材料和试剂
1. 15 mL离心管（BIOFIL，目录号：CFT013150-BD）
2. 50 mL离心管（BIOFIL，目录号：CFT010500）
3. 金（III）氯化物水合物（HAuCl 4 ·4H 2 O）（Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd，目录号：10010711）
4. 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（阿拉丁，目录号：H108983-500g）
5. 硼氢化钠（ NaBH 4 ）（阿拉丁，目录号：S108355-25g）
6. 油酸钠（ NaOL ）（Aladdin，目录号：S104196-250g）
7. 硝酸银（AgNO 3 ）（阿拉丁，目录号：S116268）
8. 氯化氢（HCl）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：258148）
9. 抗坏血酸（AA）（阿拉丁，目录号：50-81-7）
10. 4-硝基苯硫醇（4-NBT）（阿拉丁，目录号：N298977）
11. 三甲基氯化铵（CTAC）（阿拉丁，目录号：H105309 ）
12. mPEG 5k -SH（键凯科技，目录号：729108-1G ）
13. 吐温 20（阿拉丁，目录号：T104863-100ml）
14. 柠檬酸钠二水合物（阿拉丁，目录号： S 43490 1）
15. 氯化铜（ CuCl 2 ）（阿拉丁，目录号：C106774-50g）
16. 单链 DNA（ssDNA，序列：5'-TAG GTG TAG TGA GGA AAA AAA AAA A-C6-SH-3′, 200 μL , 10 μM ) (中国上海生工生物科技有限公司, 个性化定制)
17. 互补单链 DNA ( cssDNA , 序列: 5'-TCC TCA CTA CAC CTA AAA AAA AAA A-C6-SH-3′, 380 μL , 10 μM ) (中国上海生工生物科技有限公司, 个性化定制)
18. 游标卡尺（Shanghai Shenhan Measures，目录号： 43528447520 )
19. 移液器（ Biosharp ，目录号：BS-XG-0.3L）
20. 毛细管细胞（MALVERN，目录号：DTS1070）
21. PBS（ Sangon Biotech，目录号： B640435)
22. Balb /c裸鼠（上海斯莱克实验动物有限公司（中国上海））

设备

1. 离心机（ Thermo Fisher，型号：Heraeus Fresco 21）
2. -80°C 冰箱（ Thermo Fisher，型号：ORMA 88000 系列）
3. 净水系统（Millipore，型号：Direct-Q5）
4. 热板磁力搅拌器（IKA，型号：C-MAG HS7 digital）
5. 电子显微镜（FEI，型号：FEI-TEM）
6. 马尔文激光粒度分析仪（Malvern 3000， Zetasizer Nano ZS）
7. 电感耦合等离子体质谱法，ICP-MS（VARIAN，型号：710-ES）
8. 雷尼绍inVia共焦拉曼光谱仪（Renishaw，型号： inVia ）
9. 超速离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5804R）
10. 超声波细胞破碎系统（SONICS，型号：S-450D）
11. 快速混合器（ Kylin -Bell，型号：Vortex-5）
12. 超声波清洗机（ Scientz ，型号： SB-5200DTS)
13. 红外热像仪（ FLIR，型号：斧5)
14. 超速离心机（Optima，型号： XPN-80 )

程序

A. DNA组装的GRS-DNA- CuS的制备纳米蒲公英

金纳米棒 (GRs) 的合成
1. 将5 mL 的 HAuCl 4 ·4H 2 O (0.2 mg/mL)与5 mL 的 CTAB (0.2 M)混合。
2. 在 1 mL 冰冷水中稀释 20 μL新鲜 NaBH 4 (0.6 M)，并在 1793 × g剧烈搅拌下将其添加到混合物中 1 分钟。然后，获得种子溶液CTAB 稳定的金核。
3. 将0.9 g CTAB和0.15 g NaOL 添加到25 mL 双蒸水 (ddH 2 O)中，在 50°C 下磁力搅拌 1 小时。
注意：ddH 2 O需提前升温至50℃。
4. 将上一步的溶液冷却至 30°C，并加入2.4 mL AgNO 3 (4 mM) 和25 mL HAuCl 4 ·4H 2 O (0.4 mg/mL)。让它们在 30°C 下静置 10 分钟，然后在 747 × g下再次搅拌 15 分钟。
注意：在水浴中加入冰块以冷却热水。通过温度计实时监测水浴温度，使反应温度保持在30℃。
5. 添加0.24 mL HCl （37 重量百分比）并在 747 × g下再搅拌 15 分钟。然后，加入125 μL AA (0.064 M) 并搅拌 1 分钟以获得生长溶液。
6. 让获得的生长溶液在 30°C 下放置 12 小时以进行 GR 生长。 9,710 ×g离心20分钟收集产物，用40mL ddH 2 O洗涤，再溶解于50mL ddH 2 O中，得到金纳米棒(GRs)。
注：转速应为9,710 × g 为了完全收集遗传资源。
7. 最后，将 5 mL 的 GRs 溶液与 5 mL 的 CTAC (0.2 M) 混合，并以 11,203 x g离心10 分钟。用10 mL CTAC （0.1 M）清洗沉淀物三次，然后将其重新分散在10 mL CTAC溶液（0.1 M）中，以完全取代 CTAB 。获得了 CTAC 封顶的 GR。
注：较长的超声处理时间和较高的溶解温度都有助于CTAC和CTAB完全溶解在ddH 2 O中，溶解温度最好为45℃。最佳超声处理时间为 30 分钟。此外，在用CTAC置换CTAB的过程中，由于样品容易吸附在管表面，因此在进行下一步之前应先通过超声处理分散样品。

