材料和试剂

一般用品
1. 250 mL Erlenmeyer 烧瓶（Corning，目录号：4980-250）
2. 2.8 L Fernbach 培养 Pyrex 烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：CLS44202XL）
3. 1.5 mL Eppendorf/微量离心管（Fisher Scientific，目录号：14-282-302）
4. 15 m L锥形管（Greiner Bio-One，目录号：188271）
5. 50 mL 锥形管（Greiner Bio-One，目录号：227270）
6. 15 mL 玻璃瓶（Corning，目录号：9820-16X）
7. 小型生长平台摇床（Lab-Line Instruments ，Inc.，目录号：3590-1）
8. 大型生长平台摇床（Barnstead | Lab-Line，A-Class，目录号：SHKA3000）
9. 1个 L离心瓶和瓶盖（Beckman Coulter，目录号：C31597）
10. 保丽龙盒
11. 膜过滤器，0.22 μm 孔径（Millipore，目录号：GSWP04700）

用于酵母转化（A 部分）
1. pFA6a 质粒（Longtine 等人，1998）。我们使用 pTF272 (pFA6a-TEV-6xGly-3xFLAG-HphMX)（Addgene 质粒 # 44083； http ://n2t.net/addgene:44083；RRID：Addgene_44083）
2. iProof HF 2X Master mix（Bio-Rad，目录号：1725310）
3. GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder（ThermoFisher Scientific，目录号：SM1331）
4. EZVision One 染料上样缓冲液，6 × （VWR，目录号：97064-190）
5. 琼脂糖（GoldBio，目录号：A-201-500）
6. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：AC118432500）
7. 乙酸（Fisher Chemical，目录号：BP2401C-212）
8. 酿酒酵母菌株 BY4741（源自 S288C 菌株；基因型MATa ； his3Δ1 ； leu2Δ0 ； met15Δ0 ； ura3Δ0 ）
9. 酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP9727-2）
10. 蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：BP9725）
11. 腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A8626）
12. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
13. 琼脂（Becton Dickson & Company，目录号：2013-03-31）
14. 聚乙二醇 (PEG) 3350（Sigma-Aldrich，目录号：202444）
15. 剪切的鲑鱼精子 DNA（Ambion，目录号：1009027）
16. 醋酸锂（Sigma-Aldrich，目录号：517992）
17. 潮霉素 B（Sigma-Aldrich，目录号：10843555001）

用于转换验证（B 部分）
18. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166）
19. 4% – 15% 预制蛋白凝胶（Bio-Rad，目录号：4561086）
20. 2 × Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610737）
21. β-巯基乙醇（Bio-Rad，目录号：161-0710）
22. 甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412P-4）
23. PVDF 膜（Bio-Rad，目录号：1620177）
24. Precision plus 蛋白质双色标准品（Bio-Rad，目录号：161-0374）
25. 厚印迹滤纸（Bio-Rad，目录号：1703969）
26. 滚筒（ThermoFisher Scientific，目录号：0084747）
27. 脱脂奶粉（MP Bio，目录号：902887）
28. 吐温 20（Sigma-Aldrich，目录号：11332465001）
29. 孵育箱（Li-Cor，目录号：929-97301）
30. 小鼠产生的单克隆 ANTI-FLAG ® M2 抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804）
31. 山羊抗小鼠 IgG 二抗（Li-Cor，目录号：926-32210）
32. 叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）

用于大规模培养、收获和裂解（C – D 部分）
33. 甘油（Fisher Bioreagents，目录号：BP229）
34. HEPES（Fisher Bioreagents，目录号：BP310-500）
35. 醋酸钾（KOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：P1190）
36. 醋酸镁[ Mg(Oac) 2 ] （Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
37. 氯化钙（ CaCl 2 ）（Fisher Chemical，目录号：C79-500）
38. D-山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：1003101761）
39. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
40. 抑肽酶（GoldBio，目录号：A-655）
41. 胃酶抑素（GoldBio，目录号：P-020）
42. 亮肽素（GoldBio，目录号 L-010）
43. 二硫苏糖醇（DTT）（GoldBio，目录号 DTT）
44. 液氮

用于免疫共沉淀（E 部分）
45. 六水氯化镁（ MgCl 2 ·6H 2 O ）（Acros Organics，目录号：41341-500）
46. Igepal CA-630（Sigma-Aldrich，目录号 I3021）
47. 抗 FLAG M2 亲和凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
48. 3xFLAG 肽（APExBio，目录号：A 6001）

用于质量控制和冷冻电镜样品制备（F – G 部分）
49. Formvar/Carbon 200 目网格（Ted Pella, Inc.，目录号：01801）
50. 595 Vitrobot 滤纸（Ted Pella, Inc.，目录号：47000-100）
51. 醋酸双氧铀盐（EMS，目录号：22400）
52. 戊二醛（EMS，目录号：16000）
53. Tris 盐酸盐（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：9310-OP）
54. Quantifoil R1.2/1.3 或UltrAuFoil R1.2/1.3 300 目网格(SPT Labtech)
55. 压缩氮气钢瓶
56. 压缩乙烷气瓶

库存解决方案
1. 50 × TAE（见食谱）
2. 5 × TBS（见食谱）
3. 10 ×转移缓冲液（参见配方）
4. 1 M HEPES-KOH，pH 7.4（参见配方）
5. 1 M KOAc（见食谱）
6. 1 M Mg(Oac) 2 （见食谱）
7. 1 M CaCl 2 （见食谱）
8. 1 M 山梨糖醇（见食谱）
9. 1 M MgCl 2 （见食谱）
10. 1 M DTT（见食谱）
11. 2 × IP 缓冲器（见配方）
12. 1 M 醋酸锂 (LiOAc)（参见配方）

凝胶
1. 1% 琼脂糖凝胶（见食谱）

缓冲器
1. 1 × TAE（见食谱）
2. 工作转移缓冲液（参见配方）
3. 阻塞解决方案（参见食谱）
4. TBST 解决方案（参见配方）
5. 酵母裂解缓冲液（见配方）
6. 洗涤缓冲液 1（参见配方）
7. 洗涤缓冲液 2（参见配方）

混音
1. 转化 PCR 混合物（根据 Bio-Rad iProof HF 手册）（参见食谱）
2. 菌落 PCR 混合物（参见食谱）
3. PEG 混合（见食谱）

