材料与试剂

1. 铝箔
2. 厌氧气氛生成袋，Oxoid TM AnaeroGen TM 2.5 L 小袋（Thermo Scientific；目录号：OXAN0025A）
3. AnaeroPack TM 2.5 L 矩形罐（Thermo Scientific，目录号：R685025）
4. Falcon TM 15 mL 锥形管（Corning TM ，目录号： 14-959-53A ）
5. 保护实验室瓶 (DURAN , PSC-47-11619)
6. 厌氧系统/圆柱形广口瓶（BD GasPak TM 150 Systems，目录号：11-816）
7. 微量离心管，1.5 mL（Pierce TM ，目录号：69715）
8. 带透明盖的培养皿（Fisherbrand TM ，目录号：S33580A）
9. 手术胶带（微孔，可通过美国亚马逊获得）
10. 真空封口袋（Wevac，美国亚马逊有售）
11. 厌氧指示剂（Thermo Scientific，目录号：BR0055B）
12. 凡士林® （可通过美国亚马逊购买）
13. 半强度 MS 培养基（见食谱；修改自Cheng 等人， 2003 年）
a. Murashige 和 Skoog 基础盐混合物（MS）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
b. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S1888）
c. 琼脂（Sigma-Aldrich，目录号： A1296 ）
d. 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
e. 氢氧化钾 (KOH)（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
14. 20% (V/V) 漂白剂（见配方）
市售漂白剂（Clorox 浓缩家用漂白剂；可通过美国亚马逊购买）
15. 80% (V/V) 丙酮（见配方）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号： 179124 ）

植物材料
最近，我们已经确定液泡膜定位的 H+/Ca 转运蛋白CAX1 的缺失赋予了对缺氧的耐受性。另一个 H+/Ca 转运蛋白CAX3的突变对缺氧敏感，其方式与野生型 Colombia-0 (Col-0) (Yang 等。 , 2022) 。在本研究中，我们使用了相同的三个突变体（两个cax1等位基因和一个cax3突变体）以及 Col-0 来标准化缺氧测定条件；详情如下。
1. 拟南芥野生型 (Col-0)
2. 拟南芥突变体：
cax1-1 - CS25435 (程等人， 2003 年）
出租车1-2 - SALK_021486 （卡塔拉等人，2003 年）
cax3-1 - CS25429 (程等人， 2003 年）

设备

1. Varian Cary 50 Bio 紫外可见分光光度计
2. 层流通风罩（SteriGard Hood，The Baker Company，Main，US）
3. 移液器（GILSON，PIPETMAN CLASSIC P1000，目录号：F123602 和 GILSON，PIPETMAN L P20L，2 – 20 µL，目录号：FA10003M）
4. 尼康 D80 数码单反相机（尼康公司，日本东京）
5. 植物生长室（Geneva Scientific，CU-36L6组织培养室）
6. 热塑料袋封口机（Thomas Scientific，目录号：1147J64）

程序

A. 准备半强度 MS 培养基板和 20% (V/V) 漂白剂（参见食谱）

B. 种子杀菌

1. 将每个基因型的 100–200 个种子转移到单独的微量离心管中。
2. 在管中加入 1 mL 的 20% (V/V) 漂白剂。
3. 通过短暂的涡旋彻底混合种子。
4. 孵育漂白剂溶液中的种子 15 分钟，偶尔涡旋。
5. 短暂旋转，使种子沉降到试管底部。在无菌环境中执行其余步骤。
6. 用 1 mL 移液器小心地倒出漂白剂溶液。有一些种子（发育不良/空种子）漂浮在漂白液上清液上是正常的。
7. 向种子中加入 1 mL 无菌水，并通过倒置管子 3–4 次将其彻底混合。
8. 除去水并向种子中加入新鲜的无菌水。
9. 再重复步骤 B7–8 五次以去除任何漂白剂痕迹。
10. 向种子中加入 1 mL 无菌水。在此阶段，您可以储存种子或立即进行种子接种。种子可以在 4°C 下储存一周而不会失去发芽频率。

C. 种子电镀

1. 将半强度 MS 介质板和灭菌种子置于室温。种子接种在层流罩中完成。使用 20 μL 移液器，绘制经过消毒的种子，使它们在移液器尖端中单独排列（使用切割尖端）。
2. 小心地将种子放在所需位置的琼脂板上（如果两颗种子聚集在一起，加入一小滴水，将种子分开，取出一颗种子，然后将其放在另一个位置）。您可以在一个盘子中放置多达 50-60 颗种子。确保种子等距放置。
3. 将板在流罩表面打开 2-3 分钟，以干燥种子中的水。
4. 用手术胶带盖住盘子，将它们保存在植物生长室中，光照时间为 12 小时，温度为 22°C，夜间光照时间为 12 小时，温度为 20°C，持续三周。
注意：根据植物种类，缺氧测定的最佳植物大小/生长阶段可能会有所不同。我们建议根据植物种类修改协议，在植物生长的不同阶段进行缺氧测定，以获得最佳植物大小。对于拟南芥，该测定在植物生长的几个阶段进行，3 周龄的植物显示出最佳表型。烟草 ( Nicotiana tabacum ) 和番茄 ( Solanum lycopersicum )的初步数据表明，幼苗的缺氧条件与 3 周龄拟南芥的条件相同；然而，对水稻 ( Oryza sativa ) 和苜蓿 ( Medicago truncatula ) 品系的初步测试表明它们更耐缺氧，可能需要几天才能显示出敏感性。

