材料和试剂
50 mL 锥形管（Corning， Falcon TM ，目录号：352098 ）
1.8 mL 低温管（ Thermo Fisher Scientific，Nunc TM ，目录号：368632 ）
5 mL 圆底管（ Corning，Falcon TM ，目录号：352054 ）
带细胞滤网盖的 5 mL 圆底管（ Corning，Falcon TM ，目录号：352235 ）
1.5 mL 螺帽微管（ Sarstedt，目录号：72692005 ）
1.5 mL 安全锁管（ Eppendorf，目录号：0030123328 ）
双室载玻片（Thermo Fisher Scientific、 Nunc TM 、Lab-Tek TM ，目录号：177429）
100 mm 培养皿（Corning，目录号：430591）
35 mm 培养皿（Greiner Bio-One，目录号：627161）
48 孔板（组织培养处理）（ Corning， Costar TM ，目录号：3548 ）
3.5 mL 移液器（Sarstedt，目录号：86.1171.001）
封口膜（Bemis，目录号：PM996）
过滤卡和垫片（干细胞技术，目录号：04911）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Gibco，目录号：10010015）
Lymphoprep（干细胞技术，目录号：07801）
RPMI 1640（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
IMDM（泛生物技术，目录号：P04-20450）
胎牛血清（FBS）（Pan-Biotech，目录号：P30-19475）
青霉素/链霉素（Pan-Biotech，目录号：P06-07100）
二甲基亚砜（DMSO）（WAK-Chemie，目录号：WAK-DMSO-10）
DNase（沃辛顿，目录号：LS002007）
Megacult TM -C 胶原蛋白和含脂质的培养基，不含细胞因子（ Stemcell technologies，目录号：04974）
甲醇（默克公司，EMSURE® ，目录号：106009）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：320110）
盐酸溶液 6 M (HCl)（默克公司，目录号：143007）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
钾（KHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：237205）
EDTA四钠（Sigma-Aldrich，目录号：03699）
TRIS（Roth，PUFFERAN® ，目录号：5429.1）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
伊文思蓝（Sigma-Aldrich，目录号：E2129）
无血清扩增培养基 II (SFEM II)（干细胞技术，目录号：09655）或StemPro 34 SFM + 营养补充剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10639011）
L-谷氨酰胺（200 mM）（Sigma-Aldrich，目录号：59202C）
重组人干细胞因子（SCF）（PeproTech，目录号：300-07
重组人血小板生成素（TPO）（PeproTech，目录号：300-18）
重组人白细胞介素 3（IL-3）（PeproTech，目录号：200-03）
重组人白细胞介素 6（IL-6）（PeproTech，目录号：200-06）
重组人白细胞介素 9（IL-9）（PeproTech，目录号：200-09）
富含脂质胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：L4646）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G，0.5M 溶液）
FcR 阻断试剂人（Miltenyi，目录号：130-059-901）
小鼠 IgG1，κ 同种型对照（ BioLegend ，目录号：400101）
小鼠抗人 CD41（ BioLegend ，目录号：303702）
ImmPRESS® - AP 马抗小鼠 IgG 聚合物检测试剂盒（Vector Laboratories，目录号：MP-5402）
碱性磷酸酶 (AP) 底物试剂盒，Vector® Red （Vector Laboratories，目录号：SK-5100）
小鼠抗人 CD34 FITC（BD Biosciences，Pharmingen TM ，目录号：555821）
小鼠抗人 CD45 V500-C（BD Biosciences， Horizon TM ，目录号：655873）
小鼠抗人 CD2 PE-Cy5（BD Biosciences，Pharmingen TM ，目录号：555328）
小鼠抗人 CD3 PE-Cy5（BD Biosciences ，Pharmingen TM ，目录号：555334）
小鼠抗人 CD19 PE-Cy5（BD Biosciences ，Pharmingen TM ，目录号：555414）
小鼠抗人 CD14 PerCP-Cy5.5（BD Biosciences ，Pharmingen TM ，目录号：562692）
小鼠抗人 CD16 PE-Cy5（BD Biosciences ，Pharmingen TM ，目录号：555408）
小鼠抗人 CD56 PE-Cy5（BD Biosciences ，Pharmingen TM ，目录号：555517）
小鼠抗人 CD41 APC-Cy7（ BioLegend ，目录号：303716）
小鼠抗人 CD42b APC（ BioLegend ，目录号：303912）
7-氨基-放线菌素 D (7-AAD)（BD Biosciences ，Pharmingen TM ，目录号：559925）
计数珠（Thermo Fisher Scientific，Countbright TM ，目录号：C36950，LOT-特定浓度：0.515 × 10 5 个珠子/50 µL)
RBC 裂解缓冲液（见配方）
冷冻媒体（见食谱）
解冻媒体（见食谱）
染色缓冲液 (SB)（参见配方）
抗体鸡尾酒（见食谱）
巨核细胞 (Mk) 菌落培养基（参见食谱）
巨核细胞分化（Mk-diff）培养基（见食谱）
等渗 NaCl 溶液 (0.15 M)（参见食谱）
TRIS 缓冲液（0.5 M，pH 7.6）（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
底物缓冲液（见配方）
伊文思蓝溶液 (0.1%)（见配方）
染色盘（见食谱）