制备拉曼分子修饰的 GR
1. 将 10 mL 的 CTAC 封顶 GR 与 500 μL的拉曼分子 4-NBT（1 mM）混合，在超声波清洁器的冰水浴中进行 15 分钟的剧烈超声处理。
注意：拉曼分子4-NBT要预先溶解在DMSO中。 4-NBT 的浓度为 1 mM。
2. 将10 mL CTAC (0.1 M) 添加到溶液中，并以 8,963 × g离心10 分钟。用10 mL 的 CTAC 溶液（0.05 M）清洗沉淀物两次，并将沉淀物重新分散在10 mL 的 CTAC 溶液（0.1M）中。沉淀物是拉曼分子修饰的 GR 。

改良种子介导生长法合成GRS
1. 依次将2.5 mL 的 HAuCl 4 ·4H 2 O (2 mg/mL) 和2.5 mL 的 AA (0.04 M)添加到50 mL 的 CTAC (0.1 M) 中。
2. 在连续超声处理下，将混合物逐滴添加到 5 mL 的拉曼分子改性 GR 溶液中。
3. 混合液室温静置24h，4481 ×g离心10min，再分散于50mL ddH 2 O中，即得GRS 。

单链 DNA (ssDNA) 修饰的 GRS (GRS-ssDNA) 的合成
1. × g离心获得的 GRS (20 mL) 10 分钟，用 ddH 2 O清洗两次。然后，将200 μL的 mPEG 5k -SH （10 μM ）添加到 GRS 溶液中。
2. 随后，将20 mL Tween 20 （0.01 重量百分比）添加到 PEG 修饰的 GRS 溶液中，超声处理 30 s，并通过涡流严重混合。重复此步骤四次。
注意：包括添加 Tween 20、超声处理和涡流严重混合在内的过程应重复四次，以便从 PEG 修饰的 GRS 表面完全去除 CTAC。 PEG 修饰的 GRS 的 Zeta 电位应从正变为负。
3. 添加 200 μL单链 DNA（ssDNA，序列：5'-TAG GTG TAG TGA GGA AAA AAA AAA A-C6-SH-3', 10 μM ) 和2 mL 柠檬酸钠二水合物(1 M) 到获得的 GRS 溶液中，然后涡旋混合 30 s。让溶液在室温下静置 2 小时。
注：将 2.894 g柠檬酸钠二水合物溶解于 10 mL ddH 2 O 中，得到柠檬酸盐溶液 (1 M)。
4. 将 ssDNA 修饰的 GRS 离心，用 ddH 2 O 洗涤 3 次，然后重新溶解在 20 mL 的 1 × PBS 中。获得GRS-ssDNA 。

超小型CuS PA的合成
1. 将 13.45 毫克的 CuCl 2和 20 毫克的柠檬酸钠二水合物添加到 100 mL 的 ddH 2 O中。
2. 8.68 毫克的 Na 2 S 添加到上一步的混合物中。五分钟后，将反应液加热至90 ℃ ，搅拌15分钟。
3. 保持柠檬酸盐修饰 CuS纳米粒子在冰冷水中浸泡 30 分钟，并在 4 ℃下储存不到一周。
注意：应在使用前准备超小CuS纳米粒子。 CuS在 4 ℃下的储存时间应不超过 1 周，因为CuS容易降解。