D. 缺氧实验

1. 使用圆柱形罐（参见视频 1）：
a. 从培养皿中取出手术胶带。
b. 将板（九个板/叠）堆叠到厌氧系统/圆柱形罐（BD GasPak TM ）中。
c. 在罐子边缘涂上一层薄薄的凡士林，确保盒子密封良好。
d. 打开一小袋 AnaeroGen TM 2.5 L GasPak TM 把它放在旁边的罐子里。
e. 在 GasPak TM和板之间放置 2-3 张薄纸，以散发 GasPak TM产生的热量。
f. 拧紧广口瓶，盖上铝箔，室温避光孵育一定时间。
注意：根据植物种类，最佳缺氧处理时间可能会有所不同。我们建议通过对多个时期进行缺氧测定来修改基于植物物种的协议以获得最佳持续时间。对于拟南芥，该测定进行了 4、6、8 和 10 小时。在 8 小时，耐受和敏感的品系表现出最独特的表型。
g. 可选：在容器中放置厌氧指示剂以确保创建缺氧环境。
h. 缺氧处理后，在植物生长室中重新粘贴和孵育板，保持 12 小时光照和 22°C，12 小时夜间和 20°C 4-5 天。一旦表型清晰（4-5 天后），就拍摄板。

视频1. 使用“The Jar”进行缺氧治疗

2. 使用矩形 2.5 L AnaeroPack TM系统（参见视频 2）：
a. 从培养皿中取出手术胶带。
b. 将包含植物的培养皿排列在盒子中的两个堆栈（四个板/堆栈）中。
c. 在盒子边缘涂上一层薄薄的凡士林，确保盒子密封良好。
d. 打开一包 AnaeroGen TM 2.5 L GasPak TM并将其放入长方形盒子内的小隔间内；在 GasPak TM和板之间放置 2-3 张薄纸，以散发 GasPak TM产生的热量。
e. 用铝箔盖住罐子，在室温下避光孵育所需时间。
f. 缺氧处理后，将植物恢复到标准生长条件。 4-5 天后拍摄盘子。

视频2. 使用“The Box”进行缺氧治疗

3. 使用真空密封袋（参见视频 3）：
真空密封袋用于对少量板 (1–2) 进行缺氧。
a. 从培养皿中取出手术胶带。
b. 用铝箔盖住培养皿的两侧。
c. 将培养皿放在 Wevac 真空密封袋内的一层折叠薄纸上。
d. 打开一小袋 AnaeroGen TM 2.5 L GasPak TM并将其放在袋子内的薄纸下方。
e. 立即用热塑料袋封口机密封袋子，并在室温下孵育所需的时间。
f. 缺氧处理后，将板恢复到标准生长条件并在 4-5 天后拍照。

视频3. 使用“The Bag”进行缺氧治疗

E. 叶绿素估计（修改自Liang 等。 , 2017)

1. 在液氮中从缺氧前和缺氧后样品中研磨 50 毫克组织。
2. 在地面组织中加入 1 mL 的 80% (V/V) 丙酮，并通过涡旋彻底混合。
3. 在室温下孵育 30 分钟。
4. 以 17,900 × g离心 1分钟。
5. 将上清液转移到 15 mL 离心管中。
6. 再重复步骤 E2–5 三次或直到沉淀物变成无色。
7. mL的最终体积中。
8. 使用分光光度计读取 645 和 663 nm 波长下汇集的上清液的吸光度。
9. 使用 Arnon 方程 [总叶绿素 (μg/mL) = 20.2 (A645) + 8.02 (A663)] 计算样品中的总叶绿素。
10. 至少重复实验两次，并将数据表示为平均值±SE（标准误差）。

数据分析

缺氧实验的结果被确认三次，每次测试 13-15 颗种子。
对三个生物复制进行叶绿素估计，并表示为平均值±SE（标准误差）。

笔记

虽然我们没有看到任何优势或劣势，但我们观察到缺氧结果的微小变化，具体取决于所使用的腔室、植物年龄、缺氧持续性和昼夜条件，如下所示。

1. 三个缺氧室的比较表明，矩形盒和真空密封袋比圆柱形罐产生更一致的响应。圆柱形罐子有时会产生更多的可变性，因为靠近气体包的植物有时会比放置在同一罐子中距离气体包较远的植物表现出更高的敏感性。因此，在这里我们使用矩形盒/真空密封袋进行后续实验。体积较小的容器可能会产生更快的缺氧条件；然而，这些差异不足以在拟南芥的这些测定条件下产生表型变化。
2. 植物年龄：使用突变体和对照，我们评估了植物年龄对缺氧耐受性的影响（Boyes 等。 , 2001) 。 9 莲座叶期（21 日龄）和 6-7 莲座叶期（18 日龄）的植物比 5 莲座叶期（14 日龄；图 1）的植物更耐受。对于所有剩余的测定，使用处于 7 莲座叶期（18 天龄）的植物。