设备

吊桶式离心机（ Eppendorf，型号：5810R ）
台式离心机（ Eppendorf，型号：5427R ）
倒置光学显微镜（蔡司，型号：Primovert ）
正置光学显微镜（奥林巴斯，型号：BX51）
荧光激活细胞分选仪（ BD Biosciences，型号：Aria IIIu ）
流式细胞仪（ Beckman Coulter，型号：Cytoflex S 或 BD Biosciences FACS CantoII）
层流工作台
通风柜
钳子
解剖刀

软件

FlowJo v10（FlowJo LLC）
棱镜 9 (GraphPad)

程序

外周血单个核细胞 (PBMC) 的采集和储存

笔记：
收集患者材料必须得到当地伦理委员会的批准，并且每位患者都需要在收集材料之前给予知情同意。
使用层流工作台在无菌环境中执行所有实验步骤。
或者，处理过的样品可以从生物库中获得并用于后续分析。

用 15 mL PBS 稀释 MPN 患者的 15 mL 全血，并在 50 mL 锥形管中缓慢覆盖在 15 mL Lymphoprep 或类似密度梯度试剂的顶部。
在室温下以800 × g离心 30 分钟（不包括加速和减速时间）。
使用无菌 3.5 mL 塑料移液器从 Lymphoprep（下相）和血清（上相）之间的白色间层小心收集 PBMC。避免用 Lymphoprep 污染该层。
× g离心来洗涤 PBMC 在室温下放置 5 分钟。
可选：如果细胞沉淀含有红细胞 (RBC)，则执行 RBC 裂解以进一步纯化 PBMC。
将沉淀悬浮在 10 mL 的 RBC 裂解缓冲液中（参见配方 1），并在室温下孵育 10 分钟。
× g离心来洗涤 PBMC 在室温下放置 5 分钟。
在 5 mL PBS 中重新悬浮颗粒并计数细胞。在此步骤中将细胞放在冰上。
取一小部分细胞 (5 × 10 4 ) 并确定 CD34 +细胞分数。
在含有抗人 CD34 FITC 抗体的 50 µL 染色缓冲液中以 1:25 稀释重悬细胞，并在 4°C 下孵育 30 分钟。
通过与 1 mL PBS 混合洗涤细胞，并在 4°C 下以 350 × g离心 5 分钟。
在 100 µL 染色缓冲液中重悬沉淀（见配方 2）。
添加 2 μL 的 7-AAD，孵育 5 分钟，并在流式细胞仪上获取细胞。
同时，将 PBMC 在 4°C 下以 350 × g离心5 分钟，在 1 mL 冷冻培养基中重悬多达 5 × 10 6 个细胞（见配方 3），然后转移至冷冻管中储存。
将 PBMC 冷冻在液氮中，以便长期储存直至需要。

原代人 CD34 +细胞分离

注：在 MPN 患者外周血中观察到的 CD34 +细胞分数变化很大，但通常远高于正常健康成人。我们观察到 CD34 + HSPC 的范围从 0.2 %到 20%。如果该数据不适用于您的样本，我们建议解冻一小瓶细胞并确定 CD34 +细胞频率以估计所需的 PBMC 小瓶数量。
在预热至 37°C 的水浴中解冻冷冻的 PBMC。获得足够的 CD34 +细胞用于巨核细胞分化所需的小瓶数量取决于总 PBMC中 CD34 +细胞的预定频率。
将两瓶相同样品（1 × 10 7 个细胞）中的细胞转移到一个 50 mL 试管中，并在轻轻旋转的同时将 40 mL 解冻培养基（参见配方 4）滴加到细胞中。
在室温下孵育细胞 10 分钟。解冻培养基中的 DNase 会消化死细胞释放的任何 DNA，否则会促进细胞聚集。
在室温下以 350 × g离心细胞 5 分钟并去除上清液。
在 135 µL 染色缓冲液中重悬细胞沉淀（见配方 2）。
加入 15 μL 的 FcR 阻断试剂人，混合均匀，室温孵育 5 分钟。
加入 40 µL 抗体混合物（参见配方 5），充分混合，并在 4°C 下孵育 30 分钟。
笔记：
可以使用具有不同荧光偶联物的抗体；然而，谱系抗体（CD2、CD3、CD19、CD14、CD16、CD56）应在与活性染料相同的通道中发射，以便有效排除。
在实验的初始设置中，应准备未染色和单一 CD34 和 CD45 抗体以及谱系抗体和 7-AAD 染色细胞，以正确补偿所有荧光团并在流式细胞仪上建立种群门。
用 5 mL 染色缓冲液清洗细胞一次。
在 4°C 下以 350 × g离心细胞 5 分钟并去除上清液。
将细胞重新悬浮在 500 μL 的染色缓冲液中，并通过细胞滤网盖将悬浮液过滤到 5 mL 圆底管中。
添加 10 μL 的 7-AAD，并在细胞分选前将管子放在冰上。
将 Lin - CD34 + CD45暗淡（图 1 ）造血干细胞和祖细胞（HSPC）分类到 1.5 mL 螺帽管中，用于下游检测。理想情况下，将 8,000 个 CD34 + CD45暗淡HSPC 分类到含有 400 µL Mk 菌落培养基（参见配方 6）的试管中，并将至少 100,000 个 CD34 + CD45暗淡HSPC 分类到包含 200 μL Mk-diff 培养基的单独试管中（参见配方 7）。
注意：对于某些样本，可能无法对如此大量的细胞进行排序。这些实验可以根据最终获得的细胞数量进行缩放。液体培养分化试验已经进行了少至 1,000 个细胞/复制。

