材料与试剂
1. 通用移液器吸头，10 µL（VWR，目录号：76323-396）
2. 通用移液器吸头，200 µL（VWR，目录号：76323-390）
3. 通用移液器吸头，1,250 µL（VWR，目录号：76323-456）
4. 微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
5. 1.7 mL 培养管（VWR，目录号：60818-689）
6. 50 mL 离心管（Celltreat，目录号：229421）
7. BioDot pure8 条 PCR 管（Dot Scientific，目录号：415-8PCR）
8. 100 mm TC 处理的细胞培养皿（Falcon，目录号：353003）
9. 组织培养板，6 孔，无菌（VWR，目录号：10062-892）
10. 组织培养板，12 孔，无菌（VWR，目录号：10062-894）
11. 组织培养板，24 孔，无菌（VWR，目录号：10062-896）
12. 500 mL 溶液瓶，无菌（Celltreat，目录号：229784）
13. 500 mL 瓶顶过滤器，无菌（Celltreat，目录号：229717）
14. 通用移液器吸头，10 µL，过滤，预灭菌（VWR，目录号：76322-528）
15. 通用移液器吸头，20 µL，过滤，预灭菌（VWR，目录号：76322-134）
16. 通用移液器吸头，200 µL，过滤，预灭菌（VWR，目录号：76322-150）
17. 通用移液器吸头，1,250 µL，过滤，预灭菌（VWR，目录号：76322-528）
18. 一次性血清移液管，2 mL（VWR，目录号：75816-104）
19. 一次性血清移液管，5 mL（VWR，目录号：89130-896）
20. 一次性血清移液管，10 mL（VWR，目录号：89130-898）
21. 一次性血清移液管，25 mL（VWR，目录号：89130-900）
22. HEK293T 细胞（来自斯坦福大学医学院 Gerald R Crabtree 博士的礼物）
23. HeLa细胞（斯坦福大学医学院Gerald R Crabtree博士赠送）
24. Q5 高保真 2 × Master Mix（New England BioLabs，目录号：M0492S）
25. Monarch® PCR & DNA 清理试剂盒（New England Biolabs，目录号：T1030S ）
26. Not I -HF 限制酶（New England BioLabs，目录号：R3189）
27. EcoR I -HF 限制酶（New England BioLabs，目录号：R3101S）
28. PmeI 限制酶（New England BioLabs，目录号：R0560S）
29. BbsI 限制酶（New England BioLabs，目录号：R0539S）
30. Hind III -HF 限制酶（ New England BioLabs，目录号：R3104S）
31. Kpn I -HF（ New England BioLabs，目录号：R3142）
32. CutSmart 缓冲液（ New England BioLabs，目录号：B7204）
33. Bst 2.0 DNA 聚合酶（New England BioLabs，目录号： M0537S)
34. SplintR 连接酶（New England BioLabs，目录号： M0375S)
35. ATP溶液（100 mM）（Thermo Scientific，目录号：R0441）
36. pCMV-dCas13-M3nls（Addgene，目录号：155366）
37. pC0043-PspCas13b-crRNA（Addgene，目录号：103854）
38. QIAquick 凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
39. 琼脂糖 I（Thermo Fisher Scientific，目录号：17852）
40. T4 DNA 连接酶反应缓冲液（New England BioLabs，目录号：B0202A）
41. T4 DNA 连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
42. 的 In-Fusion Snap Assembly 包（Takara，目录号：638952）
43. 1 kb 加 DNA 阶梯（New England BioLabs，目录号：N3200）
44. T4 多核苷酸激酶（New England BioLabs，目录号：M0201S）
45. TAE 缓冲液（Tris-acetate-EDTA）（50 × ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：B49）
46. 氨苄西林钠盐（Sigma，目录号：A9518）
47. 无核酸酶水（Sigma，目录号：BCCG1748）
48. Dulbecco 改良的 Eagle 培养基，高葡萄糖（Sigma，目录号：RNBK9791）
49. Opti-MEM 还原血清培养基 (OMEM)，GlutaMax 补充剂（Gibco，目录号：51985034）
50. 胎牛血清，优质选择（R＆D Systems，目录号：S11550）
51. Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen，目录号：11668019）
52. TRIzol 试剂（Invitrogen，目录号：15596026）
53. 氯仿：异戊醇 24:1（Sigma，目录号：MKCM1807）
54. 2-丙醇（Sigma，目录号：19516）
55. 乙醇（Fisher Bioreagents，目录号：BP28184）
56. RIPA 缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：89901）
57. 蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：78430）
58. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8537）
59. Pierce TM 660 nm 蛋白质测定试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：22660）
60. 2-巯基乙醇（Sigma，目录号：M6250）