互补单链 DNA ( cssDNA ) 修饰的CuS ( CuS-cssDNA )的合成
1. 添加 380 μL互补单链 DNA ( cssDNA , 5'-TCC TCA CTA CAC CTA AAA AAA AAA A-C6-SH-3', 10 μM ) 至50 mL CuS溶液并在室温在孵化器振荡器中以 60 rpm 的速度孵育 12 小时。
2. 将混合物以 232,580 × g离心30 分钟，然后重新分散在 50 mL 的 1× PBS 中。获得CuS-cssDNA 。

GRS-DNA- CuS的合成纳米蒲公英
1. 将 20 mL GRS-ssDNA 与10 mL CuS-cssDNA混合，37 ℃孵育12 h，生成 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英。
2. 收集 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英在 50 mL 离心管中以8、963 × g离心10 分钟，然后重新溶解在20 mL 的 1× PBS中。
3. 将200 μL的 mPEG 5k -SH (10 μM ) 添加到 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英以提高其稳定性。
4. 用20 mL 的1× PBS清洗 PEG 修饰的 GRS-DNA- CuS ，并重新溶解在20 mL 的 1× PBS中。 GRS-DNA- CuS制备全过程纳米蒲公英如图 2 所示。

CuS制备全过程流程图纳米蒲公英

B. DNA 组装的 GRS-DNA- CuS的表征纳米蒲公英

表征形态
1. 将获得的 GRS-DNA- CuS溶液的 10 μL 滴到涂有 formvar 的网格上。
2. 在室温下干燥样品 30 分钟。
3. 通过透射电子显微镜 (TEM)监测 GRS-DNA- CuS的形态。

测量粒径
1. 将获得的 GRS-DNA- CuS的5 μL稀释到 1.5 mL 的 ddH 2 O中。
2. 将样品加入比色杯中，不要有任何气泡。
3. 将比色皿插入粒子分析仪室。
4. 使用 Malvern 激光粒度分析仪检测 GRS-DNA- CuS的大小。

测量 zeta 电位
1. 稀释 5 μL GRS-DNA- CuS 将纳米蒲公英放入 1.5 mL 的 ddH 2 O中。
2. 将样品添加到毛细管细胞中。
3. 用塑料盖盖住毛细管池。
4. 将毛细管细胞放入 zeta 电位分析仪的腔室中。
5. 测量GRS-DNA- CuS的zeta电位值 (-32.2 mV) 使用Malvern 激光粒度分析仪。

测量 GRS-DNA- CuS的拉曼信号强度纳米蒲公英
1. 稀释 5 μL GRS-DNA- CuS 150 μL ddH 2 O中的纳米蒲公英。
2. 20 μL稀释的 GRS-DNA- CuS溶液滴到箔包裹的幻灯片上。
3. 将载玻片放入仪器中，通过雷尼绍inVia拉曼显微镜在StreamLine模式下（5倍物镜，62.6 mW ）在830 nm激光激发下曝光时间5 s测量GRS-DNA- CuS的拉曼信号强度，如图3所示。

CuS的拉曼信号强度测量过程纳米蒲公英

测量GRS-DNA- CuS的光热效应纳米蒲公英和CuS PA
1. 辐照 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英和CuS纳米粒子 (NPs) 通过 808 nm 激光 (2.8 W/cm 2 ) 4 分钟。
2. 在激光照射期间，使用 FLIR Ax5 相机以 30 s 的间隔记录每组的温度变化。

测量 GRS-DNA- CuS的积累肿瘤组织中的纳米蒲公英
1. 静脉注射 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英以 50 μmol /kg 体重的剂量进入 A549 荷瘤Balb /c 雄性裸鼠（约 20 g，6 周龄）。
注：A549 细胞（5 × 10 6 个细胞/小鼠，100 μL PBS 溶液）皮下注射到Balb /c 裸鼠背部，并使其生长至 125 mm 3的肿瘤大小，用于成像和治疗研究。
2. 收集 GRS-DNA- CuS的拉曼信号注射后0、1、2、4、8、12和 24 小时肿瘤组织中的纳米蒲公英，由 Renishaw inVia拉曼显微镜在StreamLine模式（5 倍物镜，62.6 mW ）下曝光时间为 5 秒，曝光时间为 830 纳米激光激发。