通过荧光激活细胞分选 (FACS) 纯化CD34 +细胞的门控策略。 ( A) 首先，细胞碎片（顶行，左）和剩余的粒细胞（顶行，中间）被排除在 SSC-A/FSC-A 图中，选定的单细胞在 FSC-A/FSC-H 图中被门控（顶行，右）。接下来，通过对谱系标记阴性和活（7-AAD 阴性）细胞（底行，右图）进行门控来预富集 HSPC。通过对 CD34 + CD45 dim细胞设门进一步纯化 HSPC （下行，左图）。 (B)未染色（左图）和单染色（中图和右图）细胞用于设置补偿控制并确定荧光阈值以准确设置种群门控。

继续进行巨核细胞集落形成测定（C 部分）和液体培养分化（D 部分）。

基于胶原蛋白的集落测定中 TPO 独立巨核细胞祖细胞的分化和定量

笔记：
该测定可用于分析治疗药物干扰 MPN 患者来源的 HSPC 巨核细胞分化的能力。
该测定旨在使用四次重复（两个双室载玻片）分析样品。为了进行更多的测试，可以将所有试剂的细胞数量和体积减少一半，并且只进行重复测试。
健康 HSPC 的最佳增殖和巨核细胞分化需要添加 50 ng/mL TPO。虽然 CALR mut或 MPL mut样本不需要添加 TPO ，但根据我们的经验，JAK2 mut HSPC 在完全没有 TPO 的情况下不会生长。 JAK2 V617F样品可能需要低剂量的 TPO (5 – 10 ng/mL)，并且应该与健康对照进行比较以测量 TPO 超敏反应而不是因子独立性。

通过移液将分选的 HSPC 混合在 1.7 mL 的 Mk 菌落培养基中（参见配方 6）。
如果要测试治疗性化合物，则应在细胞悬浮之前将它们添加到 Mk 菌落培养基中。
用铅笔适当地标记双室幻灯片，因为标准实验室标记或钢笔的墨水在固定过程中会变得难以辨认。
使用 2 mL 血清移液器，小心地将 1.2 mL 冷胶原蛋白添加到 Mk 菌落介质中，并通过轻轻移液混合，避免介质起泡。
在此过程中，将胶原蛋白放在冰上，一次只准备一个管子，以防止胶原蛋白在播种前凝固。
将 0.75 mL 的细胞悬浮液分配到两个双室幻灯片（四个重复）的每个孔中，并通过圆周运动分配体积。
将每个腔室幻灯片与一个装有 3 mL 无菌水的 35 毫米培养皿一起放入一个单独的无菌 10 毫米培养皿中（图 2 ）。

图 2.用于基于胶原蛋白的巨核细胞集落测定的双室载玻片设置。用 CD34 + HSPC接种的双室载玻片以及一个装满水的培养皿，以在 12 天培养期间保持湿度。

关闭 10 mm 培养皿并将其放入 37°C 和 5% CO 2气氛的加湿培养箱中培养 12 天。
使用倒置光学显微镜检查菌落形成，如果存在菌落，则进行固定和染色（图 3）。

图 3. 固定和染色前的巨核细胞集落示例。 ( A)两个致密的小菌落。 (B) 中型殖民地。 (C) 大型殖民地。比例尺代表 100 µm。

准备 100 mL 固定剂（甲醇和丙酮的 1:3 混合物）并放入矩形塑料或玻璃盘中（至少 12 × 9 × 2 厘米）。用封口膜或适当的盖子盖住盘子，然后放入通风橱中。
一次从培养箱中取出一个腔室幻灯片，并立即进行拆卸，因为胶原蛋白在较低温度下变得不稳定（视频 1 ）。

