材料与试剂
1. 100 × 15 mm 培养皿（Corning® 、 Falcon® ，目录号： 351029 ）
2. 10 号一次性手术刀（Fisher Scientific，Feather TM ，目录号：08-927-5A）
3. MACS® SmartStrainers 30 μ m（Miltenyi Biotec，目录号：130-110-915 ）
4. FlowMi TM 40 μ m 移液器吸头过滤器（Bel-Art，目录号：H13680-0040）
5. 15 mL Falcon TM锥形离心管（Corning® ，目录号：352096 ）
6. 50 mL Falcon TM锥形离心管（Corning® ，目录号：352070 ）
7. DNA LoBind ® 1.5 mL 微量离心管（Eppendorf，目录号：022431021）
8. Fisherbrand TM镊子/镊子（Fisher Scientific，目录号：12-000-128）
9. Countess 细胞计数室载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：C10228）
10. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，1 ×不含钙和镁，pH 7.4（Corning® ，目录号：21-040-CM ）
11. 无核酸酶水（未经 DEPC 处理）（Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：AM9932）
12. IGEPAL ® CA-630（Millipore Sigma，目录号：18896-50ML）
13. 氯化钠（NaCl）（Millipore Sigma，目录号：S5886-500G）
14. 氯化镁（MgCl 2 ）（Millipore Sigma，目录号：M2393-100G）
15. 牛血清白蛋白（BSA）（Millipore Sigma，目录号：A8806-5G）
16. Hoechst 33342 10 mg/mL 溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）
17. Protector RNase 抑制剂（Millipore Sigma，目录号：3335402001）
18. Trizma®盐酸盐溶液 (Tris-HCl) 1 M pH 7.4（Millipore Sigma，目录号：T2194 ）
19. 5 M NaCl 原液（参见食谱）
20. 1 M MgCl 2原液（参见食谱）
21. 10% IGEPAL （见食谱）
22. 0.1%裂解缓冲液（见配方）
23. 洗涤和重悬缓冲液 (WRB) （参见配方）
24. Hoechst 染色缓冲液（参见配方）

设备
1. 冷冻台式离心机
注意：与固定角转子离心机相比，使用吊桶式转子进行离心有助于提高细胞核产量。
2. Countess II FL 自动细胞计数仪，或等效的细胞计数方法
3. 安捷伦生物分析仪

程序
A. 准备材料和试剂
1. 在长方形冰盘和冰桶中装满冰块。
2. 准备裂解缓冲液、洗涤和再悬浮缓冲液 (WRB)、Hoechst 染色缓冲液和 PBS。将这些试剂置于冰上。
3. 将台式离心机设置为 4 °C ，并在使用前使其冷却。
4. 将 15 mL Falcon 管标记为样品和上清液废物。
5. 保持钳子和手术刀冷藏。
6. 将组织冷冻在干冰上直至裂解以避免解冻，因为这会导致 RNA 降解。
注意：理想情况下，肝脏生物样本应在切除后立即快速冷冻和冷冻保存，以防止降解。组织可以储存在 -80°C 或液氮中直至使用。

B. 裂解

1. 在生物安全柜中执行所有裂解步骤。
2. 每 100 毫克组织添加 2 mL 的冰冷裂解缓冲液到冰锅中冰上的培养皿中。
3. 使用一套干净的钳子，将快速冷冻的活检转移到盘子上的裂解缓冲液中。在将活检放入裂解缓冲液之前，不要让活检解冻（图 2A）。
图 2. 肝组织活检的手术刀均质化。 (A) 在裂解缓冲液中孵育肝活检。 (B) 5 分钟孵育和用手术刀手动分离后的肝活检。