61. 4 × Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610747）
62. EZ-Run 预染蛋白（Fisher Bioreagents，目录号：BP36011）
63. 4%–15% 预制聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，目录号：4561084）
64. 甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412-4）
65. 脱脂牛奶（Bio-Rad，目录号：1705016）
66. Tween-20 Surfact-Amps TM洗涤剂溶液（Thermo Scientific，目录号：PI85113）
67. 抗 HA 标签单克隆抗体（2-2.2.14）（Invitrogen，目录号：26183）
68. 抗旗标签单克隆抗体（M2）（Sigma，目录号：F1804）
69. 抗 Gapdh 抗体 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，目录号：5174）
70. 抗 FOXM1（A-11）（Santa Cruz，目录号：sc-271746）
71. 抗 SOX2 (E-4)（Santa Cruz，目录号：sc-365823）
72. 抗纽蛋白（E1E9V，1：1,000）（Cell Signaling Technology，目录号：13901）
73. 抗兔 IgG HRP 连接抗体（Cell Signaling Technology，目录号：7074）
74. 抗小鼠 IgG HRP 连接抗体（Cell Signaling Technology，目录号：7076）
75. Clarity TM Western ECL 底物（Bio-Rad，目录号：1705060）
76. 免疫印迹 PVDF 膜（Bio-Rad，目录号：1620177）
77. 4% 多聚甲醛（Thermo Fisher Scientific，目录号：J19943.K2）
78. Triton TM X-100 surfact-Amp TM洗涤剂溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：85111）
79. Alexa Fluor Plus 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：32723）
80. DAPI（Fisher Scientific，目录号：NBP2311561）
81. 放线菌素 D（Thermo Fisher Scientific，目录号：11805017）
82. RNA clean & concentrator-5（Zymo Research，目录号：R1014）
83. N6-甲基腺苷 (m 6 A) (D9D9W) 兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology，目录号：56593）
84. Pierce TM Protein G 磁珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：88848）
85. N6-甲基腺苷 5'-单磷酸钠盐（m 6 A 盐）（Sigma，目录号：M2780-10MG）
86. 蛋白酶 K 溶液，RNA 级（Invitrogen，目录号：25530049）
87. RNasin Plus核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2611）
88. 超纯牛血清白蛋白（ BSA），50 mg/mL（Invitrogen，目录号：AM2616）
89. 氯化锌（ZnCl 2 ）（Sigma，目录号：Z0152）
90. 0.5 M EDTA pH 8.0（Invitrogen，目录号：AM9260G）
91. 甲醛溶液（Sigma，目录号：F8775-500ML）
92. 抗 METTL3 抗体（Invitrogen，目录号：15073-1-AP）
93. 甘氨酸（Fisher bioreagents，目录号：BP181-1）
94. 氯化镁溶液，1 M（MgCl 2 ）（Sigma，目录号：M1028-100ML）
95. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma，目录号：L3771-500G）
96. 5 M 氯化钠 (NaCl)（Invitrogen，目录号：AM9759）
97. 1 M Tris-HCl，pH 7.0（Sigma，目录号：T1819-1L）
98. 1 M Tris-HCl，pH 7.4（Sigma，目录号：T2663-1L）
99. IGEPAL-CA-630（Sigma，目录号：I8896）
100. 乙酸钠（3 M），pH 5.5，无 RNase（I nvitrogen，目录号：AM9740）
101. Pierce RIPA 缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：89900）
102. 停止蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific，目录号：1861279）
103. PowerUp TM SYBR TM Green Master Mix（Thermo Fisher，目录号：A25778）
104. iScript cDNA 合成试剂盒（Bio-Rad，目录号：1708891）
105. A -050-5）
106. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D8418-100 mL）
107. Tris 碱基（Sigma，目录号：T1503-500 g）
108. 琼脂（Sigma，目录号： A6686）
109. LB 媒体（见食谱）
110. 含氨苄青霉素的 LB 板（见食谱）
111. 1 ×凝胶电泳缓冲液（见配方）
112. 1 ×膜转移缓冲液（见配方）
113. 1 × TBST 缓冲液（参见配方）
114. 碎片缓冲液，10×（参见配方）
115. 6 A-IP 研究的5× IP 缓冲区（参见食谱）
116. m 6 A 洗脱缓冲液（参见配方）
117. 用于 RNA 交联免疫沉淀的洗涤缓冲液（参见配方）
118. NT-2 缓冲液，5×（参见配方）
119. 蛋白酶 K 消化缓冲液（参见配方）