试剂
1. 醋酸锂 (LiOAc)（参见配方）
2. 1% 醋酸双氧铀（见食谱）
3. Tris 碱基（Sigma-Aldrich，目录号：TRIS-RO）
4. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
5. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
6. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）

印版和媒体
1. YPAD 板（见食谱）
2. YPAD + 潮霉素板（见食谱）
3. YPD 液体培养基（见食谱）

设备

通用设备和用品
1. 移液器（VWR P10、P20、P200、P1000；目录号：89079-962、89079-964、89079-970、89079-974）
2. 落地式离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-26 XP）
3. 定角离心机转子（Beckman Coulter，型号：JLA 8.1）
4. 冷藏微量离心机（Sorvall Biofuge Fresco）
5. 42℃水浴
6. 37℃培养箱
7. 30°C培养箱
8. 涡旋混合器（Scientific Industries Inc.）
9. Nutator（Clay Adams，目录号：421105）
10. 分光光度计（ThermoFisher Scientific，目录号：ND-ONE-W）
11. 凝胶电泳仪
12. 微型抹刀
13. GelDoc-IT（VWR）
14. 台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra 6R；GH-3.8 转子）

用于酵母转化
15. 热循环仪（Applied Biosystems，目录号：4484073）
16. 细胞培养旋转器
17. 3 mm 实心玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：Z143928）
18. 复制板工具（Cole Parmer，目录号：EW-14210-00）
19. 平绒方块（Cole Parmer，目录号：EW-14210-50）
20. 低温小瓶（VWR，目录号：89094-800）

用于全细胞免疫印迹
21. Trans-Blot 涡轮转移系统（Bio-Rad，目录号：1704150）
22. 轨道摇床 (Vevor)
23. Odyssey CLx 成像系统 (Li-Cor)

用于细胞裂解（冷冻磨）
24. 冷冻手套（Tempshield）
25. 面罩/护目镜
26. 冷冻机/研磨机低温研磨机 (Spex)
27. 研磨瓶套件（聚碳酸酯圆筒、冲击器和端塞；Spex，目录号：6751）
28. 冷冻磨磁力提取器（Spex，目录号：6791）
29. 冷冻磨开瓶器（Spex，目录号：6754）

用于低温 EM 样品制备/玻璃化
30. Pelco easiGlow 装置（Ted Pella, Inc.，目录号：91000）
31. DUMONT 夹环医用镊子（Ted Pella，目录号：38825）
32. Vitrobot（ThermoFisher Scientific，目录号：VITROBOT）
33. Vitrobot 镊子（Ted Pella，目录号：47000-500）
34. 不锈钢长镊子（Xducom）
35. Cryo-EM 网格存储盒（MiTeGen，目录号：M-CEM-CGBSW1）
36. 网格盒存储杜瓦瓶（Worthington 25LDB Storage Dewar，Cole-Parmer，目录号：EW-03773-57）

程序

A. 酵母转化（图1 ）

图1 。生成新标记菌株的工作流程。通过同源重组用 PCR 产物转化酵母细胞。在质量控制和审查成功转化后，细胞即可用于下游纯化（使用 BioRender.com 创建）。

A1.用于标记 GOI 的引物设计
1. pFA6a 质粒（Longtine 等人，1998）中扩增整个 3xFLAG 标签和接头序列，例如pTF272 (Addgene)。该适配器应与 3xFLAG 标签的 5 '端退火，长度约为 24 个碱基（8 个密码子），确保保留标签的阅读框。使用 pTF272 质粒的示例：
5 ' ggctctagagactacaaggaccac 3 '
2. 为您的 GOI 选择一个基因特异性序列，以将标记直接标记到编码蛋白质的 C 末端残基。该序列的长度应在 35到60 个碱基之间，并直接在终止密码子之前结束，以保留标签的阅读框。该基因特异性序列与正向接头序列结合形成最终的正向标记引物。 Cooney等人报道的SHP1基因的例子。 (2019):
5 ' GATCTGCTGAACTCCGTTGTCGTGCAAAGATGGGCAggctctagagactacaaggaccac 3 ' （大写：GOI 序列；小写：pTF272 序列）。
3. 选择反向适配器r 序列以从质粒中放大 hphMX6 选择盒和终止子。该接头应代表来自 TEF 终止子 3' 端和退火 3' 的序列的反向补体，长度约为 24 个碱基。来自 pTF272 质粒的示例：
5' cagcagtatagcgaccagcattca 3'
4. 在 GOI 的终止密码子之后直接结束的另一个基因特定序列。此序列应介于 35 和长度为 60 个碱基。将基因特异性序列的反向补体与反向接头序列结合起来，形成最终的反向标记引物。 SHP1基因的例子：
5' AGTCTTTTCCCGTTTCTGTTTTTGTATATTTATGCcagcagtatagcgaccagcattca 3'（大写字母：GOI 序列；小写字母：pTF272 序列）。有关每个引物同源区域的图形表示，请参见图 2 。

图2 。酵母转化引物设计概述。引物设计为正向链与感兴趣基因 (GOI) 的 3' 末端同源，就在内源终止密码子之前，反向链与紧跟在终止密码子之后的片段同源。引物退火到编码 3xFLAG 标签和选择标记（在本例中为潮霉素）的 pFA6a 质粒区域（例如，pTF262；参见材料）。在 PCR 扩增和酵母转化后，细胞现在表达 GOI 的 3xFLAG 标记版本和选择标记。

A2。 PCR产物的扩增
1. 使用转化 PCR 混合物（参见食谱）在 PCR 管中准备 PCR 反应。
2. 使用iProof 主混合物推荐的设置运行 PCR 。退火温度应由计算出的与质粒退火的寡核苷酸序列的解链温度确定，该温度应在 55 至 72°C 之间。我们建议运行温度梯度以确定最佳设置以最大化 PCR 产物（图 3 ）。
3. 将 5 µL PCR 反应和 5 µL DNA 阶梯（每个与 1 µL EZVision One 染料作为加载缓冲液混合，6 × ）加载到1% 琼脂糖凝胶的单独孔中。
4. 运行凝胶电泳仪，凝胶浸没在 120 V 的 1 × TAE 缓冲液中，直到主要染料到达凝胶底部（估计 30 分钟；参见食谱）。
5. GelDoc-IT 上的图像凝胶。确认 PCR 产物预期大小的条带是否存在。
6. 将 PCR 产物在 -20°C 下储存最多 24 小时，直到细胞准备好进行转化。

