液氮中冷却（图 4E）。一旦低温瓶变冷（5 秒），从异戊烷中取出勺子，立即将肌肉从塑料勺子上取下，并将其放入冷冻瓶中（图 4F）。此操作必须快速执行，以避免肌肉解冻。冷冻管保存在 -80 °C 直至使用。
注意：当肌肉均匀变白时，您可以认为肌肉完全冻结。

图 4. 为苏木精和曙红染色冷冻 TA 肌肉的程序。用异戊烷 (A)填充一个小becher ，将其放在装有液氮的杜瓦瓶 (B) 的表面，将分离的 TA 肌肉放在塑料勺 (C) 上，然后放入异戊烷 (D)，将冷冻管浸入使用镊子 (E) 的液氮并将肌肉从塑料勺中分离出来，并将其放入冷冻管 (F) 中。

12.对于切片，横向切割冷冻肌肉，并使用两滴 OCT 将一半嵌入肌腱部位的低温恒温器卡盘上。让组织块与低温恒温器温度（-20 °C ) 在切割部分之前。切 6 μm肌肉载玻片与低温恒温器一起使它们粘附在带正电的显微镜载玻片上。在室温下干燥载玻片，直到切片牢固地粘附在载玻片上。
13.按照制造商的说明（Bio-Optica）执行 H&E 染色（图 5）。

图 5. WT 胫前肌 (TA) 肌肉 (Ctrl) 未注射和 CTX 注射后 3、7 和 14 天的苏木精和伊红 (H&E) 染色。比例尺，50 微米。

数据分析

比较两个数据集，如 Feno等人。 (2021)，其中我们评估了骨骼肌再生过程中线粒体 Ca 2+对巨噬细胞极化的影响，应用了参数学生t检验和参数单向方差分析 (ANOVA) 以及事后 Tukey 多重比较检验.每当样本量低于五个时，就会执行非参数 Mann-Whitney 或非参数 Kruskal-Wallis 检验以确认统计分析。 P ≤ 0.05 被认为是显着的。

笔记

肌肉注射：
在肌肉注射过程中，必须对小鼠进行适当的麻醉和约束。如果鼠标被允许踢或挣扎，这可能会伤害沿着股骨长度延伸的肌肉或坐骨神经。平行于 TA 肌肉插入注射器的针头，一旦注射，检查肌肉状态。如果 CTX 注射正确，您应该观察到肌肉肿胀。
麻醉程序：
必须在手术过程中监测被麻醉的小鼠，以确保它们保持在适当的麻醉水平。监测粘膜和暴露组织的呼吸和颜色。呼吸频率增加表明麻醉太轻。相反，深沉或不规则的呼吸频率意味着麻醉过高。

致谢

我们感谢意大利癌症研究协会 (AIRC)（IG18633 至 RR）、帕多瓦大学（STARS@UNIPD WiC grant 2017 至 RR）、意大利电视马拉松协会（GGP16029 至 RR 和 GGP16026 至 AR）、意大利卫生部Health（RF-2016-02363566 到 RR 和 GR-2016-02362779 到 AR）、 Cariparo基金会（到 RR）和 ERC（授权号 3228.v23 到 AV）支持这项工作。
该协议源自 Feno 等人。 (2021)， DOI：10.1126/scisignal.abf3838。

利益争夺

作者声明不存在财务或研究利益冲突。

伦理

体内实验是根据意大利法律 D. L.vo n.26/2014 进行的。

参考

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