设备

1. 离心机 5424/5424R（Eppendorf，目录号：EP5404000537）
2. New Brunswick I26/I26R 可堆叠培养箱摇床（Eppendorf，目录号：VWR-89173-938）
3. Sorvall LYNX 6000 超高速离心机（Thermo Scientific，目录号：75006590）
4. 7900HT 快速实时 PCR 系统（Applied Biosystems，目录号：4329001）
5. ChemiDoc MP 成像系统（Bio-Rad，目录号：17001402）
6. C1000 触摸式热循环仪（Bio-Rad，目录号：1851148）
7. NanoDrop One 分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND-ONE-W4）
8. Bioruptor Pico 超声处理装置（Diagenode，目录号：B01060010）
9. 荧光显微镜（Agilent BioTek LFXSN，目录号：BTFLX）
10. Criterion TM Blotter（Bio-Rad，目录号：1704071）

程序

A. dCas13b -PYL-HA 质粒的克隆

1. 根据制造商的协议，使用通过 Q5 高保真 2 × Master Mix设计的底漆，使用 pCMV-dCas13b-M3nls 模板放大 dCas13b 片段。
2. 使用设计的引物通过 Q5 High-Fi保真度 2以 dCas9-PYL（由我们的前er组成员克隆的质粒）为模板放大 PYL [pyrabactin 抗性 (PYR)/PYR1-like] 片段× Master Mix根据制造商的协议。
3. 运行 0.8% DNA 琼脂糖凝胶以纯化上面使用QIAquick 凝胶提取试剂盒扩增的 DNA 片段。扩增片段 dCas13b 的大小为 3,147 bp ，PYL 片段的大小为 560 bp。
4. 通过在 37 °C下孵育2 小时，用 Hind III -HF 和 Kpn I -HF 限制酶线性化 1 μg backb质粒dCas13b- ALKBH5-HA，并通过运行 0.8% DNA 琼脂糖凝胶纯化线性化载体。线性化骨架的大小为 5,452 bp。
5. 使用In-Fusion Snap Assembly bundles for seamless DNA 克隆试剂盒中的 In-Fusion master mix 将 dCas13b 和 PYL 片段插入步骤 A4 中的线性化载体中，以获得 dCas13b-PYL-HA 质粒。用于 PCR 和测序的引物列于表 1，克隆方案如图 2 所示。
笔记：
a. 在 50 μL 的反应中设置 PCR 反应。简单地说，轻轻混合 10 µL 5 × Q5 反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTP 、2.5 µL 正向引物 (10 µM)、 2.5 µL 反向引物、100 ng 模板 ( 1 µL), 0.5 µL 正向引物 Q5 高保真 DNA 聚合酶, 和 32.5 µL 无核酸酶水。在 98°C 下运行 PCR 反应30 秒，34 个循环98 °C 10 秒 + 60°C 30 秒 + 72°C 90 秒，最后 72°C 120 秒。
b. 有许多含有 PYL 片段的质粒可以从 Addgene 获得用于扩增目的。例如：PYL1-nTEVp（目录号：119213）。

表 1. 用于克隆和测序 dCas13b-PYL-HA 质粒的引物信息
用于克隆和测序的引物序列 (5 ′ -3 ′ )
用于扩增 dCas13b 片段的正向引物 cgtttaaacttaagcttGCCACCatgaaacggacagccgacgga
用于扩增 dCas13b 片段的反向引物 cttgagtagcggccgcgctctctctggtgttgctgactc
用于扩增 PYL 片段的正向引物 gagcgcggccgctactcaagacgaattcacccaa
用于扩增 PYL 片段的反向引物 CGTATGGGTAGGTACCgttcatagcttcagtgatcga
dCas13b-PYL-HA 的测序引物 aagcagagctctctggctaac
dCas13b-PYL-HA 的测序引物 tgcgagttcctgaccagcaca
dCas13b-PYL-HA 的测序引物 gattacggcaagctgttcgac
dCas13b-PYL-HA 的测序引物 agcggcaatgcccacggcaag
dCas13b-PYL-HA 的测序引物 cccagacagatgttcgacaat
dCas13b-PYL-HA 的测序引物 atcaccagcgagggcatgaag

图 2。 dCas13b-PYL-HA 质粒的克隆方案。 dCas13b-ALKBH5-HA 质粒被线性化以提供目标质粒的骨架。将扩增的 dCas13b 和 PYL 片段以及线性骨架与 In -Fusion Snap Assembly bundle for seamless DNA 克隆试剂盒中的 In-fusion assembly master mix 混合在一起，生成 dCas13b-PYL-HA 质粒。