图3 。的例子用于酵母转化的 PCR 产物。退火温度梯度用于确定 PCR 扩增的最佳设置。在此示例中，使用 68 至 72°C 之间的退火温度生成约 1,700 bp 的预期 PCR 产物。然后将这些产品汇集用于下游酵母转化。

A3.改造_
1. 有关液体或固体培养基中酵母培养的一般指南，请参阅 Sigma-Aldrich 酵母方案网站： https ://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/protocol/microbiological-testing/pathogen-and-spoilage -测试/酵母生长协议。
2. 转换协议改编自 Gietz 和 Schiestl (2007)。使用无菌技术和经过消毒的移液器吸头，刮掉少量 BY4741 酵母细胞的甘油原液，并将其划线到 YPAD 板上。小心防止甘油原液解冻。
3. 在 30°C 下孵育板，直到出现单个菌落（1 – 2 天）。
4. 使用无菌技术，用无菌移液器吸头轻轻刮擦，从盘子中挑选一个孤立的 BY4741 菌落。
5. 将移液器吸头放入15 mL培养管中的 3 mL YPD培养基中接种酵母。轻轻上下移液，直到菌落悬浮在培养基中。
6. 将玻璃瓶放在细胞培养旋转器上，并在 30°C 下孵育过夜。
7. 在大约 16 小时的细胞生长后，通过稀释 YPD 中的隔夜生长 1:20 来准备 OD 600测量，例如，将 50 μL 的细胞培养物稀释到 950 μL 的 YPD 中。用 YPD 空白分光光度计并测量稀释细胞的 OD 600 。稀释后的目标 OD 600应约为 1.0，即实际OD 600约为 20。
8. 通过在15 mL玻璃瓶（1:100 稀释）。
9. 在 30°C的细胞培养旋转器上培养细胞约 3 小时。在 OD 600达到大约 1.0后取出小瓶。
10. 在细胞生长的同时，准备PEG与 A2 部分第 6 步中的 PCR 产物混合（参见食谱）。要溶解 PEG 3350，请加入双蒸水 ( ddH 2 O) ，充分涡旋混合，然后在 37°C 下孵育 5 分钟。确保 PEG 已完全溶解并在需要时继续涡旋。
11. 将鲑鱼精子 DNA 置于 95°C 水浴中 5 分钟，然后在加入 PEG 混合物之前在冰上冷却。
12. 酵母培养物转移到 15 mL 锥形管并在室温下以2,000 x g离心5 分钟。
13. 倒出并丢弃媒体上清液。
14. 将细胞颗粒重新悬浮在 5 mL 的 ddH 2 O 中。通过移液混合。
15. 在室温下以2,000 × g离心5 分钟。
16. 倾析并丢弃水上清液。
17. 通过移液将细胞沉淀重悬于 1 mL 的 100 mM LiOAc 中，然后转移到 1.5 mL Eppendorf管中。
18. 4,500沉淀细胞 × g持续 1 分钟在室温下，然后丢弃上清液。
19. 使用刀片将 1,000 µL 移液器尖端的末端切掉 2 厘米（图 4 ）。
注意：处理锐器时要小心。
20. 使用此吸头将粘性 PEG 混合物移至细胞沉淀上。剧烈涡旋以将细胞沉淀重新悬浮到 PEG 混合物中。

图4 。为粘性溶液准备移液器吸头。未切割的 1,000 µL 移液器吸头（顶部）和用剃刀刀片切掉约 2 cm 的吸头（底部）的比较。

21. 悬的细胞在 42°C 水浴中孵育40 分钟。
22. 4,500离心 × g 30 秒在室温下，然后丢弃上清液。
23. 将细胞颗粒重新悬浮在 600 µ L的 ddH 2 O中。
24. 移液器 300 μL 的再悬浮细胞分别放在两个单独的 YPAD 琼脂板上（不含抗生素）。
注意：此步骤对于让细胞在转化后恢复很重要。
25. 使用高压灭菌的玻璃珠将细胞均匀地分布在板上。
26. 标记板并在30°C下孵育24 小时。

A4.复制电镀
1. 生长 24 小时后，应该可以看到一片细胞。细胞现在已准备好转移到选择板上。
2. 将经过消毒的天鹅绒放在复制板工具的顶部，并使用复制板工具环牢固地固定天鹅绒。
3. 将板轻轻压在天鹅绒上，将细胞转移到天鹅绒上。
4. 将板与天鹅绒分开，然后轻轻地将选择板（YPAD + 潮霉素，参见食谱）压在细胞覆盖的天鹅绒上。
5. 将板在 30°C 培养箱中保存2-3天，直到开始出现单个菌落。
6. 菌落出现后，在新的 YPAD + 潮霉素平板上划线划出多个单独的菌落。我们建议在每个平板上划线八个菌落。
7. 将板存放在 30°C 培养箱中，直到可以看到细胞生长。
8. 细胞生长表明细胞正在表达选择标记并表明转化成功。要排除误报，请通过菌落 PCR 和/或全细胞免疫印迹验证转化（下文 B 部分）。

B. 转换确认

B1.菌落PCR。改编自 Akada 等人的协议。 (2000)
1. 设计特定于转化基因的菌落 PCR 引物，这样一个引物退火到 GOI，另一个引物退火到插入的序列。我们建议靶向大小约为 300 bp 的 PCR 产物。
2. 菌落 PCR 正向引物的长度应约为 35 个碱基，并且在GOI内。 SHP1基因的例子：
5 ' CTATCAAACCAATAAGCAACGATGAGACAACATTG 3 '
3. 的设计应使用来自 3 ' 端的反向互补序列，大约对应于插入的 DNA 内有 35 个碱基。来自 pTF272 质粒的示例：
5' GAGGTGTGGTCAATAAGAGCGACCTCATACTATAC 3'
4. 使用移液器吸头，将分离的酵母菌落转移到 Eppendorf 管中的 20 μ L 0.25% SDS。我们建议对多个菌落重复此操作。
5. 彻底涡旋以悬浮 SDS 中的细胞。
6. 将装有细胞的试管置于 95°C 水浴中 3 分钟。
7. 将 60 µ L ddH 2 O添加到每个试管中。
8. 在微量离心机中在室温下以 1·7,000 × g 的速度旋转细胞1分钟。
9. 1.5 µ L含有基因组 DNA 的上清液添加到 18.5 µ L菌落 PCR 主混合物（参见R ecipes）中。
10. 重复步骤 4 – 9 以筛选所需数量的菌落。我们推荐最多 15 个菌落。
11. 3-5步执行 PCR 并确认 PCR 产物的存在（有关 PCR 确认的示例，请参见图 3 ）。请注意，没有 PCR 产物可能会被解释为假阴性。我们建议运行全细胞免疫印迹作为额外的验证措施。