视频 1. 固定前双室幻灯片的拆卸。从滑梯上取下室盖和双室分离。

从腔室幻灯片上取下盖子。
从载玻片标记的一端开始小心提起腔室。
使用手术刀切割连接到腔室的底层橡胶密封件的连接点（总共三个）。
继续到幻灯片的另一端，直到腔室断开连接。橡胶密封圈仍应附在载玻片上。
小心避免从每个腔室移动或转动两块胶原蛋白。如果胶原蛋白块从原始位置移动（例如，移出橡胶密封边界），请使用手术刀或表面光滑的镊子小心地将它们放回原位。
使用手术刀将橡胶密封件切成 2 – 4 块（视频 2 ）。

视频 2. 双室载玻片脱水。从双室载玻片上去除橡胶密封件，并从胶原蛋白包埋的菌落中脱水。

使用镊子小心地将橡胶密封件从幻灯片上拉下来，避免抓住胶原蛋白块。
在继续固定之前，此时可以再次重新对齐胶原蛋白块。
固定前移除任何剩余的培养基（视频 2 ）。
将预切垫片放在幻灯片上，确保胶原蛋白片完全覆盖。在接触胶原蛋白之前将垫片与载玻片对齐，因为胶原蛋白附着在垫片上，之后不允许进一步调整。
用过滤卡盖住垫片，等待它完全被培养基浸透。如果过滤卡不会自行浸湿介质，则仅对过滤卡施加轻微压力。完全去除培养基对于正确固定很重要。
取下过滤卡并将带有垫片的腔室滑块放入固定液中。整个幻灯片应该被淹没（视频 3 ）。
等到垫片开始漂浮。然后，用镊子抓住一个角，小心地将其从幻灯片上拉下来。胶原蛋白应保持附着在载玻片上。
如果垫片没有自行漂浮，请轻轻摇动含有固定剂的培养皿以去除垫片。

视频 3. 脱水载玻片的固定。将胶原蛋白包埋的菌落固定在脱水双室载玻片上，并在固定过程中从载玻片上移除垫片。

固定载玻片 20 分钟；然后，将它们从固定液中取出并风干 15 分钟。
可以延长干燥时间以允许处理所有载玻片并对所有载玻片并行进行后续染色。
如有必要，固定的载玻片可在 2 – 8°C 下保存并在三天内染色。
对菌落进行免疫细胞化学染色。
准备染色所需的所有缓冲液和试剂（参见配方）。
将固定和干燥的载玻片水平放置在染色托盘上（商业或自制（参见配方 13，图 4 ））。所有后续步骤均在室温下进行。

图 4. 胶原蛋白巨核细胞集落检测染色设备的制备。 (A) 在矩形塑料盘中使用血清移液器自制染色托盘的示例。 (B) 安装在水槽上的金属染色托盘示例。

通过用新鲜制备的洗涤缓冲液（参见配方 10）覆盖整个载玻片来使菌落再水化，并在室温下孵育 20 分钟。不要使用洗瓶，因为压力会导致固定的胶原蛋白脱落。
通过将幻灯片倾斜到废物容器中来移除缓冲区。确保在以下步骤中，胶原蛋白包埋的菌落始终被液体覆盖，并且不会变干。
在室温下用六滴 2.5% 马血清阻断载玻片 20 分钟，以防止抗体的非特异性结合。可以使用其他血清，只要它们与所用二抗的种类相匹配。
在洗涤缓冲液 + 1% BSA 中制备 1:100 稀释的小鼠抗人 CD41 和小鼠 IgG1 对照抗体。
在幻灯片中加入 500 μL 的 CD41 抗体，并在室温下孵育 30 分钟。每个染色批次至少应有一张载玻片与小鼠 IgG1 对照一起孵育，以评估菌落的潜在非特异性染色。
用洗涤缓冲液覆盖载玻片 3 分钟并倾斜掉多余的液体，轻轻冲洗载玻片三次。
用六滴ImmPRESS ® -AP 二抗覆盖载玻片并在室温下孵育 30 分钟。
用洗涤缓冲液覆盖载玻片 3 分钟并倾斜掉多余的液体，轻轻冲洗载玻片三次。
准备Vector ® Red AP 底物。将两滴试剂 1、试剂 2 和试剂 3 从 AP 底物试剂盒中加入 5 mL 底物缓冲液（参见配方 11）并充分混合。
用 500 μL 的 AP 底物覆盖幻灯片，并在室温下在黑暗中孵育 20 分钟。
用洗涤缓冲液覆盖载玻片 3 分钟并倾斜掉多余的液体，轻轻冲洗载玻片三次。
添加 500 µL 0.1% 伊文思蓝溶液（参见配方 12）并孵育 5 分钟。
用双蒸水 (ddH 2 O) 小心冲洗载玻片，直到去除过多的蓝色染料。小心，水流可能会冲掉胶原蛋白。在显微镜检查前让载玻片风干。
使用正置光学显微镜对单个菌落进行计数（图 5 ）。
CD41 +巨核细胞集落呈洋红色并形成大小不一的集落。菌落可以根据包含细胞的数量进行分类： i ) 5 – 20 个细胞； ii) 21 – 49 个电池； iii) > 50 个细胞。大群落起源于比小群落更原始的祖先。
伴随的髓细胞集落呈淡蓝色，通常较小。
在极少数情况下，可能会出现包含两种类型细胞的混合菌落。
你怎么知道染色有效？对于使用的每个样本，至少一个孔应该用 IgG 对照抗体而不是抗人-CD41 染色，以允许检测任何非特异性结合。如果用人 CD41 抗体染色的所有其他载玻片均未显示粉红色巨核细胞集落的迹象，但在固定前在载玻片上观察到集落，则表明染色过程出了问题，染色失败。此外，我们承认，由于主要患者材料固有且不可预测的异质性，一些患者样本在培养中根本无法分化或增殖。在这种情况下，在固定前在显微镜下进行分析时，菌落可能显得稀疏或非常小，因此进行染色可能不合理。