图 1. 植物年龄对缺氧反应的影响。属于 5 莲座丛 (A)、7 莲座丛 (B) 和 9 莲座丛 (C) 叶期的植物在夜间暴露于厌氧环境 9 小时。实验重复三次，每次重复分析 13-15 株植物的每个突变体。 Col-0（野生型）、 cax1-1和cax1-2 （在不同位置插入 T-DNA 的cax1的两个等位基因）和cax3 （ cax3突变体）。有关更多信息，包括统计比较和转录组学和蛋白质组学数据分析，请参阅 Yang 等人。 (2022)。

3. 治疗持续时间：然后测定缺氧持久性的影响。在矩形 2.5 L AnaeroPack TM系统中，在处理 6 小时后立即观察到表型差异（图 2A）。随着孵育时间的延长，表型变得非常清晰。在缺氧处理 8-9 小时时，敏感基因型和耐受基因型的表型之间存在明显差异。两种敏感基因型（Col-0 和cax3 ）在缺氧后无法存活（图 2B-E）。然而，当孵育延长 10 小时时，耐受基因型（ cax1-1和cax1-2 ）的存活率显着降低（图 2F）。缺氧后的存活率是通过估计缺氧处理后五天的残留叶绿素含量间接测量的。如图 2G 所示，与 Col-0 和cax3相比， cax1表现出较少的叶绿素损失。

图 2. 治疗持续时间对缺氧反应的影响。属于 7 莲座叶期（18 天大）的植物暴露于厌氧环境 6 (A)、7 (B)、8 (C)、8.5 (D)、9 (E) 和 10 小时 (F)白天。基因型对缺氧的差异反应以叶绿素损失 (G) 表示。 cax1表现出比 Col-0 和cax3更少的叶绿素损失。有关包括叶绿素测量、统计比较以及转录组学和蛋白质组学数据分析在内的更多信息，请参阅 Yang 等人。 (2022)。

4. 昼夜变化：然后我们试图更好地了解光周期如何影响缺氧耐受性。虽然缺氧处理总是在黑暗中进行，但白天处理的植物比夜间处理的植物略微敏感（图 3）。因此，在我们的实验中始终使用夜间缺氧处理而不打扰昼夜节律。

图 3. 昼夜治疗对缺氧反应的影响。属于 7 莲座叶期（18 天龄）的植物在夜间（A）暴露于厌氧环境 8.5 小时，白天 8.5 小时（B），夜间 9 小时（C），9 小时白天 (D)。

通过限制上述参数的变化，可以最大限度地减少特定基因型对缺氧反应的差异。尽管基因型内叶绿素损失的程度略有不同（图 4），但该测定清楚地区分了耐受基因型和易感基因型。
我们在这项研究中使用了拟南芥的检测方法，但这种方法也应该适用于其他植物物种。

图 4. 类似外部条件下缺氧反应的变化。属于 7 莲座叶期（18 天龄）的植物在夜间暴露于厌氧条件。

溶液配方

1. 半强度 MS 介质
（准备 1 L 介质；足以准备大约 20 个板）
将以下成分溶解在 800 mL 的双蒸水中：
2.15 克 MS 介质
5克蔗糖
500 毫克 MES
通过在搅拌的同时添加 KOH 将 pH 值调节至 5.6–5.8。将体积补足至 1 L。
将 8% (W/V) 琼脂添加到两个 500 mL 瓶中。
将介质平均分配到每个装有琼脂 (500 mL) 的瓶子中。
通过在 121°C 下高压灭菌 20 分钟对介质进行灭菌。
介质冷却后，将每个瓶子倒入层流罩中的 10 个培养皿中。
将介质留在层流罩上 30 分钟，使其凝固。
培养基可在 4°C 下保存 2-3 周。将介质置于室温并在使用前检查板是否有任何污染。

2. 20%漂白剂 (V/V)
在 50 mL 离心管中将 10 mL 漂白剂与 40 mL 高压灭菌双蒸馏水混合。
通过倒置管子彻底混合。
漂白剂可在室温下保存 2-3 周。

3. 80% 丙酮 (V/V)
将 40 mL 的丙酮与 10 mL 的双蒸水混合。
通过颠倒管子或涡旋将其彻底混合。
该溶液可以在室温下储存在阻燃区域。

致谢

这项工作得到了国家科学基金会 (1557890)、美国农业部 (3092-51000-061-00D) 和国立卫生研究院 (R03 AI149201-02) 的赠款（对 KDH）的支持。此协议源自Yang 等。 (2022) 。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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