B. ABI（脱落酸不敏感 1）-M3nls 质粒的克隆

1. 使用设计的 ABI-P300 质粒引物和模板放大 ABI（脱落酸不敏感 1）片段（P300 是赖氨酸乙酰转移酶，ABI-P300 质粒由我们实验室的前成员构建）。
2. 使用表 2 中列出的用于融合克隆方法的设计引物，使用 dCas13b-M3nls 模板放大 SV40 NLS（核定位序列）片段。
3. 通过运行 0.8% DNA 琼脂糖凝胶纯化放大的 ABI 片段和 SV40 NLS 片段。 ABI 片段的大小为 1,013 bp，SV40 NLS 为 122 bp。
4. 通过在 37 °C下孵育2 小时，将 1 μg 骨干质粒 pCMV-dCas13-M3nls 与 EcoR I和 Not I限制酶线性化，以获得包含 M3nls 片段的线性化载体。
5. 用 0.8% DNA 琼脂糖凝胶电泳纯化线性化载体。线性化矢量大小为 4,365 bp。使用 1 kb 加 DNA 阶梯作为大小标记。
6. 使用In-Fusion Snap Assembly bundles for seamless DNA 克隆试剂盒中的 In-Fusion 主混合物，根据制造商的协议将 SV40 NLS 和 ABI 片段插入线性化载体中，以生成 ABI-M3nls 质粒结构。用于 PCR 和测序的引物列于表 2，克隆方案如图 3所示。
笔记：
a. PCR 设置条件与 A 部分中描述的相同。
b. 有许多含有 ABI 片段的质粒可以从 Addgene 获得用于扩增目的。例如：ABI-cTEVp（目录号：19214）。

表 2. 用于克隆和测序 ABI-M3nls 质粒的引物信息
用于克隆和测序的引物序列 (5 ′ -3 ′ )
用于放大 SV40 NLS 片段的正向引物 tagagatccgcggccgctaatacgactcactataggga
用于扩增 SV40 NLS 片段的反向引物 ctttgtagtcgcgcgcgactttccgcttcttctttgg
用于扩增 ABI 片段的正向引物 Agtcgcgcgcgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcg
attacaaggatgacgatgacaaggtccccctgtatgggttcacc
用于扩增 ABI 片段的正向引物 tcttgggctcgaattcgctgccgtcggcggttctttttggatcccttcaggtccacgacgacgac
ABI-M3nls 的测序引物 caactccgccccattgacgca
ABI-M3nls 的测序引物 ctcctgagaccgtgggctcta

图 3。 ABI-M3nls 质粒的克隆方案。 pCMV-dCas13b-M3nls 质粒被线性化以提供目标质粒的骨架。将扩增的 ABI 和 NLS 片段以及线性骨架与 In -Fusion Snap Assembly bundle 中的 In-fusion master mix 混合在一起，用于无缝 DNA 克隆试剂盒，以生成 ABI-M3nls 质粒。

C. sgRNA 的克隆

1. 对于 sgRNA 克隆，退火正向和反向间隔序列与悬垂以获得 18 μL 反应中的 sgRNA 间隔 DNA 片段。然后，根据制造商的协议，用 T4 多核苷酸激酶磷酸化退火插入物。
2. 将 1 µg pC0043-PspCas13b-crRNA骨架载体与Bbs I限制性内切酶在 55 °C下孵育2 小时线性化，然后使用 Monarch ® PCR & DNA Cleanup 试剂盒纯化线性化载体。
3. 根据制造商的协议，将 sgRNA 间隔插入与线性化 sgRNA 骨干与 T4 连接酶连接起来，以获得针对感兴趣的 RNA 的 sgRNA。 sgRNA 的间隔序列列于表 3，sgRNA 克隆方案如图 4所示。
注意：sgRNA spacer 与目标位点的距离会影响编辑效率；经过筛选，我们选择了'3'端两个核苷酸（nts）远离靶向位点的sgRNA。我们建议观众针对不同的目标筛选最佳的 sgRNA。

