设备

树莓派相关设备
1. Raspberry Pi（型号 3 或更新型号）
2. 微型 SD 卡（应具有 6 GB 或更多存储空间）
3. 微型 USB 电源线
4. 相机模块：最低规格（即镜头分辨率、像素、帧率等）将根据镜头与样品之间的距离、样品尺寸和提供的外部光源而有所不同。 Arducam M12 镜头（型号 B0031；5 MP 2,592 × 1,944 分辨率，4 mm 焦距）用于从盆上方约 75 厘米处对拟南芥幼苗进行成像。
5. 相机线
注意：如果使用 Raspberry Pi 零 W，您将需要更小的电缆连接以插入 Raspberry Pi。
6. 带HDMI端口的显示器
7. HDMI线
注意：如果使用 Raspberry Pi 零 W，您将需要一根迷你 HDMI 转 HDMI 电缆。
8. 键盘和鼠标
9. 安装相关设备
粘合剂或
弹力绳或
安装支架（参见 Tovar 等人，2018 年）
10. 选修的
Raspberry Pi 和相机模块的外壳

植物生长相关设备
1. 花盆：合适的尺寸取决于每个花盆中种植的植物种类和数量。如果在一个盆中种植两株拟南芥幼苗，建议使用至少 40 cm 2的方形盆。
2. 土壤：任何园艺或盆栽土壤/混合物都是合适的。 PRO-MIX HP 菌根盆栽土（Premier Tech Horticulture, Quakertown, PA）适用于多种物种。可以根据特定物种的要求添加其他修正案。
3. 刻度：对于在小盆中生长的小型植物，例如拟南芥，使用对 0.1 g 敏感的刻度。对 1.0 g 敏感的刻度适用于较大的植物和较大的盆。
4. 塑料盖
5. 烤箱：它应该能够达到 45°C。
6. 粘合剂：其强度应足以支撑 Raspberry Pi、镜头和电源线（约 20 克）的重量。

程序

A. 初始树莓派配置

注意：此协议要求 Raspberry Pi 连接到互联网。建议使用所有具有内置 Wi-Fi 功能的第三代或更新型号（不包括 Raspberry Pi Zero 和 Pico）。
无论使用哪种型号的 Raspberry Pi 都需要安装有 Raspberry Pi OS (Raspbian) 的 Micro SD 卡。可以购买预装 Raspbian 的微型 SD 卡，也可以安装最新版本的 Raspbian from https://www.raspberrypi.org/downloads/raspbian/ 。确保您使用至少有 6 GB 存储空间的 Micro SD 卡，以便在将图像传输到云存储之前在 Micro SD 上进行临时存储。
1. 将安装了 Raspbian 的 Micro SD 卡插入树莓派。将显示器、键盘和鼠标连接到 Raspberry Pi，然后插入电源线。
请注意，一旦将 Micro SD 卡插入 Pi，本协议中概述的所有脚本都将写入并保存到 Micro SD 卡本身。除了下面概述的步骤之外，不需要执行该协议的其他步骤。
2. 如果是第一次启动您的 Pi，欢迎使用 Raspberry Pi应用程序将弹出并指导您完成初始配置，包括设置用户名和密码、时区以及连接到 Wi-Fi。
https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-getting-started/1找到分步说明。
3. 初始设置完成后，单击桌面左上角的树莓图标，然后导航至“首选项”>“树莓派配置”。这也可以通过键入“ sudo raspi -config ”在终端窗口中，可以通过单击位于桌面顶部的工具栏上的黑色监视器图标来打开。
4. 在接口选项卡中，将摄像头和安全外壳 (SSH) 设置为“已启用”。这些配置将允许您拍摄图像并与 Pi 通信，而无需将其连接到监视器。
5. 为了通过 SSH 与 Pi 远程通信，您需要先获取 Pi 的 IP 地址。
a. 在终端窗口中，键入“ hostname -I. ”
b. 还要记下 MAC 地址，以防您的 IP 地址设置为更改并且您想使用网络扫描仪确认给定设备是您的 [即Fing ( https://www.fing.com/ )，适用于 Android 和iOS]。
在终端输入 window“ ifconfig ” 。在输出的文本中，MAC 地址是紧跟在“ether”之后的 12 位十六进制数。
6. 计算机（运行 Linux、Mac OS 或 Windows 10 或更高版本）的终端通过 SSH 连接到您的 Pi 。window
输入“ ssh pi@ ”，将“IP”替换为您 Pi 的 IP 地址。
7. 或者，您可以使用免费的 SSH 客户端，例如Termius ( https://www.termius.com/ )，它与 Linux、Mac OS 和 Windows 兼容 operating systems。