图 5. 巨核细胞集落在固定和染色后的例子。 (A) 小集落形成单位-巨核细胞 (CFU-Mk)（3 – 20 个细胞）。 (B) 中型 CFU-Mk（21 – 49 个细胞）。 (C) 大型 CFU-Mk（>50 个细胞）。 (D) 小型 CFU-Mk 附近的大型非 Mk 菌落。 (E) 两个 CFU-Mk 菌落和一个混合 CFU-Mk/非 Mk。 (F) 非 Mk 菌落。比例尺代表 100 µm。彩色箭头表示菌落类型：红色：Mk；蓝色：非Mk；紫色：混合。

液体培养中 HSPC 的巨核细胞定向分化

笔记：
该测定可用于分析治疗药物干扰 MPN 患者来源的 HSPC 巨核细胞分化的能力。
CALR mut或MPL mut MPN 患者来源的 HSPC的扩增和巨核细胞分化不需要 TPO 。根据我们的经验，JAK2 mut HSPC 在完全没有 TPO 的情况下不会生长。 JAK2 V617F样品可能需要低剂量的 TPO (5 – 10 ng/mL)，并且应该与健康对照进行比较以测量 TPO 超敏反应而不是因子独立性。
确保在染色协议的每个步骤中移液精确体积，以避免通过计数珠子对细胞计数产生任何偏差。

以 350 × g离心分选的 CD34 + HSPC 在 4°C 下放置 10 分钟，然后去除上清液以去除分选过程中的所有鞘液。
以 0.75 × 10 5 – 1.0 × 10 5 个细胞/mL 重悬沉淀（参见配方 7）。
对于每个实验条件，将种子细胞一式三份放入 48 孔板（理想情况下为 200 – 500 µL/孔，15 – 20,000 个细胞/孔）。将您感兴趣的化合物或载体对照（例如，DMSO）添加到细胞悬浮液中。
注意：如果无法从样本中获得如此大量的 CD34 +细胞，则可以减少细胞数量和实验装置的体积。本实验在 96 孔板中以最少 1,000 个细胞/重复进行。
用 1 mL 无菌水填充所有周边井，以防止介质过度蒸发。
在 37°C 和 5% CO 2气氛的加湿培养箱中培养细胞。
在第 4、7、10 和 12 天，使用移液器轻轻混合井中的内容物，并将 100 μL 的细胞悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中。
在每个井中加入 100 μL 的新鲜 Mk-diff 介质以补充培养物。
用 1 mL 染色缓冲液洗涤一次（350 × g ，室温，5 分钟）。
FcR阻断剂和 CD41 APC-Cy7 和 CD42b APC 抗体（各1:25 稀释）的 50 µL 染色缓冲液中重悬细胞，并在 4°C下孵育 20分钟。
笔记：
CD41 和 CD42b 抗体可与不同的荧光偶联物一起使用，以匹配流式细胞仪配置或实验中使用的额外荧光染色。
在实验的初始设置中，应准备未染色和单抗体以及 7-AAD 染色细胞以正确补偿荧光团并在流式细胞仪上设置种群门。
用 1 mL 染色缓冲液（350 × g ，4°C，5 分钟）洗涤一次。
在 133 μL 的染色缓冲液中重新悬浮细胞颗粒，混合均匀，然后转移到 5 mL 圆底 FACS 管中。
添加 2.0 µL 的活性染料（例如 7-AAD 或 DAPI）和 15 µL 的计数珠，总体积为 150 µL。使用前正确涡旋瓶子计数珠子。
在 4°C 下孵育 10 分钟并在流式细胞仪上测量（图 6 ）。
计算 CD41 + CD42b -巨核细胞祖细胞或 CD41 + CD42b +成熟巨核细胞计数（见数据分析）。