表 3. 靶向 sgRNA 的 spacer 信息
靶向目标 RNA 的 sgRNA 间隔子序列 (5 ′ -3 ′ )
Actb gRNA-2 TCCATCGTCCACCGCAAATGCTTCTAGGCG
Actb gRNA-8 GGCCCCTCCATCGTCCACCGCAAATGCTTC
Actb gRNA-22 AGTATGACGAGTCCGGCCCTCTCCATCGTCC
Gapdh gRNA-8 GGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCT
Foxm1 gRNA ATGTTTCTCTGATAATGTCCCCAATCATAC
Sox2 基因组 AACGGCACACTGCCCCTCTCACACATGTGA
马拉特 gRNA-1 AACGGAAGTAATTCAAGATCAAGATATT公司
马拉特 gRNA-50 GAAGGCCTTAAATATAGTAGCTTAGTTTGA
玛拉特 gRNA-100 ATTTAAAAAAAACTAAGGCAGAAGGCTTTT

图 4. sgRNA 克隆方案。 pC0043-PspCas13b-crRNA 质粒被线性化以提供目标质粒的骨架。将退火和磷酸化的间隔插入物和线性骨架与 In -Fusion Snap Assembly bundles的In-fusion master mix 混合在一起，用于无缝 DNA 克隆试剂盒，以生成 sgRNA 质粒。

D. 通过蛋白质印迹研究质粒的表达

1. 种子2 50,000 个 HEK293T 或 HeLa 细胞在 6 孔板的每个孔中孵育 16 小时，以达到 75%–80% 的汇合度。
2. 用 1.5 µg 转染细胞每个质粒（dCas13b-PYL-HA、Flag-ABI-METTL3 或 Flag-ABI-ALKBH5）与 3 μL 的lipofectamine 2000，孵育 24 小时。
3. 取出细胞培养基并用 DPBS 洗涤细胞。
4. 裂解细胞与 200 µL 冰冷 RIPA 缓冲液和 2 µL 蛋白酶抑制剂鸡尾酒在 4 °C 下旋转 30 分钟。
5. °C 下以 12,000 × g离心15 分钟，使细胞碎片旋转下来。
6. 根据制造商的协议，保存上清液并使用 Pierce TM 660 nm 蛋白质测定试剂测量蛋白质浓度。
7. ，通过在 95 °C下孵育5 分钟，并添加 4 × Laemmli 样品缓冲液，从步骤 D2 中描述的不同质粒转染的细胞中提取20 µg蛋白质变性，并补充2-巯基乙醇。
8. 准备凝胶电泳设置并将样品或EZ-Run 预染蛋白（标记）加载到4%–15% 预制聚丙烯酰胺凝胶的孔中。
9. 在 1 ×凝胶电泳缓冲液中以 60 V 运行凝胶电泳 5 分钟，然后将电压更改为 120 V 并再运行 60 分钟。
10. 准备 Immuno-Blot PVDF 膜转移设置，并使用 10 mA 电流运行转移过程 16 小时。
11. 在 TBST 缓冲液中用 5% 脱脂牛奶封闭膜 1 小时。
12. 在 1% TBST 缓冲液（1:1,000 稀释）中稀释一抗（抗 HA、抗 Flag、抗 GAPDH、抗 FOXM1、抗 SOX2 和抗纽蛋白），并在室温下与膜一起孵育2小时。
13. 用 TBST 缓冲液洗膜 3 次。
14. 在 1% TBST 缓冲液（抗兔、抗小鼠）（1:2,000 稀释）中稀释二抗，并在室温下与膜一起孵育 1 小时。
15. 用 TBST 缓冲液洗膜 3 次。
16. 通过将两个组件以 1:1 的比例组合来准备 ECL 基板。
17. 使用 Chemidoc TM触摸成像系统，用 200 µL 准备好的 ECL 底物对每个膜进行成像。

E. 通过免疫荧光成像研究细胞中诱导型 m 6 A 编辑器的定位

1. 在 6 孔板中接种 250,000 个 HEK293T 或 HeLa 细胞，孵育约 16 小时以达到 75%–80% 的汇合度。
2. 用 1.5 µg dCas13b-PYL 和 ABI-METTL3 或 1.5 µg dCas13b-PYL 和 ABI-ALKBH5 转染细胞，孵育 24 小时。质粒与 Lipofectamine 2000 的比例为 100 n g:0.2 µL 。
3. 用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
4. TM X-100处理上述固定细胞15 分钟以进行透化。
5. 在室温下用 1% 超纯牛血清白蛋白阻断细胞 1 小时。
6. °C 下用抗 HA 或抗 Flag 抗体（1：1,000 稀释）孵育细胞过夜。
7. 在室温下用 Alexa Fluor Plus 488 孵育细胞 1 小时。此外，将 DAPI 添加到固定细胞中并孵育 30 分钟。
8. 物镜 (10 × )的荧光显微镜获取荧光图像。