B2.全细胞免疫印迹
1. 对于每个菌落，使用无菌技术将 10 mL 的 YPD 添加到 15 mL 培养管中。
2. 用来自平板的单独菌落接种每个管。
3. 将试管置于 30°C 的细胞培养旋转器上，使细胞生长过夜。
4. 在 4°C 下以 4,000 × g离心 1 mL 培养物5 分钟。
5. 在 100 µL ddH 2 O 和 100 µL 2 ×工作 Laemmli 缓冲液中重悬细胞沉淀。
6. 在 95°C 下加热2-3分钟。避免过度沸腾以防止蛋白质沉淀。
7. 在 4°C 下以 4,000 × g离心 5 分钟。
8. 将 15 µL 上清液加载到预制 4% – 15% SDS-PAGE 凝胶上。
9. 在 170 V 下运行 SDS-PAGE 凝胶 35 分钟。
10. 准备 100 mL 的工作转移缓冲液（参见食谱）。
11. 准备 50 mL 的 100% 甲醇。
12. 将 SDS-PAGE 凝胶浸泡在 20 mL 的工作转移缓冲液中。
13. 将 PVDF 膜的长度和宽度切割成比 SDS-PAGE 凝胶大 2 厘米。
14. 将 PVDF 膜浸泡在 100% 甲醇溶液中。
15. 切两张厚印迹滤纸，使其长度和宽度比 PVDF 膜大 2 厘米。
16. 将滤纸浸泡在剩余的转印缓冲液中。
17. 在免疫印迹传输系统盒中，按此顺序从下到上组装传输堆栈：滤纸、PVDF 膜、SDS-PAGE 凝胶、滤纸。
18. 将剩余的工作转移缓冲液倒在转移堆栈上以保持水分。
19. 使用滚筒从传输堆栈中清除任何残留的气泡。
20. 将盒式磁带的顶部放在传输堆栈上，将其锁定到位，然后将盒式磁带插入传输系统。
21. 将凝胶的内容物转移到 25 V 的 PVDF 膜上 30 分钟。
22. 准备 20 mL 的封闭溶液（参见食谱）。
23. 将 PVDF 膜转移到不透明的孵化箱中。
24. 将封闭溶液添加到盒子中，并在室温下轻轻搅拌孵育 30 分钟。
25. × TBST 中用 5% 牛奶稀释 1:1,000 来制备小鼠抗 FLAG 一抗。
26. 倒掉封闭缓冲液，加入 10 mL 的抗 FLAG 一抗，然后在室温下轻轻搅拌孵育至少 1 小时（或在 4°C 下过夜）。
27. 将抗 FLAG 抗体倒回 15 mL 锥形管中。抗体溶液可在-20°C 下保存并重复使用数次。
28. 通过向膜中加入 15 mL TBST 溶液来清洗膜，并在室温下轻轻搅拌孵育 5 分钟。
29. 重复 TBST 洗涤步骤三次，每次洗涤后丢弃 TBST。
30. 用 5% 牛奶在 1 × TBST中按 1:10,000 稀释抗体，制备山羊抗鼠二抗。
31. 加入 10 mL 的二抗，室温孵育 1 小时。
32. 将二级抗体倒入不透明的 15 mL 锥形管中。抗体溶液可在 0.01% 叠氮化钠存在下于 -20°C 下储存并重复使用数次。
33. 重复步骤 28 和 29 中的洗涤步骤。
34. 使用 Odyssey CLx 成像系统对膜进行成像。

B3.准备甘油原液
1. 使用无菌技术，用无菌移液器吸头轻轻刮擦，挑选一个已确认的孤立菌落。
2. 加入 10 mL YPD 并在细胞培养旋转器上 30°C 孵育过夜。
3. 将 500 µL 灭菌的 30% 甘油（在水中，v/v）添加到低温小瓶中。
4. 在低温小瓶中加入 500 μL 的培养物。丢弃多余的文化。
5. 关闭小瓶并颠倒混合。
6. 给小瓶贴上标签并储存在 -80°C 下。库存可以无限期储存，并在需要准备新盘子时使用。

C. 大规模酵母细胞培养和收获（图 5）

图5 。培养细胞和准备细胞裂解的工作流程（使用 BioRender.com 创建）

1. 使用无菌技术将100 mL 的 YPD添加到两个 250 mL 烧瓶中。
2. 用平板上的菌落接种每个烧瓶。
3. 将烧瓶放在 30°C 的平台振荡器上。培养细胞约 16 小时或直至饱和。
4. 使用无菌技术，将 30 mL 的饱和培养物添加到 2. 8 L烧瓶中的 970 mL 新鲜 YPD 中。对六个烧瓶重复此操作。目标起始 OD 600应约为 0.3。
5. 在 30°C 的平台振荡器上培养细胞大约_ 4 小时，直到它们达到约OD 600的中期对数期 1.5.测量 OD 600 通过检索500 µ L定期估计细胞何时会达到适当的 OD 600 。
6. OD 600后约达到 1.5，通过将酵母培养物从烧瓶转移到 1 L瓶中来收获细胞。
7. 在 4°C 下以 4,500 × g离心 6 分钟沉淀细胞。
8. 细胞沉淀后，倒出培养基上清液。
9. 自动移液器将所有细胞重新悬浮在总共 30 –4 5 mL 的冷冻 ddH 2 O 中，然后将重新悬浮的细胞转移到50 mL 锥形瓶中。
10. 在 4°C 下以 4,500 × g离心锥形瓶5 分钟，沉淀细胞。
11. 倒掉并丢弃水上清液。
12. 通过从带有细胞颗粒的管的重量中减去空管的重量来记录细胞颗粒的 w八。通常，在 OD 600约为 1.5 时收获的 6 升细胞培养物重 10 – 20 g。
13. 每 6 g 细胞沉淀加入 1 mL 冷冻裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂（参见食谱）。通过用移液器吸头搅动混合并保持在冰上。
14. 用液氮填充一个小的聚苯乙烯泡沫塑料盒。
注意：处理液氮时，应使用护目镜和低温手套等防护设备。
15. 使用 ac ut 移液器吸头（图 4 ），将重悬的细胞沉淀缓慢滴入液氮中（图 6 ，左）。保持与液氮的分离，以避免冻结移液器尖端。酵母在接触液氮时应形成小颗粒。为获得最佳效果，请将水滴分散在整个盒子中，以防止水滴凝结在一起。