图 6. 通过流式细胞仪评估巨核细胞分化的门控策略。 (一)计数珠子（高 SSC-A、低 FSC-A）和细胞（不包括细胞碎片）分别设门（顶行，左图）。珠子在两个独立的荧光通道（例如，ECD 和 Krome Orange）中另外设门，以排除初始珠子门中的任何污染细胞（底行，左图）。根据形态学（顶行，中间图）选择细胞并排除细胞双联体（顶行，右图）和死细胞（底行，右图）后，通过对 CD41 + CD42b -和分别为CD41 + CD42b +细胞（底行，中心图）。 (B) 未染色（左图）和单染色（中图和右图）细胞被用作补偿控制，并用于识别荧光阈值以正确设置种群门。

数据分析

液体培养中的巨核细胞定向分化

笔记：我们建议使用 FlowJo 执行流式细胞术数据分析，但也可以使用细胞仪制造商提供的软件。

通过将描述的门控策略（图 6 ）应用于每个样本来子集细胞群。
报告活细胞内 CD41 + CD42b -巨核细胞祖细胞和 CD41 + CD42b +成熟巨核细胞的百分比，作为细胞分化效率的指标。
使用双向方差分析（例如，GraphPad Prism 或类似软件）分析每个时间点实验条件之间细胞分化的差异。
+ CD42b -巨核细胞祖细胞”和“CD41 + CD42b +巨核细胞”门中的事件总数。
使用以下等式计算液体培养每个孔中存在的 CD41 + CD42b -巨核细胞祖细胞和 CD41 + CD42b +巨核细胞的数量：

"megakaryocyte progenitors/well"=(〖"CD41" 〗^"+" " " 〖"CD42b" 〗^"-" " events × beads/15 µL × total volume/well" )/" beads events × volume removed from well"

"mature megakaryocytes/well"=(〖"CD41" 〗^"+" " " 〖"CD42b" 〗^"+" " events × beads/15 µL × total volume/well" )/" beads events × volume removed from well"

+ CD42b -巨核细胞祖细胞”或“CD41 + CD42b +巨核细胞”门中获得的事件乘以每 15 μL 的珠数和细胞培养井中的总体积。珠子浓度因批次而异，并在每个瓶子的标签上注明。将结果除以在“纯珠”门中获得的事件和从细胞培养井中移除的体积（100 μL）。
使用双向 ANOVA 测试每个时间点实验条件之间细胞数量的差异。

食谱

红细胞裂解缓冲液
准备 10 ×储备液。将 9.0 g NH 4 Cl、1.0 g KHCO 3和 37 mg EDTA 四钠溶解在 100 mL ddH 2 O 中。过滤灭菌缓冲液并在 4°C 下储存。该缓冲区可稳定长达一年。使用前用无菌 ddH 2 O稀释 10 ×缓冲液以获得 1 ×浓度。

染色缓冲液 (SB)
PBS
1% 牛血清白蛋白
2 毫米乙二胺四乙酸

冻结媒体
RPMI 1640
20% 胎牛血清
1%青霉素/链霉素
10% 二甲基亚砜

解冻媒体
RPMI 1640 或 IMDM
10% 胎牛血清或 20% 胎牛血清
1%青霉素/链霉素
20 U/mL 脱氧核糖核酸酶

抗体鸡尾酒
注：此配方计算染色1 × 一份样本中的10 7 个PBMC。扩大每个样本的更多细胞，并根据需要扩大样本数量。
混合 5 µL 的每只小鼠抗人荧光偶联抗体：
CD34 异硫氰酸
CD45 V500-C
CD2 PE-Cy5
CD3 PE-Cy5
CD19 PE-Cy5
CD14 PerCP-Cy5.5
CD16 PE-Cy5
CD56 PE-Cy5

巨核细胞 (Mk) 菌落培养基
笔记：
此配方是针对一个样本进行四次重复计算的。根据需要放大尽可能多的样品或实验条件。
为防止重复冻融循环，在第一次解冻时将含脂质的 Megacult TM -C 培养基分装到 15 mL 管中（每管 1.7 mL 培养基），并在 -20°C 下储存等分试样。
中以 8.25 x浓度制备细胞因子和潜在治疗化合物，最终体积为 400 μL。添加浓度为 82.5 ng/mL 的 IL-3 和 IL-6（检测中的最终浓度为 10 ng/mL）。通过将 400 μL 的细胞因子混合物添加到 1.7 mL 的Megacult TM -C 培养基中与脂质混合，最终确定菌落培养基。

巨核细胞分化 (Mk-diff) 培养基
II 或StemPro 34 + 营养补充剂和 2 mM L-谷氨酰胺
20 纳克/毫升超临界流体
10 纳克/毫升 IL-6
10 纳克/毫升 IL-9
富含 0.4% 脂质胆固醇

等渗 NaCl 溶液 (0.15 M)
将 4.38 克 NaCl 溶解在 500 mL 的 ddH 2 O 中。溶液在室温下可稳定数月。

TRIS 缓冲液（0.5 M，pH 7.6）
将 3.03 克 TRIS 溶解在 50 mL 的 ddH 2 O 中。通过在持续旋转下滴加 HCl 6 M 将 pH 值调整至 7.6。缓冲液在室温下可稳定保存 1 个月。