F. 6 A-免疫沉淀的RNA 提取

1. 2,0 00,000个细胞接种到 100 毫米培养皿中，孵育约 16 小时以达到 75 % –80% 的汇合度。
2. ipofectamine 2000，用 6 µg dCas13b-PYL 质粒和 6 µg ABI-X（X 指 M3、M3*、ALK 或 ALK*）质粒和 4 µg PspCas13b 指导 RNA 质粒转染细胞。（设定条件6 µg dCas13b-PYL、dCas13b-M3 或 dCas13b-ALK 质粒，4 µg sgRNA 作为阴性和阳性对照。）质粒与 lipofectamine 2000 的比例为100 ng :0.2 µL 。
3. 将 100 µM ABA 或 DMSO 添加到转染了 dCas13b-PYL+ABI-M3+gRNA 的细胞中，孵育 24 小时。
4. 去除每组不同转染和处理的细胞培养基，在100 mm培养皿中加入2 mL TRIzol试剂裂解细胞。
5. 上下吸取裂解物几次以均质化。
6. 在冰上孵育 5 分钟，使核蛋白复合物es完全解离。
7. 每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂加入 0.2 mL 氯仿：异戊醇 24:1，通过摇动彻底混合，孵育2-3分钟。
8. x g和 4 °C 下离心 15 分钟（混合物分离成下层红色酚氯仿、白色中间相和无色上层水相）
9. 轻轻地将上层溶液转移到新的离心管中，从而转移含有 RNA 的水相。
10. 每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂在水相中加入 0.5 mL 的 2-丙醇，并在冰上孵育 10 分钟。
11. × g和 4°C 下离心 10 分钟。（总 RNA 沉淀物在试管底部形成白色凝胶状沉淀。）
12. 用移液器丢弃上清液。
13. 每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂，将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 75% 乙醇中。
14. 4 °C 下以 10,000 × g离心 10 分钟。
15. 用移液器丢弃上清液。
16. 真空或风干 RNA 颗粒 5-10 分钟。
17. 通过上下吹打在 200 µL 无核酸酶的水中重悬颗粒，并在室温下孵育 5 – 10 分钟，使 RNA 溶解。

G. 6 A-免疫沉淀法研究m 6 A水平

1. 2,000,000个细胞接种到 100 毫米培养皿中，孵育约 16 小时以达到 75% – 80% 的汇合度。
2. 使用 lipofectamine 2000，用 6 µg dCas13b-PYL 质粒和 6 µg ABI-X（X 指 M3、M3*、ALK 或 ALK*）质粒和 4 µg PspCas13b 引导 RNA 质粒转染细胞。（设定条件为 6 µg dCas13b-PYL、dCas13b-M3 或 dCas13b-ALK 质粒，4 µg sgRNA 作为阴性和阳性对照。）质粒与 lipofectamine 2000 的比例为 100 ng:0.2 µL。
3. 孵育细胞 24 小时，并用不同浓度的 ABA 替换细胞培养基，再孵育 24 小时，然后用 TRIzol 试剂进行 RNA 提取。（为了研究可逆的 m 6 A 书写，这一步是在用 10 mL PBS 轻轻清洗细胞一次，用不含 ABA 的新鲜培养基替换含 ABA 的培养基，再孵育 24 小时后完成的。）
4. 按照上述步骤提取 RNA。
5. 将 RNA 分配到 1 µg/µL 浓度以进行碎片化。
6. 将 180 µg RNA 与 20 µL 碎片缓冲液（参见食谱）在 10 个 PCR 管中在 94 °C 下平均破碎1 分钟。（尽可能快地进行。）
7. 立即向每个反应 (18 µL) 添加 2 µL 0.5 M EDTA 以终止冰上的碎片化。（加入 EDTA 应迅速，避免过度碎片化，否则会产生大小不当的 RNA 片段。）
8. 将碎片化的 RNA 收集到新的 1.7 mL 管中。
9. 加入 22 μL 的醋酸钠（3 M，pH 5.5）和 550 μL 的 100% 乙醇，然后在 -80 °C下孵育过夜。
10. °C 下以 15,000 x g离心30 分钟沉淀 RNA，并弃去上清液。
11. 用 1 mL 的 75% 乙醇清洗 RNA 颗粒。
12. °C 下以 15,000 × g再次离心15 分钟。
13. 小心去除上清液，让 RNA 自然风干；使用 150 μL 的无核酸酶水溶解 RNA。
14. 如下准备 m 6 A-免疫沉淀 (m 6 A-IP) 反应。
成分体积 (µL)
片段化的RNA 120
RNasin Plus 核糖核酸酶抑制剂 (40 U/µL) 4个
IP 缓冲区，5 × 80
m 6 A 特异性抗体 (~0.5 mg/mL)
无核酸酶水 10
186
总体积 (µL) 400