图6 。准备用于冷冻磨裂解的酵母颗粒。（剩下）照片显示如何将重悬的细胞沉淀滴入液氮中以产生小的冷冻细胞沉淀。（正确的）所得小冷冻细胞沉淀的照片。

16. 用液氮填充另一个更大的聚苯乙烯泡沫塑料容器并冷却 50 取下盖子的m L锥形管、漏斗和液氮中的长镊子。用管夹夹住管子，使其大部分浸没在液氮中。
17. 通过冷冻漏斗将酵母颗粒倒入夹紧管中。如果管子溢出液氮也没关系。使用冷冻的长镊子刮掉粘在盒子上的任何剩余颗粒。
18. 用剪刀刺破 50 mL 锥形管的盖子（图 7 ）。这对于在盖上管子后让液氮从管子中排出很重要。
19. 让 80% - 90% 的液氮从 50 mL 管中蒸发，然后用刺破的盖子盖上管子。剩余的液氮将通过刺破的盖子排出。
20. 将加盖试管储存在 -80°C，直到细胞准备好裂解（D 部分）。

图7 。为冷冻酵母颗粒准备 50 mL 锥形管。 50 mL 锥形管和用于储存冷冻酵母颗粒的刺破盖子的照片。在将细胞颗粒倒入试管后，刺破的盖子可以让液氮排出。

D. 通过冷冻磨细胞裂解

1. A在液氮罐和冷冻磨之间连接一根连接软管。
2. 液氮罐的阀门以预冷机器。
注意：处理液氮时应使用护目镜和低温手套。
3. 用液氮填充聚苯乙烯泡沫塑料盒。
4. C hill 冷冻磨聚碳酸酯圆筒，一端塞住，箱子中装有冲击器，装有液氮。小心不要将液氮留在钢瓶内。
5. 将冷却的冲击器和冷冻酵母颗粒添加到圆筒中。将每个钢瓶加满一半容量（图 8 ）。请注意，将管子装满一半可能会降低裂解效率。

图8 。组装冷冻机聚碳酸酯圆筒。（左）照片显示冷冻研磨聚碳酸酯圆筒如何装载冲击器和冷冻细胞颗粒。（右）照片显示管子已装满一半容量并准备加盖。

6. 塞住冷冻磨的开口端钢瓶，确保管内没有剩余的液氮（图 9 ）。
温度突然变化，将液氮留在管内会导致塞子弹出，从而造成伤害。
7. 将密封的冷冻磨缸放在冷冻磨内。每次运行可容纳四个气缸（图 9 ）。

图9 。准备冷冻磨缸进行粉碎。（左）照片显示了堵塞冷冻机圆筒开口端的过程。（中）照片显示一个带盖的冷冻磨圆筒在放入冷冻磨之前被浸没在液氮中。（右）照片显示所有四个圆筒都放置在冷冻机内。

8. 将冷冻机设置为六个周期、10 cps（每秒冲击）、3 分钟研磨和 2 分钟冷却。
9. 开始运行，大约需要45 分钟才能完成。
10. 运行完成后，从冷冻研磨机中取出钢瓶，并将它们放入 -80°C 冷冻箱中2 0 分钟。此步骤对于防止端塞因突然的温度变化而弹出很重要。
11. 用液氮填充聚苯乙烯泡沫塑料盒。
12. 预冷 50 盒子里有m L锥形管、一个漏斗和一个微型抹刀。
13. 从冷冻磨管上取下盖子，将裂解的酵母粉转移到预冷的 50 使用微型刮刀将m L锥形管置于液氮上方（图 10 ）。
14. 我们建议将酵母粉分成 2 份 g等分试样。每 50 次应占大约 5 mL mL 锥形管（图 10 ）。注意将粉末保持在-80°C或更低温度，直到它们用于 co-IP。如果在适当的温度下处理，粉末应保持松散和蓬松。每个 2 g 等分试样用作单个 co-IP 实验（E 部分）。如果需要更高的 co-IP 产量，可以使用更多的粉末。粉末可在-80°C下保存数月。
注意：有关 Spex SamplePrep 冷冻研磨机使用和原理的概述视频可通过以下链接获得： https ://youtu.be/Q8600XCBsnQ 。

图10 。处理酵母粉。（左）照片显示在 -80°C 或更低温度下处理和储存时裂解酵母粉的松散和蓬松的稠度。（右）示例 2 g 酵母粉等分试样储存在 50 mL 锥形瓶中。