B. 配置远程数据传输

注意：在配置相机之前，首先配置如何将图像从 Raspberry Pi 传输到基于云的服务器或本地计算机会很有帮助，在这些地方比在 Pi 本身上更容易分析图像。虽然远程数据传输有多种方法，但该协议描述了rclone ( https://rclone.org/ ) 的配置，rclone 是一种开源软件，旨在管理常见的基于云的平台上的内容。
1. 通过单击屏幕顶部的终端图标（如果使用外部显示器）或键入 Ctrl + Alt + T 打开终端窗口。
2. 在打开的终端窗口中运行以下命令以下载并安装最新的稳定版本的rclone ：
wget https://downloads.rclone.org/rclone-current-linux-arm.zip
3. 安装成功后，运行如下配置命令：
克隆配置
4. 通过键入“n”创建一个新的远程连接，then 然后按ingEnter。
5. 输入新远程连接的名称，例如“ RPi_Drive ”。
6. 您现在将看到要连接的各种后端存储系统的列表。选择特定存储系统（例如 Google Drive）后的后续步骤将根据所选存储系统的不同而有很大差异。请参阅https://rclone.org/overview/以了解支持的各种存储系统以及有关如何配置每个存储系统的相应文档。

C. 安装树莓派和摄像头

注意：鉴于将进行实验的位置的特定照明和间距要求，建议首先为干旱实验找到合适的位置，然后才在该空间配置相机。
可以安装相机的植物上方或附近的可用空间可能因生长室或植物种类而异。因此，建议使用具有模块化对焦功能的 Raspberry Pi 兼容镜头。 Arducam ( https://www.arducam.com/ )开发了许多与 Raspberry Pi 兼容的选项，可生成出版质量的图像。此外，请务必选择一个可以不间断使用电源插座的位置，因为在实验期间，Raspberry Pi 需要持续供电。如果计划在高相对湿度（>70% 相对湿度； Comizzoli等人，1986）下进行实验，we recommend using 风扇、保护套或干燥剂，以避开damaging Raspberry Pi 和相机组件。低于 70% 的相对湿度值（本协议中使用 40%）不应导致 Raspberry Pi 和相机组件出现任何技术问题。
1. 找到合适的位置identified后，请确保您的 Raspberry Pi 已关闭，before将ing相机模块连接到 Raspberry Pi。
笔记：
a. 将相机电缆插入 Raspberry Pi 时要非常小心，因为建立和维持连接所需的塑料夹很脆弱，很容易弯曲或破裂。
b. Raspberry Pi Zero W 的相机模块端口较小，因此需要相应较小的带状电缆将相机连接到 Pi。
2. Raspberry Pi 和摄像头模块可以通过多种方式物理安装或悬挂在实验生长空间上方或附近。无论使用何种方法，相机都应该不受物理干扰（包括振动），并且离花盆足够远，以便用户在整个实验过程中能够舒适地拿起花盆并称重。参见 Tovar 等人。 (2018) 了解更多信息。

图 1. 在生长室内安装 Raspberry Pi 和摄像头模块的方法。 ( A) Pi 和相机用粘合剂固定在生长柜的顶部。 (B) Pi 和相机悬挂在弹力绳上，以尽量减少生长柜内的振动。在这两张图片中，相机模块和 Pi 都被包裹在保护壳中。