洗涤缓冲液
将九份等渗 NaCl 溶液与一份 TRIS 缓冲液混合。准备在使用当天始终新鲜的洗涤缓冲液。

底物缓冲液
将 909 毫克的 TRIS 溶解在 50 mL 的 ddH 2 O 中。通过在不断旋转的情况下逐滴添加 HCl 6 M，将 pH 值调节至 8.2–8.5。添加 50 µL 吐温 20 并适当混合。缓冲液在室温下可稳定保存 1 个月。

伊文思蓝溶液 (0.1%)
将 50 mg 伊文思蓝溶解在 50 mL ddH 2 O 中。溶液在室温下可稳定数月。

染色盘
× 12 × 3 cm 大小的塑料盘，并剪下两个血清吸管的长度，使其适合盘子。使用胶带将血清移液器粘贴在盘子底部 2 厘米处。载玻片可以放在移液器上进行染色，而过多的缓冲液和染色溶液则被夹在盘子里。

致谢

这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会创意拨款 APP1182564 和 APP2004288、澳大利亚癌症研究基金会发现加速器、白血病和淋巴瘤协会转化研究计划、医院研究基金、澳大利亚罕见病医学研究未来基金的支持、罕见癌症和未满足的需求、奥地利科学基金（资助号 P32783 和 I5021）、奥地利内科学会（Joseph Skoda 奖学金）、奥地利血液学和肿瘤学会（临床研究资助）和 MEFOgraz。该方案改编自以前的研究（ Cortin等人，2009 年）和制造商的建议（Stemcell 技术，Megacult TM -C 测定）。几个数字是使用 BioRender 生成的，并获得了发布权限。我们感谢 Suraiya Onnesha 协助录制视频。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

伦理

格拉茨医科大学血液学部 MPN 患者外周血的采集得到了机构审查委员会的批准（IRB 批准：30-464 前 17/18）或南澳大利亚癌症研究生物库（SACRB、CALHN 批准）的要求：12986）。仅在知情同意的情况下从患者那里采集血液。