测量GRS-DNA- CuS的肿瘤内渗透纳米蒲公英
1. 静脉注射 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英（50 μmol /kg 体重）进入 A549 荷瘤Balb /c 雄性裸鼠（约 20 g，6 周龄）。
2. 在注射后 12 小时，在 808 nm 激光下以 2.8 W/cm 2照射Balb /c 裸鼠上的 A549 肿瘤2 分钟。
3. 在激光照射后的 0、0.5、6 和 12 小时，通过光声成像系统对肿瘤组织的光声信号进行成像
注：对照组小鼠肿瘤瘤内感染RS-DNA- CuS 没有近红外激光照射的纳米蒲公英。

评估GRS-DNA- CuS的光热治疗效率纳米蒲公英
1. 静脉注射 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英（50 μmol /kg 体重）进入 A549 荷瘤Balb /c 雄性裸鼠（约 20 g，6 周龄）。
2. 在注射 GRS-DNA- CuS后 12 小时照射肿瘤第一个 808 nm NIR 激光的纳米蒲公英。
注意：第一次 808 nm NIR 激光照射用于 GRS-DNA- CuS的解离在肿瘤处积累的纳米蒲公英。
3. 六个小时后，第二个 808 nm NIR 激光再次照射肿瘤。
注意：第二次 808 nm NIR 激光照射用于肿瘤光热治疗。
4. 用游标卡尺测量肿瘤大小，按以下公式计算：V=L×W 2 /2，其中L和W分别为最长点和最宽处的肿瘤大小。

数据分析

1. CuS的理化特性（如形态、大小、zeta 电位、拉曼信号和光热转换特性等）纳米蒲公英。图 4 中的 TEM 图像显示，大量的CuS PA 清晰地包覆在 GRS 表面，表明 GRS-DNA- CuS已成功制备。图 5 中的扫描透射电子显微镜-能量色散 X 射线光谱法 (STEM- EDX)元素图像也表明 GRS-DNA- CuS的成功形成。图6中GRS-DNA- CuS的大小约为135nm。GRS-DNA- CuS在1331cm -1处表现出最高的拉曼信号强度，这有利于通过拉曼成像技术检测其瘤内分布。 GRS-DNA- CuS的光热转换效率约为47.44%，光热性能较好。同时，GRS-DNA- CuS溶液在808 nm近红外光照射下，激光功率密度为2.8 W/cm 2 ，1分钟内从室温迅速升温至46.8 ℃ ，表明产生的热量足以诱导GRS-DNA- CuS中 DNA 氢键的爆炸性断裂 (Tm = 42.82 °C ) 纳米蒲公英。

图 4. GRS-DNA- CuS的代表性 TEM 图像纳米蒲公英

图 5. GRS-DNA- CuS的 STEM-EDX 元素映射图像纳米蒲公英

图 6. GRS-DNA- CuS的大小分布纳米蒲公英

2. 检测 DNA 组装的 GRS-DNA- CuS的解离 NIR 光照射后的纳米蒲公英。图 7 中的 TEM 图像显示，在激光功率密度为 2.8 W/cm 2的 808 nm NIR 激光照射后，1 分钟内大尺寸 GRS-DNA- CuS完全解离为 GRS-ssDNA 和超小型CuS-cssDNA PA 。

CuS解离前后形态变化检测TEM图

3. 监测 DNA 组装的 GRS-DNA- CuS的肿瘤积累过程通过拉曼成像技术获得的纳米蒲公英（如图 4A - C 所示，Zhang 等人，2022 年）。 GRS-DNA- CuS 纳米蒲公英在 12 小时后在肿瘤组织中达到最大拉曼强度，然后保持不变直到 24 小时，证明 NIR 触发的大尺寸 GRS-DNA- CuS中的氢键热断裂纳米蒲公英可以在静脉注射后 12 到 24 小时之间进行。
4. CuS解离的超小CuS PA的肿瘤内扩散过程通过光声 (PA) 成像的纳米蒲公英。 GRS-DNA- CuS注射后12 h ，NIR照射组小鼠接受功率为2.8 W/cm 2的NIR激光照射2 min。累积的 GRS-DNA- CuS 在第一次 NIR 激光照射下，肿瘤上的纳米蒲公英完全解离成超小的CuS PA。照射 6 小时后，在肿瘤中心附近观察到更高的 PA 红色阳性信号（图 8），表明 NIR 触发的解离有助于提高超小CuS PA 的肿瘤分散性。超小型CuS PA 的扩散深度在激光照射后 6 小时大于 0.5 小时（图 8），表明超小型CuS PA 以时间依赖的方式穿透肿瘤组织。

图 8. GRS-DNA- CuS的光声图像照射后 0.5 和 6 小时后肿瘤组织中的纳米蒲公英。

5. 评估 UITD 引导的 PTT 效率。在两次 NIR 激光照射的 GRS-DNA- CuS治疗组中，五分之三的肿瘤被完全消除并且不再复发，表明 UITD 在 PTT 治疗的肿瘤中的作用（Zhang 等人的图 5B 和 5C）。 , 2022).