15. °C的旋转器上孵育 m 6 A-IP 反应2 小时。
16. 当样品孵育时，每次 IP 反应用 1× IP 缓冲液（从 5× IP 缓冲液稀释五倍，参见食谱）洗涤 40 µL 重组蛋白 G 珠两次。
17. °C 下补充 BSA（0.5 mg/mL） 2 小时。
18. °C 下旋转时用珠子孵育 IP 反应过夜。
19. 用 1 mL 的 1× IP 缓冲液清洗珠子 3 次，然后去除缓冲液。
20. 将 100 µL 的 m 6 A 洗脱缓冲液（含 RNasin，参见食谱）添加到沉淀的珠子中，并在 4 °C 下连续振荡孵育混合物 1 小时。
21. 小心地旋转珠子并保存含有洗脱 RNA 片段的上清液。
22. 再次重复洗脱步骤并将 200 μL 洗脱的 RNA 结合在一起。
23. 根据制造商的协议，使用 RNA clean & concentrator-5 纯化 RNA，并将 RNA 溶解在 15 μL 的无核酸酶水中。
24. 根据制造商的协议，使用 iScript cDNA 合成套件在 IP 后使用 12 μL RNA 或 2 μL 输入 RNA（IP 前 RNA ）执行逆转录 PCR （RT-PCR）以合成 cDNA。根据制造商的协议，使用 PowerUp TM SYBR TM Green Master Mix分析 RNA 水平。用于 qPCR 的引物列于表 4，用于研究目标 RNA 上的 m 6 A 水平的方案如图 5 所示。

表 4. RT-qPCR 分析中用于研究 m 6 A 富集和酶募集的引物信息
本研究中用于 RT-qPCR 的引物序列(5 ′ -3 ′ )
Actb-m6A-转发 AGATGTGGATCAGCAAGC
Actb-m6A-反向 TCATCTTTTTTTCTGCGC
Gapdh-m6A-正向 CATCACTGCCCACCAGAAGA公司
Gapdh-m6A-反向 CAGTAGAGGCAGGGATGATGTT
Foxm1-m6A-转发 TGCCCAGATGTGCGCTATTA公司
Foxm1-m6A-反向 CTTTCCAAGCCTCCACCTGA公司
Sox2-m6A-正向 GGCCATTAACGGCACACTG公司
Sox2-m6A-反向 TCTTTTGCACCCCTCCCATT
MALAT1-m6A- 正向 CGTAACGGAAGTAATTCAAG公司
MALAT1-m6A-反向 GTCAATTAATGCTAGTCCTC
CYB5A-m6A-正向 GTTTTAAGGGAACAAGCTGGAG
CYB5A-m6A-反向 TCCACCAACTGGAACTAGAATC
CTNNB1-m6A- 前锋 TGGATTGATTCGAAACTTTGCC
CTNNB1-m6A-反向 GAACAAGCAACTGAACTAGTCG
MYC-m6A-前锋 CAGCTGCTTAGACGCTGGATT公司
MYC-m6A-反向 GTAGAAATACGGCTGCACCGA

图 5。 m 6 A 调查分析的研究方案。这部卡通片是用 B iorender.com 创作的。

H. mRNA稳定性测定

1. 将 50,000 个 HEK293T 或 HeLa 细胞播种到 24 孔板中，孵育约 16 小时以达到 80% 的汇合度。
2. 6 A 修饰系统的不同成分的 DNA 质粒转染细胞24 小时，脂质体 2000（0.9 μg dCas13b-PYL + 0.6 μg gRNA，0.9 μg dCas13b-M3 + 0.6 μg gRNA，0.9微克 dCas13b-PYL + 0.9 微克 ABI-M3 + 0.6 微克 gRNA）。质粒与 Lipofectamine 2000 的比例为 100 ng:0.2 µL。
3. 将 100 µM ABA 或 DMSO 添加到转染了 dCas13b-PYL+ABI-M3+gRNA 的细胞中，孵育 24 小时。
4. 用 5 µg/mL 放线菌素 D 处理细胞，并在特定时间点（例如，0、1、3 和 6 小时）收获细胞。（为了研究对 RNA 稳定性的可逆影响，这一步是在用 5 mL PBS 轻轻洗涤细胞一次，用不含 ABA 的新鲜培养基替换含 ABA 的培养基，再孵育 24 小时后完成的。）
5. 用 TRIzol 试剂提取总 RNA，并根据制造商的协议进行纯化。
6. 使用 iScript cDNA 合成试剂盒将 RNA 逆转录成 cDNA。
7. 根据制造商的方案，使用 PowerUp TM SYBR TM Green Master Mix执行 qPCR 分析以研究目标转录本（ACTB、GAPDH、SOX2 和 FOXM1）的 mRNA 水平。表 5 列出了用于 qPCR 的引物。