D. 配置图像捕获

1. 通过 SSH 连接到您的 Pi 时，在 Pi 的桌面上为您的图像创建一个文件夹。
从终端 window输入“ mkdir /home/pi/Desktop/Images”。
2. 可以从命令行（在终端窗口中）或通过 Python 脚本控制相机模块。由于功能丰富且易于配置，该协议建议使用预安装的 Python picamera库。
a. 在终端窗口中，输入“ nano [文件名]。 py ”用您选择的文件名替换[文件名]。
b. 以下脚本，写在打开的[文件名]中。 py文件，包括用于捕获图像并将当前时间保存到您选择的目的地的命令。为您的图像添加时间戳将提供有价值的元数据，以将图像与一天中的时间和干旱持续时间相关联。可预测的文件命名方案还允许您检查是否所有图像都按需要捕获和传输。
从picamera导入PiCamera
从时间导入睡眠
相机 = PiCamera ( )

导入日期时间
时间 =日期时间.日期时间.现在( )。 strftime ("%Y-%m-%d-%H:%M")

#调整图像分辨率
相机分辨率= (1950, 1900)

camera.start_preview ( )
睡觉（ 5）
camera.capture (r'/home/pi/Desktop/Images/image-' + time + '.jpg')
相机.stop _preview ()
c. 要保存并退出，请按 Ctrl + X。然后，当系统提示您是否要保存更改时，请按“Y”。或者，您可以先按 Ctrl + O，然后clicking 按 Enter，然后pressing 按 Ctrl + X来保存更改。
3. 将一些将用于生长实验的花盆放入将要种植植物的区域，,并通过键入“ python [文件名]”捕获图像。皮”。
4. 可以通过将图像远程发送到您指定的和先前配置的存储系统来查看图像。虽然也可以通过将 Pi 连接到监视器来查看它们，但远程传输系统可以更快地定位相机。
5. cd /home/pi/Desktop”返回到桌面。
6. 在 Pi 的桌面上创建一个新文件，这将触发远程图像传输。
纳米同步.sh
7. 在新创建的“sync.sh”文件中，调用rclone同步功能将图像从图像文件夹发送到在线存储解决方案中的文件夹。以下代码以名为“ Raspberry_Pi_images ”的 Google Drive 文件夹为例：
a. rclone同步 -v /home/pi/Desktop/Images gdrive:Rapsberry _Pi_images
b. Enter，然后pressing 按 Ctrl + X保存更改。clicking
8. 从Desktop 运行脚本以传输图像
./同步.sh
9. 查看捕获的图像后，您可以根据实验需要手动调整相机镜头的焦点并添加对图像捕获脚本的修改（分辨率、角度、帧速率、颜色校正等）和工作环境的物理限制。
注意：科学出版物中经常建议将每英寸 300 像素 ( ppi ) 作为高质量彩色图像的最低分辨率。 PPI 基于每个维度的图像分辨率（按宽度和高度的像素）和图像大小，因此较大的图像需要更高的分辨率才能维持给定的 PPI。例如， Arducam M12 镜头（型号 B0031）的最大分辨率为 2,592 × 1,944 像素。使用此分辨率，对角线长度小于 27.4 厘米的任何图像的 PPI 将大于或等于 300 ppi 。大多数学术期刊的单栏宽度为 8.6 厘米，这意味着即使分辨率比Arducam M12（型号 B0031）小得多，也足以确保出版质量的图像。
10. 通过再次输入“nano [文件名]”，可以将对图像外观的修改添加到 Python 脚本中。 py ”在终端中window ，并entering 根据需要添加其他代码行。可以在https://projects.raspberrypi.org/en/projects/getting-started-with-picamera/找到一些有用的图像修改。

图 2. 在生长柜内设置相机位置，并在下方放置一个代表性的花盆以进行图像优化

请注意，图像聚焦和优化应在空盆中放置一个装满土壤的盆来完成，以确保镜头和土壤之间的正确距离，以优化图像聚焦。 As will be described in the next section, the two-pot system allows rotating pots for reducing the effect of micro environmental variations while ensuring that the pot positions stay the same for imaging.