E. 免疫共沉淀和洗脱（图 11 ）

图11 。纯化样品、评估其质量和制备冷冻电镜样本的工作流程（使用 BioRender.com 创建）。

1. 本节（E 节）中的所有步骤均在 4°C 下执行。
2. 在开始本阶段的方案之前立即准备洗涤缓冲液 1（参见食谱）。
3. 从 -80°C 冰箱中取出酵母粉等分试样，立即置于冰上。
4. 以 1:1 (v/w) 的比例将粉末重新悬浮在洗涤缓冲液 1 中。用移液器吸头搅拌成均匀的浆液，彻底混合。每个实验所需的粉末数量将取决于感兴趣的标记蛋白的表达水平。我们建议以 2 克粉末为起点。
5. tte 尖端将粘性浆液转移到冰上的 1.5 mL Eppendorf 管中（图 4 ）。
6. 微量离心机中以5,000 × g离心5分钟使裂解液澄清。
7. 上清液转移到新的 1.5 mL Eppendorf 管中。丢弃不溶性沉淀物。
8. 通过以 10,000 × g离心10 分钟再次澄清裂解物。
9. 将上清液转移到新的 1.5 mL Eppendorf 管中。丢弃不溶性颗粒。
10. 15,000 × g离心10 分钟重复裂解液澄清。丢弃不溶性颗粒。
11. 当离心步骤在步骤 10 中运行时，通过将其重新悬浮在 15 中的 1 mL 洗涤缓冲液 1 中，平衡 30 μ L的抗 FLAG M2 亲和凝胶 mL 锥形管。以 1,000 x g旋转2 分钟，使树脂颗粒化。移走并丢弃上清液，确保不要干扰或移除树脂床。
12. 将澄清的裂解上清液转移到平衡的抗 FLAG M2 亲和凝胶中，并通过轻柔的移液器重新悬浮亲和凝胶。
13. 将含有亲和凝胶和澄清裂解液的试管放在章动器上，轻轻摇动孵育 1 小时。
14. 孵育后，以 1,000 × g离心树脂 2 分钟。通过移液去除并丢弃未结合的材料，注意不要扰乱树脂床。
15. 将 1 mL 的洗涤缓冲液 1 添加到亲和凝胶中，并通过轻柔的移液器重新悬浮。
16. 通过移液将重新悬浮的树脂从 15 mL 锥形管转移到新鲜的 1.5 mL Eppendorf 管中。
17. 以 1,000 × g离心树脂2 分钟。
18. 吸取上清液，注意不要干扰树脂。
19. 重复步骤 1 5 、 1 7和 1 8五次，用洗涤缓冲液 2重复五次（即，在每个洗涤缓冲液中洗涤五次）。注意洗涤次数_ 可能需要优化以在协议持续时间和样本纯度之间实现所需的平衡。
20. 加入 30 μ L的 3 x FLAG 肽，浓度为 1.5 mg/mL，并在 nutator 上孵育30 分钟。
21. 以 1,000 x g将树脂沉淀2 分钟。
22. 小心转移将 30 µL洗脱液加入新鲜的1.5 mL Eppendorf 管中，并立即用于质量控制（F 部分）或低温 EM 样品制备（G 部分）（步骤 8）。有关要回收的洗脱液数量的示例，请参见图 12 。

图12 。从 3xFLAG 树脂中洗脱。（左）将 3xFLAG 肽添加到抗 FLAG 亲和树脂床后的免疫共沉淀照片。洗脱液（上清液层）应通过移液器小心移出。（右）分离洗脱液后剩余树脂的照片。

F. 质量控制（推荐，可选）

F1。银染 SDS-PAGE
1. 在工作 Laemmli 缓冲液中稀释蛋白质阶梯 1:50，并将稀释阶梯的 6 µL 加载到预制聚丙烯酰胺凝胶的空车道中。
2. 将 5 μL 的洗脱液与 5 μL 的2 ×工作 Laemmli 缓冲液混合。在 95°C 的加热块上放置 3 分钟。将变性样品加载到预制凝胶上。
3. 在 170 V 下运行凝胶 35 分钟或直到主要染料接近凝胶底部。
4. 我们推荐使用 SilverQuest 银染试剂盒 (Thermo Fisher Scientific) 对 co-IP 洗脱进行银染，因为这种方法的高灵敏度使用相对较少的材料。根据制造商的手册，遵循“快速染色”协议。
5. 有关银染 SDS-PAGE 的示例，请参阅 Shen 等人。 (2015) 或 Cooney 等人。（2019）。蛋白质身份可以通过质谱蛋白质组学或免疫印迹来确认。

F2。负染色透射电镜
1. 负染色透射电子显微镜 (TEM) 提供了一种快速简单的方法来评估粒子质量，然后再将资源投入冷冻 EM。请咨询您所在机构的 TEM 设施以获取仪器。有关负染色 TEM 的一般概述，包括协议和染色选项，请参阅 cryo-EM 101 网站的负染色模块： https ://cryoem101.org/chapter-1/#part5 （Shen 和 Iwasa，2018） .
2. 在室温下制备负染色网格。
3. 将连续碳（ Formvar/carbon 200 目）网格放置在用封口膜包裹的载玻片上，样品应用面朝上（图 13 ）。

图13 。用于辉光放电的栅格的制备。（左）网格放置在封口膜包裹的载玻片上。（右）载玻片插入 Pelco easiGlow 辉光放电室。

4. 将幻灯片放在辉光放电平台上，并盖上玻璃室。
5. 辉光在 15 mA 下对网格放电 30 s。
6. 通过处理网格的外缘，用 DUMONT 镊子拾取网格。用夹紧环夹住镊子。
7. 将 3.5 µL 的样品应用到网格上一分钟。
8. 使用 595 Vitrobot 滤纸轻轻吸干样品。
9. 通过将样品施加到一滴水的一侧浸入来清洗网格。
10. 用滤纸吸干去除多余的水。
11. 将 3.5 µL 的 1% 乙酸双氧铀（参见食谱）移至网格上 20 秒。
12. 用滤纸吸干醋酸双氧铀溶液。
注意：所有与醋酸双氧铀接触的一次性用品都必须根据机构安全指南进行处理。
13. 存储前让网格风干几分钟。
14. 使用透射电子显微镜对网格进行成像，以确认粒子可见且浓度足够高以用于低温 EM（图 14 ）。

图14 。通过 Shp1-3xFLAG 的免疫共沉淀分离的 Cdc48 复合物的负染色 TEM 图像示例（Cooney 等人，2019）。在配备 Gatan Orius CCD 相机的 Tecnai T12 透射电子显微镜上记录的图像。粒子符合进行低温 EM 样品制备的标准，包括单分散性、浓度和尺寸。