参考

Araki, M., Yang, Y., Masubuchi, N., Hironaka, Y., Takei, H., Morishita, S., Mizukami, Y., Kan, S., Shirane, S., Edahiro, Y.,等。 (2016)。 CALR 突变骨髓增生性肿瘤中突变钙网蛋白激活血小板生成素受体。血液127(10)：1307-1316。
Bonnet, D. 和 Dick, JE (1997)。人类急性髓性白血病被组织为起源于原始造血细胞的层次结构。 Nat Med 3(7)：730-737。
Broudy, VC、Lin, NL 和 Kaushansky, K. (1995)。 Thrombopoietin (c-mpl ligand) 与促红细胞生成素、干细胞因子和白细胞介素-11 协同作用，以增强小鼠巨核细胞集落生长并增加体外巨核细胞倍性。血液85(7)：1719-1726。
Chachoua, I., Pecquet, C., El-Khoury, M., Nivarthi, H., Albu, RI, Marty, C., Gryshkova, V., Defour, JP, Vertenoeil, G., Ngo, A.,等。 (2016)。骨髓增生性肿瘤相关钙网蛋白突变体激活血小板生成素受体。血液127(10)：1325-1335。
Chen, J.、Herceg-Harjacek, L.、Groopman, JE 和 Grabarek, J. (1995)。 c-Mpl 配体血小板生成素对体外血小板活化的调节。血液86(11)：4054-4062。
Choi, ES、Nichol, JL、Hokom, MM、Hornkohl, AC 和 Hunt, P. (1995)。从显示原血小板的人巨核细胞体外产生的血小板是有功能的。血液85(2)：402-413。
Corre-Buscail, I.、Pineau, D.、Boissinot, M. 和 Hermouet, S. (2005)。暴露于白细胞介素 11 和白细胞介素 8 的骨髓祖细胞形成不依赖促红细胞生成素的红细胞集落。 Exp Hematol 33(11)：1299-1308。
Cortin, V.、Pineault, N. 和 Garnier, A. (2009)。人脐带血干细胞的离体巨核细胞扩增和血小板生成。方法 Mol Biol 482：109-126。
Debili, N.、Wendling, F.、Katz, A.、Guichard, J.、Breton-Gorius, J.、Hunt, P. 和 Vainchenker, W.（1995 年）。 Mpl-配体或血小板生成素或巨核细胞生长和分化因子对人巨核细胞祖细胞具有直接的增殖和分化活性。血液86(7)：2516-2525。
Elf, S., Abdelfattah, NS, Chen, E., Perales-Paton, J., Rosen, EA, Ko, A., Peisker, F., Florescu, N., Giannini, S., Wolach, O.,等。 (2016)。突变钙网蛋白需要其突变 C 末端和促癌转化的血小板生成素受体。癌症发现6(4)：368-381。
Jamieson, CH、Gotlib, J.、Durocher, JA、Chao, MP、Mariappan, MR、Lay, M.、Jones, C.、Zehnder, JL、Lilleberg, SL 和 Weissman, IL (2006)。 JAK2 V617F 突变发生在真性红细胞增多症的造血干细胞中，并倾向于红细胞分化。 Proc Natl Acad Sci USA 103(16)：6224-6229。
Klampfl, T., Gisslinger, H., Harutyunyan, AS, Nivarthi, H., Rumi, E., Milosevic, JD, Them, NC, Berg, T., Gisslinger, B., Pietra, D., 等。 (2013)。骨髓增生性肿瘤中钙网蛋白的体细胞突变。 N Engl J Med 369(25)：2379-2390。
Kojima, H.、Hamazaki, Y.、Nagata, Y.、Todokoro, K.、Nagasawa, T. 和 Abe, T. (1995)。血小板生成素对体外血小板活化的调节。 Thromb Haemost 74(6)：1541-1545。
Kralovics, R.、Passamonti, F.、Buser, AS、Teo, SS、Tiedt, R.、Passweg, JR、Tichelli, A.、Cazzola, M. 和 Skoda, RC (2005)。 JAK2 在骨髓增生性疾病中的功能获得性突变。 N Engl J Med 352(17)：1779-1790。
Lu, X.、Levine, R.、Tong, W.、Wernig, G.、Pikman, Y.、Zarnegar, S.、Gilliland, DG 和 Lodish, H.（2005 年）。 JAK2V617F 介导的转化需要同型二聚体 I 型细胞因子受体的表达。美国国家科学院院刊102(52)：18962-18967。
Marty, C., Pecquet, C., Nivarthi, H., El-Khoury, M., Chachoua, I., Tulliez, M., Villeval, JL, Raslova, H., Kralovics, R., Constantinescu, SN,等。 (2016)。小鼠中的钙网蛋白突变体诱导 MPL 依赖性血小板增多，并频繁进展为骨髓纤维化。血液127(10)：1317-1324。
Pikman, Y., Lee, BH, Mercher, T., McDowell, E., Ebert, BL, Gozo, M., Cuker, A., Wernig, G., Moore, S., Galinsky, I., 等人. (2006)。 MPLW515L 是骨髓纤维化伴髓样化生的一种新型体细胞激活突变。 PLoS 医学3(7)：e270。
Pronier, E., Cifani, P., Merlinsky, TR, Berman, KB, Somasundara, AVH, Rampal, RK, LaCava, J., Wei, KE, Pastore, F., Maag, JL, 等。 (2018)。靶向骨髓增生性肿瘤中的 CALR 相互作用组。 JCI 洞察力3(22)。
Reinisch, A.、Thomas, D.、Corces, MR、Zhang, X.、Gratzinger, D.、Hong, WJ、Schallmoser, K.、Strunk, D. 和 Majeti, R.（2016 年）。人源化骨髓小骨异种移植模型能够改善健康和白血病人类造血细胞的植入。 Nat Med 22(7)：812-821。
JL 斯皮瓦克 (2017)。骨髓增生性肿瘤。 N Engl J Med 376(22)：2168-2181。
Tefferi, A. 和 Pardanani, A. (2015)。骨髓增生性肿瘤：当代评论。 JAMA Oncol 1(1)：97-105。
Tefferi, A. 和 Pardanani, A.（2019 年）。原发性血小板增多症。 N Engl J Med 381(22)：2135-2144。
Tvorogov, D., Thompson-Peach, CAL, Foßelteder, J., Dottore, M., Stomski, F., Onnesha, SA, Lim, K., Moretti, PAB, Pitson, SM, Ross, DM 等。 (2022)。用新表位导向的单克隆抗体靶向人类 CALR 突变的 MPN 祖细胞。 EMBO 报告23(4)：e52904。
Vannucchi, AM、Lasho, T.、Guglielmelli, P.、Biamonte, F.、Pardanani, A.、Pereira, A.、Finke, C.、Score, J.、Gangat, N. 和 Mannarelli, C.（2013 年） ).原发性骨髓纤维化的突变和预后。白血病27(9)：1861-1869。
Woll, PS, Kjällquist, U., Chowdhury, O., Doolittle, H., Wedge, DC, Thongjuea, S., Erlandsson, R., Ngara, M., Anderson, K., Deng, Q.,等人. (2014)。骨髓增生异常综合征由稀有且独特的人类癌症干细胞在体内传播。癌细胞25(6)：794-808。
Woods, B., Chen, W., Chiu, S., Marinaccio, C., Fu, C., Gu, L., Bulic, M., Yang, Q., Zouak, A., Jia, S.,等。（2019）。巨核细胞中 JAK/STAT 信号的激活在体内维持骨髓增殖。临床癌症研究中心。