4. 让组织在裂解缓冲液中解冻 5 分钟。
注意：如果观察到明显的细胞核团块，则可能会减少裂解时间以防止损坏核膜。
5. 使用一对钳子和手术刀切碎裂解缓冲液中的组织。组织应切碎成 2–4 毫米的碎片（图 2B）。
6. 使用 5 mL 血清移液器，将 2 mL 的冰冷 PBS 添加到盘子上的组织裂解物中。通过轻轻上下吹打 10 次来混合。
7. 将裂解液吸出并通过 30 μ m 智能过滤器过滤到 15 mL 锥形离心管中。
C. 洗

1. °C 下以 500 × g离心组织裂解物5 分钟。在不干扰颗粒的情况下去除上清液。
注意：在此和随后的洗涤步骤中可能看不到颗粒（图 3）。必须注意不要干扰和吸入颗粒。可使用 5 mL 血清移液器去除大部分上清液，然后使用 1,000 μL 移液器小心去除剩余的裂解液。

图 3.裂解后出现一小块细胞核。该图显示了裂解、过滤和离心后的一小块细胞核。离心后可能看不到沉淀。

2. 添加 1 mL 的冰冷 WRB，并通过轻轻上下移液 10-20 次来重新悬浮颗粒。
3. 通过 30 μ m 智能过滤器将悬浮液过滤到新的 15 mL 锥形离心管中。
注意：将过滤器倾斜一个小角度，并在角落处移液，以允许气流并减少体积损失。如果悬架没有通过，请轻轻敲击过滤器。
4. °C 下以 500 × g离心5 分钟。使用1,000 μL 移液器，在不干扰沉淀的情况下完全去除上清液。
5. 添加 70 μL 的冰冷 WRB。通过轻轻上下吹打 10-20 次来重新悬浮沉淀。将细胞核悬浮液转移到 1.5 mL LoBind 微量离心管中。
注意：与 10 ×核分离方案相比，我们的方案仅包括一个洗涤步骤，以适应核产量低的样品并减少运行时间。如果样品被污染并且产量足够高（见下文），则可以包括额外的洗涤步骤。

D. 细胞核计数

1. 将 10 μL 的细胞核悬浮液与 10 μL 的 Hoechst 染色缓冲液混合在 PCR 管中。
2. 将 10 μL 染色的细胞核悬浮液转移到 Countess 细胞计数室玻片上。
3. 使用 Countess II FL 自动细胞计数器评估悬浮液的浓度和质量（图 4）。
注意：细胞核的细胞计数和质量评估可以使用自动细胞计数器或手动完成。我们建议使用荧光 DNA 染色剂（例如 Hoechst 33342 或 DAPI）从组织碎片中辨别细胞核。或者，可以使用台盼蓝染色和明场下的可视化。然而，这使得对核浓度的可靠估计具有挑战性，尤其是在核不完整的情况下。

图 4. 离体核的赫斯特染色和成像。与 Countess 相比，在 (A) 明场和 (B) 荧光赫斯特染色下血细胞计数器中间正方形的细胞核显微图像显示提供更高的分辨率和比例。在 (B) 中，标记了单线态、双线态和退化核的示例。

4. 如果细胞核浓度过高，用 WRB 稀释以达到每微升 1,000 个细胞核的目标浓度。对于将核加载到 10 × Chromium Controller 中，浓度范围限制为每微升 100-2,000 个核，推荐的目标浓度为每微升 700-1,200 个核。如有必要，用 WRB 稀释以降低浓度。
5. 如果细胞核悬浮液含有大量碎片或双联体和聚集体，则通过重复步骤 C2 - C5 执行额外的洗涤步骤。
注意：更高水平的碎片和核聚集体，尤其是那些直径大于 50 m 的碎片和核聚集体，导致堵塞微流体通道的可能性更高，从而导致润湿失败。但是，请注意，洗涤步骤可能会导致大约 50% 的产量显着损失。使用 40 m 移液器吸头滤网代替 30 m 智能滤网有助于防止体积损失，但可能会发生堵塞。离心速度和旋转时间也可以减少，例如在 4 分钟时减少到 400 × g ，以帮助防止核聚集体的形成。