11. 如果对图像的外观感到满意，您现在可以安排自动图像捕获并上传到云端。
12. 使用作业调度程序 crontab ( https://crontab.guru/ )，首先打开作业的编辑表：
crontab -e
13. 为自动图像capturing 和将图像上传到云端编写脚本（“ cron作业”）。您可以在https://crontab.guru/上测试如何编写您想要的时间表。下面提供了这两项工作的示例。
a. #每 15 分钟运行一次python 图像捕获脚本
15 * * * * python /home/pi/Desktop/Take_photo_with_timestamp.py
b. #每 2 小时在整点 30 分运行一次 sync.sh 程序
30 0-23/2 * * * /home/pi/Desktop/sync.sh
c. Enter，然后pressing 按 Ctrl + X保存更改。clicking
d. 这些设置可以通过输入“ crontab -I”查看，也可以通过输入“ crontab -e ”再次修改。

E. Determining 土壤特性

1. 称量 8-10个空罐，以确定空罐的平均重量。按重量用固定量的新鲜土壤填充每个花盆。要确定新鲜土壤中的平均含水量，按重量，将 8-10 个土壤样品放在至少设置为 45 °C 的烘箱中干燥。每天测量盆和土壤的重量，直到样品重量没有变化（大约2-3天）。记录最终盆和干土重量。
干土重量（DSW）= [（盆+干土）-空盆]
DSW % = DSW /[ （盆+新鲜土壤）-空盆]。
2. 将上述装有干土的盆慢慢加水。一旦水开始从底部滴落，就停止加水。在花盆上盖上盖子以减少蒸发。当底部滴水停止时，盆已达到盆容量（PC；100% SWC）。称量每个罐以确定 PC 的重量。
PC 处的水重 = [(盆 + PC 处的土壤) – 空盆 – DSW]
土壤罐容量（SPC；g 水/g 干土） = （PC 总重量 – DSW – 罐）/(DSW)

F. 架盆进行a 干旱试验

虽然抗旱性的比较仅在同一盆中生长的幼苗之间进行，但所有幼苗都应保持一致，以减少重复之间的差异。
1. 使用胶带或其他粘合剂，将与实验盆相同数量的空盆粘贴到将种植植物和捕获图像的架子或桌子上。
a. 将这些空盆放在相机可以完全捕捉到的区域。可能需要对相机和盆放置进行一些修改，以优化相机可以捕获的样本数量。

图 3。将空盆安排到成像空间中。 ( A) 固定的花盆均匀分布并填满相机的整个可视空间。 (B) 一个装满土壤的实验盆坐在一个固定的空盆中的代表性图像。

2. 按重量用等量的新鲜土壤填充花盆。new
3. 植物在每个盆的指定位置（即顶部/底部、右/左）放置种子，以消除图像捕获期间微环境中的任何潜在差异。
4. 应种植种子，使每个盆包含一株野生型（对照）幼苗和一株来自至少一种突变体的幼苗。

图 4. 均匀间隔种植种子，使每个盆包含一株野生型和至少一株突变型幼苗。花盆还包含数字和箭头，分别表示样品编号和突变幼苗。图像是在花盆上方约 75 厘米（40 厘米2 ）处使用5 兆像素拍摄的 Arducam M12 镜头（型号 B0031），分辨率为 1,950 × 1,900（宽×高）。所用生长柜空间的大概尺寸：63.5 cm × 63.5 cm × 75 cm (L × W × H)。

5. Place seeded pots into the pre-arranged empty pots.
6. 每天称重并向盆中加水，以将 SWC 保持在指定的充分浇水状态（即 70% SWC）。
充分浇水重量（70%SWC）=[（鲜土重量× DSW% × SPC × 0.7）+（鲜土重量× DSW%）+空盆]
Note: Weigh pots when you know images are not being captured to ensure an uninterrupted progression of images throughout the experiment.