CuS的上述理化表征和获得的主要结果表 1 中还说明了纳米蒲公英。

表 1. DNA 组装的 GRS-DNA- CuS的理化特性和获得的主要结果纳米蒲公英
表征内容设备取得的主要成果
1个 CuS的形态透射电子显微镜 (TEM) GRS-DNA- CuS具有球形结构
2个 GRS-DNA- CuS的大小马尔文激光粒度仪 GRS-DNA- CuS的流体动力学尺寸为 135 nm
3个 CuS的Zeta电位值马尔文激光粒度仪 GRS-DNA- CuS的Zeta电位为-32.2 mV
4个 GRS-DNA- CuS的拉曼信号强度雷尼绍inVia拉曼显微镜 GRS-DNA- CuS在 1331 cm -1处具有最高的拉曼信号强度
5个 GRS-DNA- CuS的光热效应 808 nm 激光和 FLIR Ax5 相机 GRS-DNA- CuS光热转换效率高达47.44%，光热稳定性更高
6个瘤内蓄积雷尼绍inVia拉曼显微镜静脉注射12 h后GRS-DNA- CuS在肿瘤处的蓄积量达到最大值
7 瘤内渗透光声成像系统 GRS-DNA- CuS在照射6小时后分布在整个肿瘤周围
8个光热治疗效率游标卡尺在两次激光照射的治疗组中，五分之三的肿瘤被完全消除并且不再复发

致谢

该协议基于我们之前的出版物（张等人，2022 年）。国家重点研发计划（2020YFA0210800），国家自然科学基金（21874092、52161160307、31671003），上海交通大学青年教师启动基金（21X010501069）和上海细胞稳态与人类疾病前沿科学中心。我们还感谢上海交通大学医学院基础医学核心设施在体外实验方面的协助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有动物操作均经上海交通大学医学院伦理委员会批准，并在上海交通大学医学院实验动物中心进行。

参考

Zhou, C., Zhang, L., Sun, T., Zhang, Y., Liu, Y., Gong, M., Xu, Z., Du, M., Liu, Y., Liu, G. 和张东 (2021)。用于高效光声成像和光热癌症治疗的可激活 NIR-II 等离子体纳米治疗学。进阶材料 33(3)：e2006532。
Xiong , X., Xu, Z., Huang, H., Wang, Y., Zhao, J., Guo, X. 和 Zhou, S. (2020)。 NIR 光触发可分解纳米平台，以增强深部肿瘤组织的渗透和化疗。生物材料245：119840。
Yan, F.、Duan, W.、Li, Y.、Wu, H.、Zhou, Y.、Pan, M.、Liu, H.、Liu, X. 和 Zheng, H. (2016)。 NIR 激光控制药物从 DOX/IR-780 负载的温度敏感脂质体中释放，用于化学-光热协同肿瘤治疗。治疗诊断学6(13)：2337-2351 。
Li, HJ, Du, JZ, Liu, J., Du, XJ, Shen, S., Zhu, YH, Wang, X., Ye, X., Nie , S. 和 Wang, J. (2016)。用于靶向酸性肿瘤微环境的具有超高 pH 敏感性的智能超结构：瞬时尺寸转换和改进的肿瘤渗透。 ACS 纳米10(7)：6753-6761。
Wang, G.、Zhou, Z.、Zhao, Z.、Li, Q.、Wu, Y.、Yan, S.、Shen, Y. 和 Huang, P. (2020)。树枝状聚合物-药物偶联物的酶触发转胞吞作用，可深入渗透到胰腺肿瘤中。 ACS 纳米14(4)：4890-4904。
Zhou, Q., Shao, S., Wang, J., Xu, C., Xiang, J., Piao, Y., Zhou, Z., Yu, Q., Tang, J., Liu, X.,等。（2019）。酶可激活的聚合物-药物偶联物增强了肿瘤渗透和治疗效果。国家纳米技术14(8)：799-809 。
Zhang, Y.、Cui, Y.、Li, M.、Cui, K.、Li, R.、Xie, W.、Liu, L. 和 Xiao, Z. (2022)。具有爆炸性氢键断裂的 DNA 组装的可见纳米蒲公英实现均匀肿瘤内分布 (UITD) 引导的光热疗法。生物材料282：121381。