E. 单核RNA-seq

1. 准备悬浮液以加载预定数量的细胞核。悬浮液可以在无核酸酶的水中稀释，以达到要加载的目标核数。对于 10 ×溶液，请参阅相应的 10 × 用户指南，了解给定悬浮液浓度的核回收数。
注意：加载更多数量的核将导致更高的双峰率。双峰率大致遵循泊松过程(McGinnis 等。 , 2019)并且可以根据加载的原子核数量预测速率。
2. 对于 10 ×解决方案，执行相应 10 ×用户指南中详述的单细胞方案。如果使用其他平台，例如 drop-seq (Macosko et al., 2015) ，则应相应调整协议。简而言之，这些步骤包括 1) 液滴/珠形成、2) 逆转录、3) cDNA 扩增和 4) 文库构建。每个细节取决于具体的方法和技术。
注意：尽快开始单细胞协议。液滴乳化和逆转录应该在分离后的几个小时内开始。
用于扩增 cDNA 的 PCR 循环数是实验和样品特异性的，但我们建议使用更高的循环数以适应细胞核与细胞相比较低的 RNA 产量。请参阅单细胞协议以了解适当的范围。对于 10×，建议使用 12 或 13 个循环。
3. 使用安捷伦生物分析仪评估 cDNA 和测序文库的质量。
注意：理想情况下，应该有一个以 1,000 到 1,500 个碱基对为中心的平滑峰。然而，来自人类肝脏组织的 RNA 容易降解，因此 cDNA 痕迹可以显示低于 1,000 个碱基对的显着峰（图 5）。

图 5. 来自冷冻肝组织的 snRNA-seq 文库的代表性生物分析仪迹线。图显示了来自安捷伦生物分析仪磁带站的代表性 cDNA 迹线。该冷冻肝组织样本显示 RNA 降解，大多数 cDNA 片段的长度低于 1,000 个碱基对。

F. 测序

1. 使用适当的平台对库进行排序。对于 Illumina 测序，选择通道数以实现每个核 20,000–50,000 次读取的读取深度。
注意：每个细胞核的目标读取深度将取决于所需的覆盖率和样本中的 RNA 量。通常，较高的测序深度对较低表达的基因具有较高的灵敏度。具有大量 RNA 的样本将需要更高的测序深度来分析低表达基因。相比之下，RNA 含量低的样品将在较低的测序深度下达到饱和。