7. 当幼苗达到预定的年龄、大小或发育阶段时， water one last time up to the well-watered state, and then stop watering, as an example of a drought experiment.
Note: This is only one type of drought experiment. Another type of drought experiment is to maintain soil water content at specific levels. Also, this protocol can be used for experiments other than drought treatment, such as exposure to high or low temperatures, salinity stress, etc.
8. 如果尚未捕获图像，请如上所述启动自动图像捕获。
9. 定期（即每天）从空盆中轻轻提起并取出实验盆，称重以确定 SWC。将每个实验罐放回同一个空罐中。
10. 如果有兴趣评估从干旱中恢复的情况，请在预定的时间、年龄或压力程度下使花盆饱和，然后将它们放回同一个空花盆中继续成像。

G. 将图像组合成延时视频

将图像组合成视频文件格式并不是评估整个实验过程中植物生长变化的必要条件。根据所需的分析，检查单个图像可能比多个图像的视频更有帮助。然而，以视频格式查看整个实验的进展可能有助于用户更轻松地识别植物生长的总体趋势。因此，下面提供了用于从单个图像创建延时视频的示例协议。虽然许多软件程序可用于此目的，但以下示例使用免费视频编辑软件 Davinci Resolve ( https://www.blackmagicdesign.com/products/davinciresolve/ )。
1. 通过单击“文件”>“导入”>“媒体”导入图像，然后选择包含图像的文件夹。
2. 确保它们按日期和时间排列，以确保按时间顺序排列。
3. 选择所有图像后，右键单击并选择“使用所选剪辑创建新时间轴……”
4. 图像现在将从左到右排列在窗口底部。无需任何额外修改，现在可以使用窗口中间的“播放”按钮播放视频进程。
5. 要修改视频的长度，请从窗口底部的时间轴中选择所有图像。右键单击并选择“更改剪辑持续时间”。可以通过更改“时间”或“帧”选项卡中的值来修改视频的长度，甚至是基于所选帧的部分视频。
6. 如果对视频的持续时间感到满意，请单击窗口最底部的“传送”选项卡。在这里，用户可以选择要生成的视频的文件类型、分辨率、帧速率和质量，以及更多高级功能。
7. 选择所有设置并设置文件的名称和目标后，单击“添加到渲染队列”。窗口右上角将出现一个新作业side 。单击“全部渲染”。
8. 其他视频编辑功能可在https://www.blackmagicdesign.com/products/davinciresolve/training找到。

数据分析

捕获的图像为所有下游分析提供了基础。图像或延时视频可单独用于定性评估基因型的相对抗旱性，就像以前所做的那样（Ginzburg 等人，2022）。量化植物生长和压力的具体指标会因植物种类、发育阶段、压力程度和感兴趣的生物学问题而异。无需其他软件即可对植物生长和胁迫症状进行基本分析，因为仅凭图像即可对胁迫症状进行视觉评分（Diaz 等人，2006 年；Sarkar 等人，2021 年）。图像也可以上传到图像分析软件，例如 ImageJ（Schneider 等人，2012 年）或PlantCV （ Fahlgren等人，2015 年），以进行其他分析，例如量化植物面积、受压/diseased 组织与绿色的相对面积组织等。利用捕获图像的时间戳还可以轻松比较关键的发育阶段转换，例如开花时间。
该协议还允许用户在整个实验过程中对植物进行额外的非破坏性测量，以补充图像捕获。例如，使用该协议（Ginzburg 等人，2022 年）对干旱幼苗生长和成像测量叶绿素荧光，以比较突变体和野生型幼苗之间的耐旱性。
每日 SWC 水平可以与选定的植物生长和胁迫发生指标相关联，以了解土壤水分有效性与胁迫症状之间的关系。如果评估多个突变系的抗逆性，SWC 水平也可用于确定每个基因型的相对需水量，如 Ginzburg 等人所示。 (2022)。

致谢

我们感谢 A. Malkovskiy在G. Materassi -Shultz 的成像方面提供的有用建议，,以支持植物生长设施, and the Rhee lab for helpful discussions。这项工作是在Muwekma Ohlone 部落的祖传土地上完成的，这片土地曾经并将继续对 Ohlone 人非常重要。
资金：
这项工作得到了卡内基科学基金会和国家科学基金会 (IOS-1546838, IOS-1026003) 和美国能源部、科学办公室、生物与环境研究办公室、基因组科学计划资助的部分支持没有。 DE-SC0018277、DE-SC0008769、DE-SC0020366 和 DE-SC0021286。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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