材料和试剂

小鼠感染菌的制备

15 mL 锥形管（Greiner Bio-One CELLSTAR，目录号：188621）
50 mL 锥形管（ MiniPlast ，目录号：835-050-21-111）
微量离心管（Corning® Axygen ，目录号：MCT-175-C）
分光光度比色皿（聚苯乙烯比色皿，10 × 4 × 45 mm， Sarstedt AG & Co. KG，德国，目录号：67.742）
GAS 菌株（血清型 M14 菌株 JS14，分离自肺炎患者，血清型 M1T1 菌株 5448，临床分离自坏死性筋膜炎和中毒性休克综合征患者）
无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（不含氯化钙和氯化镁，pH 7.1 – 7.5，Biological Industries，目录号：02-023-1A）
你的媒体（见食谱）
Todd-Hewitt 肉汤（Becton、Dickenson 和 Company，目录号：249240）
酵母提取物（Becton、Dickenson 和 Company，目录号：212750）
血琼脂平板（见食谱）
去纤维蛋白羊血（DSB）（ hylabs® ，目录号：PD049 ）

小鼠感染

1 mL 无针头注射器（BD Plastipak TM 1 mL Luer ，目录号：303172）
针头（30G × 1/2"）（BD Microlance TM 3，目录号：2025-01）
注射用细菌培养物（悬浮于 PBS 中）
女BALB/c OlaHsd小鼠， 3-4 周龄，体重 10-12 克（ENVIGO RMS，以色列有限公司）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：472301）
聚乙二醇（PEG-400）（Sigma-Aldrich，目录号：202398）
0.9% 氯化钠盐水（Teva Medical，目录号：AWN1324）
氯胺酮-甲苯噻嗪混合物（分别以 1:6 的比例混合，氯胺酮-Vetoquinol ，甲苯噻嗪 20 mg/mL， Eurovet Animal Health BV）
异氟醚（Piramal Critical Care Inc，美国，目录号：66794-013-25）
GSK2656157（Sigma-Aldrich，目录号：504651）（参见食谱）
综合应激反应抑制剂(ISRIB)（Sigma-Aldrich，目录号：SML0843）（参见食谱）

皮肤活检样本中 GAS 的 CFU 量化

无菌 2 mL 管（ Abdos Labtech Private Limited，目录号：P10203）
无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（不含氯化钙和氯化镁，pH 7.1 – 7.5，Biological Industries，目录号：02-023-1A）
70% 乙醇（ Romaical ，19-19-009102-80）
8.0 毫米穿刺活检（ Acu -Punch， Acuderm Inc.，目录号：P825）
解剖套件——手术剪和细镊子
血琼脂平板（见食谱）
去纤维蛋白羊血（DSB）（ hylabs® ，目录号：PD049 ）

设备

分光光度计（ Amersham Biosciences， Ultraspec 2100 pro，80-2112-21）
带摆动转子的离心机（Sigma，型号：3-16PK）
涡旋混合器（ Heidolph reax top, Z655988）
-80 °C 冰箱（Thermo Scientific，8926）
37 °C 培养箱（BINDER GmbH，BD 56）
数显游标卡尺（Bar Naor Ltd.，BN30087-00）
电子均质器 (POLYTRON ® 2100 均质器， Kinematica ，05400261)
电动剃须刀（Phillips，MG3730/15）
干燥器罐（SP BEL-ART 聚碳酸酯/聚丙烯干燥器，F42032-0000）

软件

GraphPad Prism 5.03（用于统计分析和图形呈现）

程序

小鼠菌种制备感染

从冷冻甘油库存（过夜生长的细菌在 15% v/v 最终强度无菌甘油中冷冻），将 GAS 菌株接种到 15 mL 密封锥形管中的 10 mL THY 培养基中。将细菌在 37°C 下静态培养 16 小时。
将 3 mL 的隔夜培养物转移到 50 mL 密封锥形管中的 47 mL 预热新鲜 THY 培养基中。在 37 °C 下培养细菌，无需搅动至对数中期，直到 600 nm 处的光密度 (OD 600 ) 达到 0.3 – 0.4 。
将培养管在 4,000 × g和 14 °C 下离心 10分钟，弃去上清液。将细菌颗粒悬浮在 20 mL 无菌 PBS 中后清洗。在 4,000 × g和 14 °C 下离心 10 分钟。重复洗涤步骤两次。丢弃上清液并在 1 mL 无菌 PBS 中重新悬浮细菌颗粒。
测量细菌悬浮液的 OD 600 ，并用 PBS 将其调整为 0.8（对应于 1 × 10 9 CFU/mL）。在 PBS 中按 1:20 稀释细菌培养物以获得 5 × 10 7 CFU/mL（亚致死剂量）。将试管置于冰上直至使用。
确定 CFU 计数以计算注射到小鼠体内的细菌数量。首先，通过将 100 μL 的接种物添加到 900 μL 的 PBS 中，将细菌接种物连续稀释至七次稀释。接下来，将 10 -5 、10 -6和 10 -7稀释液的 100 µL 板到血琼脂板上。最后，将盘子在 37°C 下孵育过夜。
要确定 CFU/mL，请计算适当稀释的血琼脂板上的菌落数，然后乘以稀释因子。