数据分析

对于比对和基因量化，我们建议使用 STARsolo （Dobin 等人，2013 年；Kaminow 等人，2021 年）。如果存在显着的 RNA 降解，则可以修剪适配器、polyA 尾巴和模板转换寡核苷酸。来自冷冻组织的原始 snRNA-seq 数据通常需要质量控制过滤和处理。条形码等级图可以帮助评估细胞核和 RNA 降解的质量和程度。如果不容易辨别肘点和计数阈值，则可以使用 DIEM （Alvarez 等人，2020 年）或 EmptyDrops （Lun 等人，2019 年）根据其基因计数分布过滤液滴。我们关于肝脏 snRNA-seq 的出版物（Alvarez 等人，2022 年；Rao 等人，2021 年）提供了使用 DIEM 过滤液滴的详细信息（Alvarez 等人，2020 年）。液滴过滤后，可以使用 Seurat （Stuart 等人，2019 年）或其他方法（Yu 等人，2022 年）对细胞核进行聚类ADDIN CSL_CITATION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemData":{"DOI":"10.1016/j.cell.2019.05.031","ISSN":"0092-8674","abstract":"Single-cell transcriptomics has transformed our ability to characterize cell states, but deep biological understanding requires more than a taxonomic listing of clusters. As new methods arise to measure distinct cellular modalities, a key analytical challenge is to integrate these datasets to better understand cellular identity and function. Here, we develop a strategy to ?anchor? diverse datasets together, enabling us to integrate single-cell measurements not only across scRNA-seq technologies, but also across different modalities. After demonstrating improvement over existing methods for integrating scRNA-seq data, we anchor scRNA-seq experiments with scATAC-seq to explore chromatin differences in closely related interneuron subsets and project protein expression measurements onto a bone marrow atlas to characterize lymphocyte populations. Lastly, we harmonize in situ gene expression and scRNA-seq datasets, allowing transcriptome-wide imputation of spatial gene expression patterns. Our work presents a strategy for the assembly of harmonized references and transfer of information across datasets.","author":[{"dropping-particle":"","family":"Stuart","given":"Tim","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Butler","given":"Andrew","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Hoffman","given":"Paul","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Hafemeister","given":"Christoph","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Papalexi","given":"Efthymia","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Mauck III","given":"William M","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Hao","given":"Yuhan","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Stoeckius","given":"Marlon","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Smibert","given":"Peter","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Satija","given":"Rahul","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""}],"container-title":"Cell","id":"ITEM-1","issue":"7","issued":{"date-parts":[["2019","6","13"]]},"note":"doi: 10.1016/j.cell.2019.05.031","page":"1888-1902.e21","publisher":"Elsevier","title":"Comprehensive Integration of Single-Cell Data","type":"article-journal","volume":"177"},"uris":["http://www.mendeley.com/documents/?uuid=508dc0ae-2fff-3208-80a5-2e76ea1a027b"]}],"mendeley":{"formattedCitation":"(Stuart et al., 2019)","plainTextFormattedCitation":"(Stuart et al., 2019)","previouslyFormattedCitation":"(Stuart et al., 2019)"},"properties":{"noteIndex":0},"schema":"https://github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json"}。

适应不同的组织样本
该协议中的步骤针对快速冷冻的肝组织样本进行了优化。但是，我们的协议也可以针对其他样本类型进行优化。两个关键的优化领域是均质化和清洗。用手术刀切碎有助于保持细胞核的完整性并减少环境 RNA 污染。但是，可以测试其他均质化方法，例如 dounce 研磨机，以帮助提高产量。第二个优化领域包括洗涤步骤的数量和体积。我们仅包括一个带有 1 mL 缓冲液的洗涤步骤，以最大限度地减少浓度损失。如果样本类型中存在更多数量的细胞核（每微升 > 1,000 个细胞核），则可以包括额外的洗涤步骤以减少组织碎片。对该方法的进一步优化将涉及平衡产量和质量，其中更大的均质化和更少的洗涤提高产量并降低质量。

肝组织的低温保存和速冻
肝组织的适当低温保存和快速冷冻对于确保高质量 RNA 和完整的细胞核至关重要。对于 snRNA-seq，避免 RNA 降解至关重要。因此，必须尽量减少缺血时间，并尽快冷冻组织。还必须减少冰晶的形成，因为这可能会损坏细胞核并降低产量。完整的单核悬浮液将生成最高质量的 snRNA-seq 数据。因此，快速均匀地冷冻组织以保持形态的快速冷冻方法是首选。一旦冷冻，组织可以储存在-80 °C，或者，为了长期储存，在液氮的气相中。只有在协议开始后，组织才应在裂解缓冲液中解冻。

食谱
1. 5 M NaCl 储备液
将 2.922 克 NaCl 添加到 10 mL 水中。

2. 1 M MgCl 2原料
将 2.0331 g MgCl 2 · 6H 2 O 添加到 10 mL 水中。

3. 10% 伊帕尔
将 100 μ L 的 IGEPAL 添加到 900 μ L 的 PBS 中。

4. 0.1% 裂解缓冲液
向 9.77 mL 无核酸酶水中加入
100 μ L 的 1 M Tris-HCl
20 μ L 的 5 M NaCl 库存
10 μ L 的 1 M MgCl 2储备液
100 μ L 的 10% IGEPAL
75 μ L 的 40 U/ μ L RNase 抑制剂。
注意：裂解缓冲液中的 RNase 抑制剂有助于防止裂解步骤中的 RNA 降解。