G. 冷冻电镜标本制备

样品交联（可选）
1. 在低温 EM 样品制备过程中，可能需要交联以保持复合物的结构完整性（Monroe 等人，2017）。众所周知，印迹后颗粒暴露于疏水性空气-水界面会引发与低温 EM 相关的常见问题，包括首选方向（Noble 等人，2018 年）和颗粒变性（D'Imprima 等人，2019 年）。
2. 如果进行交联反应，准备 0.2% 的戊二醛储备液。
3. 30 μL 洗脱液中加入 1.4 μL 0.2% 戊二醛。戊二醛的最终浓度为 0.00± 9 % （v/v；大约 0.9 mM）。
4. 移液和孵育混合室温交联反应10分钟。或者，该反应可以改为在冰上进行。可能需要优化交联条件（包括戊二醛浓度、温度和孵育时间）以达到所需的交联程度。
5. 使用 1 μL 的 100 mM Tris pH 7.4 淬灭反应（最终 Tris 浓度约为 3 mM ）并将样品放回冰上。
6. 通过银染 SDS-PAGE 确认交联程度（ F 部分）。例如，参见 Cooney 等人。（2019）。

冷冻电镜标本制备
7. 使用 Mk 的玻璃化过程的视频。 II Vitrobot 可在https://youtu.be/gbA5BytYBhc获取（来源，Helen M. Donelick）。有关网格玻璃化的其他一般指南和建议可在 CryoEM 101 上找到： https ://CryoEM101.org （Shen 和 Iwasa，2018 年）。
8. 辉光放电网格（Quantifoil 或 UltrAufoil）按照 F2 部分中的步骤 1 – 3。请注意，辉光放电设置可能需要优化。
9. 打开压缩氮气罐并打开 Mk。 II 维特罗机器人。
10. 用蒸馏水填充加湿器杯至适当体积，然后连接到 Vitrobot。
11. 将 Vitrobot 湿度设置为 100%，将温度设置为 4°C。
12. 将新的吸墨纸放在吸墨垫上。允许 Vitrobot 在指定的温度和湿度下平衡 30 分钟。调整软件中的各种插入冻结设置。将仪器设置为以下设置：
等待时间：20秒
插入时间：4 秒
印迹时间：UltrAuFoil（金）网格 4 秒或 Quantifoil（碳）网格 7 秒
印迹偏移：-1 mm
请注意，这些设置可能需要优化才能达到所需的冰厚度。
13. 用新鲜的液氮填充杜瓦瓶。
14. 准备冷冻装置：将黄铜杯和网格盒底座放在绝缘碗中，将金属蜘蛛放在黄铜杯顶部，并将浮子放在网格盒底座周围。将带标签的网格框放入网格框基座上的某个位置。
15. 用液氮填充绝缘碗。这可能需要重复几次，因为氮气会在初始冷却过程中迅速蒸发。
16. 使用液氮预冷黄铜杯。黄铜杯中的液氮蒸发后，将乙烷管中的玻璃吸管尖端放入黄铜杯中，然后打开通往压缩乙烷罐的阀门。随着乙烷开始液化，它会发出啸叫声。
17. 用液体乙烷填充黄铜杯，直到液体乙烷的水平达到蜘蛛。
18. 关闭乙烷罐，让黄铜杯中的液体乙烷开始冷却。乙烷开始变成泥浆后立即移走蜘蛛。确保乙烷没有完全凝固；如果发生这种情况，将一个单独的室温蜘蛛倒置在黄铜杯上，将乙烷熔化成雪泥。
19. 使用 Vitrobot 加载镊子将辉光放电网格加载到 Vitrobot 上。务必通过其外缘拿起网格，以防止损坏样品应用区域。
20. 单击“放置新样品”将 Vitrobot 臂降低到位。
21. 将镊子放在 Vitrobot 手臂上，然后单击“继续”。确保网格的样品应用侧朝向Vitrobot 上的侧开口。
22. 将冷冻装置放在 Vitrobot 上，然后单击“继续”。
23. Vitrobot的侧开口将 3.5 μL 样品应用到网格上。
24. 点击“继续”即可进行网格印迹和浸入液态乙烷中。
25. 将网格从乙烷快速转移到浸没在液氮中的标记存储容器中，注意不要弯曲网格。
26. 重复步骤19 – 25 对于所需数量的网格。每个网格存储容器可容纳四个低温 EM标本。
27. 将网格存储容器存储在存储杜瓦瓶中，直到它们准备好加载到低温 TEM 中。
28. 根据制造商的说明关闭 Vitrobot。

数据分析

cryo-EM 的数据处理将取决于仪器、粒子大小和可用的计算硬件和软件。在 Cooney 等人的补充材料中可以找到低温 EM 数据处理工作流程的示例。（2019）。在 PubMed 上免费提供：PMCID：PMC7362759。

限制
该协议专为分离内源性可溶性蛋白质及其相关复合物而设计。我们尚未测试我们的协议对膜蛋白的适用性，这需要使用洗涤剂进行额外的优化步骤。

故障排除
建议将本协议中描述的程序作为起点。可能需要探索许多变量来优化每个样品的产量和纯度。这些变量可能包括缓冲液 pH 值、盐浓度、起始裂解物和固定树脂的数量、孵育时间、洗涤次数和洗脱条件，可能需要探索每一个因素以生成适合低温 EM 的样品。

食谱

A. 库存解决方案

1. 50 ×泰
242 克 Tris 碱
57.1 mL 冰醋酸
100 mL 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0
2 O填充至 1 L 的最终体积。此缓冲器可在室温下储存数月。
2. 5 × TBS
12 克 Tris 碱
44克氯化钠
2 O填充至 1 L 的最终体积。此缓冲器可在室温下储存数月。
3. 10 ×转移缓冲液
30.2 克 Tris 碱
144 克甘氨酸
填充 ddH 2 O 至最终体积为 1 L。该缓冲液可在 4°C 下储存数月。
4. 1 M HEPES-KOH，pH 7.4
238.30 克 HEPES
2 O填充至 800 mL。将 pH 值调整为 7.4。用 ddH 2 O填充至 1,000 mL。储存在 4°C。
5. 1 M KOAc
98.2 克 KOAc
2 O填充至最终体积为 1 L。储存在 4°C。
6. 1 M 镁 (OAc) 2
214.46 克 Mg(OAc) 2
2 O填充至最终体积为 1 L。储存在 4°C。
7. 1 M 氯化钙2
147.02 克氯化钙2
2 O填充至最终体积为 1 L。储存在 4°C。
8. 1 M D-山梨糖醇
182 克 D-山梨糖醇
2 O填充至最终体积为 1 L。储存在 4°C。
9. 1 百万氯化镁2
203.3 克 MgCl 2 ·6H 2 O
2 O填充至最终体积为 1 L。储存在 4°C。
10. 1 M 地面地面电视
3.86 克 DTT
填充 ddH 2 O 至最终体积为 25 mL。准备 100 μL 等分试样并储存在 -20°C。
11. 2 × IP缓冲器
50 mM 的 HEPES-KOH，pH 7.4
200 mM 的 KOAc
20 mM 的 MgCl 2
储存在 4°C。
12. 1 M 醋酸锂 (LiOAc)
10.2 克 LiOAc
2 O填充至 100 mL 的最终体积。储存在 4°C。