体内软组织模型

三到四个星期大的雌性 BALB/c OlaHsd小鼠（体重 10-12克）被留在一次性笼子中适应环境三天，笼子补充了丰富的食物、无菌食物和水，在环境受控的无特定病原体 (SPF) 的房间里条件。
称重小鼠并将它们均匀地分布在笼子里。在细菌感染前一天在耳朵上标记小鼠并剃掉它们的背侧。
不同组的小鼠接受 100 µL 皮下 (SC) 或腹膜内 (IP) 注射 GSK2656157（100 µg/小鼠/注射）或 ISRIB（35 µg/小鼠/注射）或对照（90 µL 盐水 + 10 µL DMSO和 PEG 400 以 1:1 的比例）。
在细菌感染前 4 小时皮下注射 GSK2656157/ISRIB。随后，在感染后 (PI) 12 小时的间隔内交替注射抑制剂的 SC 和 IP，直至第六天。在后处理小鼠实验中，皮下注射 GSK2656157/ISRIB PI 12 小时，然后 IP 和 SC 注射 GSK2656157/ISRIB，以 12 小时的间隔交替给药，直到第六天（图 1 ）。

图 1. 抑制剂注射和取样程序的时间表。 BALB/c 小鼠被置于具有受控环境条件的特定无病原体 (SPF) 条件下。他们称重，在背侧剃毛，并标记以供识别。小鼠通过皮下 (SC) 施用 5 × 10 6 CFU 的 GAS 菌株进行感染，并且未经处理、感染前 4 小时处理或感染后 12 小时 (PI) 用 GSK2656157/ISRIB 处理。抑制剂每 12 小时通过 SC 或腹膜内 (IP) 途径交替注射剂量 1 (D1) 和剂量 2 (D2)，持续 6 天。在不同的时间间隔进行采样（S1、S2、S3 和 S4）以通过皮肤活检对细菌进行定量。

给小鼠注射亚致死剂量 (5 × 10 6 CFU) 的 GAS，以测试 GSK2656157/ISRIB 的功效。将 100 µL 体积的细菌溶液通过 SC 注射到小鼠的后腹。细菌载量通过连续稀释和血琼脂平板上的 CFU 估计来确认。
通过吸入异氟醚然后颈椎脱位对小鼠进行安乐死，并在不同时间点使用 8.0 毫米穿孔活检工具收集皮肤组织样本。将组织样本转移到含有 0.5 mL 无菌 PBS 的 2 mL Eppendorf 管中。使用均质器以 20,000 ± 100 rpm 的振动速度对皮肤组织样本进行均质化 30 秒，在 PBS 中稀释，并将样本置于血琼脂板上。在 37 °C下将血琼脂板孵育过夜后，对 CFU 进行量化。 CFU 的数量被归一化为软组织样本的重量。
游标卡尺测量不同组小鼠的皮肤坏死病变面积。病变面积使用公式 A = ( π/ 2)(长度)(宽度)计算( Pinho -Ribeiro等人，2018 年)。允许的最大皮肤坏死病变面积为 2 cm 2 。
可以使用 GraphPad Prism 5.03 软件测试所有定量数据（CFU 计数和皮肤坏死病变面积）的统计显着性。

笔记

小鼠应每天检查两次，包括称重。
体重减轻 15% ）的状况采用评分方法两次连续测量之间的重量）和病变的严重程度。
通过注射过量的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（分别以 1:6 的比例总共 60 μL）对小鼠实施安乐死，然后在评分时进行颈椎脱位指出需要一个早期的人道终点。

食谱

你的媒体
Todd-Hewitt 肉汤 (3%) 添加 0.2% 酵母提取物的蒸馏水
血琼脂平板
添加 5% (v/v) 去纤维蛋白绵羊血 (DSB) 的胰蛋白酶大豆琼脂 (TSA)

葛兰素史克2656157
溶解 GSK2656157 在 DMSO 中，并加入等体积的 PEG 400。
等分试样可以储存在 -80 °C直至使用（ 3 个月内使用）。在注射当天，将混合物在盐水（0.9% 氯化钠）中稀释10 倍，以达到 1 mg/ mL 的最终浓度。

ISRIB
溶解 ISRIB 在 DMSO 中，并加入等体积的 PEG 400。
等分试样可储存在 -80 °C 直到使用（ 3 个月内使用）。在注射当天，将混合物在盐水（0.9% 氯化钠）中稀释 10 倍，以达到 0.35 mg/ mL 的最终浓度。

致谢

这项工作得到了以色列科学与人文学院 (ISF) 管理的以色列科学基金会的赠款、ISF 的第一笔赠款、ISF-UGC 联合科学研究计划以及新加坡总理办公室国家研究基金会的资助在其卓越研究园区和技术企业 (CREATE) 计划下。此外，AA 和 AS 感谢以色列委员会的 PBC 奖学金计划提供部分资金。该协议用于 Anand 等人。 (2021) (DOI: 10.1126/scitranslmed.abd7465)。

竞争利益

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

伦理

对研究动物进行人道处理、护理和治疗的所有动物程序均按照经批准的伦理准则执行耶路撒冷希伯来大学伦理委员会（方案编号 MD-18-15522-5）。

参考

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