5. 洗涤和重悬缓冲液 (WRB)
a. 在 15 mL 锥形离心管中加入 200 mg BSA。
b. 添加多达 10 mL 的 1 × PBS。
c. 添加 50 μ L 的 40 U/ μ L RNase 抑制剂。

6. 赫斯特染色缓冲液
a. 将 10 μ L 的 10 mg/mL Hoechst 染色剂添加到 990 μ L 中以创建库存 A。
b. 将 2 μ L 的库存 A 添加到 98 μ L 的 PBS 中以获得工作解决方案。

致谢

我们感谢参与肝 HCC 队列的个人（Alvarez 等人，2022 年）。这项工作得到了 NIH 赠款 R01HG010505 和 R01DK132775 的支持。 MA 得到了 HHMI Gilliam 奖学金的支持。

参考
Aizarani, N.、Saviano, A.、Sagar、Mailly, L.、Durand, S.、Herman, JS、Pessaux, P.、Baumert, TF 和 Grun, D.（2019 年）。人类肝细胞图谱揭示了异质性和上皮祖细胞。自然572(7768)：199-204。
Alvarez, M., Rahmani, E., Jew, B., Garske, KM, Miao, Z., Benhammou, JN, Ye, CJ, Pisegna, JR, Pietiläinen, KH, Halperin, E., 等。（2020）。使用半监督机器学习分类器 DIEM 增强基于液滴的单核 RNA-seq 分辨率。科学报告10(1)：11019。
Alvarez, M., Benhammou, JN, Darci-Maher, N., French, SW, Han, SB, Sinsheimer, JS, Agopian, VG, Pisegna, JR 和 Pajukanta, P. (2022)。人肝单核和单细胞 RNA 测序鉴定了一种影响生存的肝细胞癌相关细胞类型。基因组医学14(1)：50。
Andrews, TS, Atif, J., Liu, JC, Perciani, CT, Ma, XZ, Thoeni, C., Slyper, M., Eraslan, G., Segerstolpe, A., Manuel, J., 等。 (2022)。人类肝脏的单细胞、单核和空间 RNA 测序可识别胆管细胞和间充质异质性。 Hepatol Commun 6(4)：821-840。
Ben-Moshe, S. 和 Itzkovitz, S.（2019 年）。哺乳动物肝脏的空间异质性。 Nat Rev Gastroenterol Hepatol 16(7)：395-410。
Dobin, A.、Davis, CA、Schlesinger, F.、Drenkow, J.、Zaleski, C.、Jha, S.、Batut, P.、Chaisson, M. 和 Gingeras, TR (2013)。 STAR：超快通用 RNA-seq 对齐器。生物信息学29(1)：15-21。
Drissen, R.、Buza-Vidas, N.、Woll, P.、Thongjuea, S.、Gambardella, A.、Giustacchini, A.、Mancini, E.、Zriwil, A.、Lutteropp, M.、Grover, A ., 等。 (2016)。通过单细胞 RNA 测序鉴定出不同的骨髓祖细胞分化途径。 Nat Immunol 17(6)：666-676。
Habib, N.、Avraham-Davidi, I.、Basu, A.、Burks, T.、Shekhar, K.、Hofree, M.、Choudhury, SR、Aguet, F.、Gelfand, E.、Ardlie, K. ,等人(2017)。大规模平行单核 RNA-seq 与 DroNc-seq。国家方法14(10)：955-958。
Halpern, KB, Shenhav, R., Matcovitch-Natan, O., Toth, B., Lemze, D., Golan, M., Massasa, EE, Baydatch, S., Landen, S., Moor, AE, 等阿尔。 (2017)。单细胞空间重建揭示了哺乳动物肝脏的整体分工。自然542(7641)：352-356。
Kaminow, B.、Yunusov, D. 和 Dobin, A.（2021 年）。 STARsolo：单细胞和单核 RNA-seq 数据的准确、快速和通用的映射/量化。 bioRxiv ：2021.2005.2005.442755。