B. 凝胶

1. 1%琼脂糖凝胶
100 mL 的 2 × TAE（50 × TAE 用 ddH 2 O 稀释）
2克琼脂糖
2 O填充至 200 mL 的最终体积。倒入前煮沸溶解。

C. 缓冲器

1. 1 ×泰
× TAE 储备液中的 ddH 2 O稀释。最终体积取决于电泳槽的大小。准备足够的体积以淹没琼脂糖凝胶。
2. 工作转移缓冲液
5% 甲醇
1 ×转移缓冲液（用 10 ×转移缓冲液中的 ddH 2 O稀释）
3. 阻塞解决方案
5% 奶粉 (w/v)
1 × TBS（从 5 × TBS 原液中稀释）
0.05% 吐温 20
填充 ddH 2 O 至最终体积为 25 mL。
4. TBST溶液
1 × TBS（用 5 × TBS 原液中的 ddH 2 O稀释）
0.1% 吐温 20
2 O填充到 1 L 的最终体积。
5. 酵母裂解缓冲液
50 mM 的 HEPES-KOH pH 6.8
150 mM 的 KOAc
2 mM 的 Mg(OAc) 2
1 毫米 CaCl 2
200 mM 的山梨糖醇
2 O填充至最终体积为 1 L。储存在 4°C。
6. 洗涤缓冲液 1
1 × IP 缓冲液（用 2 × IP 缓冲液中的 ddH 2 O稀释）
5%甘油
0.1% 伊格帕尔 (CA-630)
1 mM 的 DTT
蛋白酶抑制剂混合物：0.5 μg/mL 亮肽素、0.5 μg/mL 抑肽酶、0.7 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂和 16.67 μg/mL PMSF
填充 ddH 2 O 至最终体积为 20 mL（每个 co-IP）。
*准备注意事项：最后添加 DTT 和 PMSF。
7. 洗涤缓冲液 2
1 × IP 缓冲液（用 2 × IP 缓冲液中的 ddH 2 O稀释）
1 毫米数字地面电视
填充 ddH 2 O 至最终体积为 10 mL（每个 co-IP）。
8. 2 ×工作 Laemmli 样品缓冲液
2 × Laemmli 样品缓冲液
× Laemmli 样品缓冲液添加 50 μL β-巯基乙醇。

D. 混音

1. Transformation PCR Mix（根据 Bio-Rad iProof HF 手册）
对于每个 PCR 反应：
25 µ L的 2 × iProof 预混液
2.5 µ L正向引物（来自 10 µM 库存）
2.5 µ L反向引物（来自 10 µM 库存）
10 ng pTF272 质粒
添加ddH 2 O 至最终体积为 50 µL 。
2. 菌落PCR混合液
对于每个 PCR 反应：
10 µ L 2 × iProof HF 预混液
1 µ L正向引物（来自10 µM 库存；最终浓度 0.5 µM ）
1 µ L反向引物（来自 10 µM库存；最终浓度 0.5 µM ）
1.5 µL SDS 释放的基因组组合
添加ddH 2 O 至最终体积为20 微升。
3. 聚乙二醇混合
240 μL 的 50% PEG 3350
36 μL 的 1 M LiOAc
10 μL ssDNA（10 毫克/毫升）
25 μL PCR 产物（使用 50 μL PCR 反应产物的一半）
将 ddH 2 O 添加到 350 的最终体积微升。

E. 试剂
1. 醋酸锂 (LiOAc)
对于每个酵母转化反应：
1 M LiOAc 库存中的 ddH 2 O 稀释）
最终体积为 1 mL。
2. 1% 乙酸双氧铀
10 mg 醋酸双氧铀盐
添加 ddH 2 O 至 1 mL 的最终体积。
*准备注意事项：
● 通过涡旋混合并在 37 °C下孵育溶液2 小时直至溶解。
● 使用 0.22 µm 孔径膜过滤器进行过滤。
● 将最终解决方案分装成 250 μL 等分试样。
● °C 下储存在不透明管中。
*有害物质：醋酸铀是一种放射性危害，需要采取安全预防措施。处理此材料时请参阅您的机构指南。

F. 板材和媒体

1. YPAD板
5.5克酵母提取物
11 克蛋白胨
28 毫克腺嘌呤（注意：不需要腺嘌呤来支持 BY4741 酵母菌株的生长。我们用它来支持其他酵母菌株。）
11克琼脂
50 mL 无菌 20% 葡萄糖
添加 ddH 2 O 至 500 mL 的最终体积。
高压灭菌，让培养基冷却至 55 – 60°C ，然后倒入无菌培养皿中。让琼脂在室温下凝固，然后将培养皿储存在4 °C 下。
2. YPAD + 潮霉素板
遵循 YPAD 板配方。
高压灭菌后，让培养基冷却至 55 – 60°C ，然后在倒盘前加入潮霉素 B 至终浓度为 0.3 mg/mL。
注意: 潮霉素 B 是有毒的, 在引擎盖中处理。
3. YPD液体培养基（每升）
20 克蛋白胨
20 克葡萄糖（葡萄糖）
10克酵母
将 ddH 2 O 添加到 1 L 的最终体积，然后进行高压灭菌。

致谢

这项工作得到了 PSS（NIH R35 GM133772、R25 EY029124）、IC（ NIH F31 CA254427 ）、DM（NIH Ruth L. Kirschstein 机构国家研究服务奖 T32GM122740）和 HMD（NIH Ruth L. Kirschstein 机构国家研究）的资助服务奖 T32GM122740）。该协议源自 Shen 等人报道的原始研究。 (2015) 和 Cooney 等人。（2019）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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