Kuppe, C.、Ibrahim, MM、Kranz, J.、Zhang, X.、Ziegler, S.、Perales-Paton, J.、Jansen, J.、Reimer, KC、Smith, JR、Dobie, R. 等阿尔。 (2021)。解码人肾纤维化中的肌成纤维细胞起源。自然589(7841)：281-286。
Larson, A. 和 Chin, MT (2021)。一种对正常成人室间隔心脏组织进行冷冻保存和单核 RNA 测序的方法揭示了细胞多样性和功能。 BMC 医学基因组学14(1)：161。
Lun, ATL、Riesenfeld, S.、Andrews, T.、Dao, TP、Gomes, T.，第一届人类细胞图谱的参与者，J. 和 Marioni, JC (2019)。 EmptyDrops：在基于液滴的单细胞 RNA 测序数据中区分细胞和空液滴。基因组生物学20(1)：63。
Macosko, EZ, Basu, A., Satija, R., Nemesh, J., Shekhar, K., Goldman, M., Tirosh, I., Bialas, AR, Kamitaki, N., Martersteck, EM, 等。 (2015)。使用纳升液滴对单个细胞进行高度平行的全基因组表达谱分析。单元格161(5)：1202-1214。
MacParland, SA, Liu, JC, Ma, XZ, Innes, BT, Bartczak, AM, Gage, BK, Manuel, J., Khuu, N., Echeverri, J., Linares, I., 等。 (2018)。人类肝脏的单细胞 RNA 测序揭示了不同的肝内巨噬细胞群。 Nat Commun 9(1)：4383。
McGinnis, CS、Murrow, LM 和 Gartner, ZJ (2019)。 DoubletFinder：使用人工最近邻法检测单细胞 RNA 测序数据中的双峰。细胞系统8(4)：329-337 e324。
Rao, S., Yang, X., Ohshiro, K., Zaidi, S., Wang, Z., Shetty, K., Xiang, X., Hassan, MI, Mohammad, T., Latham, PS, 等人. (2021)。 beta2-spectrin (SPTBN1) 作为饮食诱发的肝病和预防癌症发展的治疗靶点。 Sci Transl Med 13(624)：eabk2267。
Stuart, T.、Butler, A.、Hoffman, P.、Hafemeister, C.、Papalexi, E.、Mauck, WM, 3rd、Hao, Y.、Stoeckius, M.、Smibert, P. 和 Satija, R. （2019）。单细胞数据的综合整合。单元格177(7)：1888-1902 e1821。
Trefts, E.、Gannon, M. 和 Wasserman, DH (2017)。肝脏。当前生物学27(21)：R1147-R1151。
Villani, AC, Satija, R., Reynolds, G., Sarkizova, S., Shekhar, K., Fletcher, J., Griesbeck, M., Butler, A., Zheng, S., Lazo, S., 等阿尔。 (2017)。单细胞 RNA-seq 揭示了新型人类血液树突状细胞、单核细胞和祖细胞。科学356(6335)。
Xu, Y., Mizuno, T., Sridharan, A., Du, Y., Guo, M., Tang, J., Wikenheiser-Brokamp, KA, Perl, AT, Funari, VA, Gokey, JJ, 等人. (2016)。单细胞 RNA 测序鉴定了上皮细胞在特发性肺纤维化中的不同作用。 JCI 洞察1(20)：e90558。
Yu, L.、Cao, Y.、Yang, JYH 和 Yang, P. (2022)。从单细胞 RNA 测序数据估计细胞类型数量的基准聚类算法。基因组生物学23(1)：49。
Zhang, Q., He, Y., Luo, N., Patel, SJ, Han, Y., Gao, R., Modak, M., Carotta, S., Haslinger, C., Kind, D., et阿尔。（2019）。肝细胞癌中单个免疫细胞的景观和动力学。单元格179(4)：829-845 e820。