表 5. 用于 RT-qPCR 研究 mRNA 水平的引物信息
本研究中使用的引物序列(5 ′ -3 ′ )
动作前向 TCCCAAGTCCACAGG公司
Actb- 反转 CACGAAGGCTCATTCAAA公司
间隙前向 GGTGTGAACCATGAGAAGATGA
Gapdh-反向 GAGTCCTTCCACGATACCAAAG
Foxm1-转发 CAATGGCAAGGTCTCTCTCTCT
Foxm1-反向 GGTAGCAGTGGCTTCACTTT公司
Sox2-前锋 AGACGCTCATGAAGAAGGATAAG
Sox2- 反向 TCATGTGCGCGTAACTGT

注意：安装的 m 6 A 修改的影响是上下文相关的，这意味着可以根据目标 RNA 观察到稳定或不稳定的不同结果。在 Shi 研究的案例中，沉积的 m 6 A 使 ACTB mRNA、FOXM1 mRNA 和 SOX2 mRNA 不稳定，但未发现 GAPDH 不稳定。

I. METTL3 在 ACTB mRNA 靶向 A1216 上的富集

1. 250,000个细胞播种到 6 孔板中，孵育约 16 小时以达到 75% 的汇合度。
2. ，用 1.5 µg dCas13b-PYL 质粒和 1.5 µg ABI-M3 质粒和 1 µg PspCas13b 引导 RNA 质粒转染细胞。（设置条件为 1.5 µg dCas13b-PYL 和 1 µg sgRNA 作为阴性对照。）质粒与 Lipofectamine 2000 的比例为 100 ng:0.2 µL 。
3. 孵育细胞 24 小时，并用 100 μM 的 ABA 替换细胞培养基，再孵育 24 小时。
4. 每孔加入 35 µL 甲醛，孵育 10 分钟进行交联。
5. 在每口井中加入 167 µL 甘氨酸 (0.9 mg/mL)，孵育 5 分钟。
6. 取出每口井中的介质，用 1 mL 的冰冷 DPBS 清洗细胞两次。
7. 添加另外 167 μL 的 DPBS，辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并使用刮刀将所有细胞收集到新管中。
8. °C 下以 5,000 × g离心细胞5 分钟。
9. 丢弃上清液，用 220 μL 的 RIPA 缓冲液（含蛋白酶抑制剂鸡尾酒和 RNasin）重新悬浮细胞，并在冰上孵育 10 分钟。
10. 使用 Bioruptor Pico 超声设备在 RIPA 缓冲液中超声处理细胞 2 分钟（30 秒开启/30 秒关闭，重复一次）。
11. °C 下以 16, 000 × g离心20 分钟。
12. 保存上清液用于免疫沉淀或输入并储存在 -80 °C 。
13. 在 1.7 mL 离心管中，每次 IP 反应用 1 mL 洗涤缓冲液（参见食谱）洗涤 10 µL 蛋白 G 磁珠两次。
14. 用 1 µg 抗 METTL3 抗体和 3 µL RNasin 将珠子重新悬浮在 200 µL 洗涤缓冲液中加上核糖核酸酶抑制剂，在室温下旋转孵育 2 小时，进行 RNA 蛋白免疫沉淀。
15. 取出磁性架上的上清液，用 200 μL 的洗涤缓冲液清洗珠子三次。
16. 将步骤 I12 中保存的上清液的 200 μL 添加到珠子中，并在 4 °C下旋转孵育过夜。
17. 将剩余的裂解上清液添加到每个抗体珠反应中。
18. °C 下将旋转轮上的所有管子孵育过夜。
19. 去除磁性机架上的上清液，并用 200 μL 的洗涤缓冲液清洗珠子。
20. 在 IP 或 10 µL 输入后，将 100 µL 蛋白酶 K 消化缓冲液添加到珠子中。
21. 在 65 °C 下孵育管3 小时，并摇动以消化蛋白质。
22. 旋转所有管子并将上清液收集在磁力架上。
23. 根据制造商的协议，使用 RNA clean & concentrator-5 套件进行 RNA 纯化，并将 RNA 溶解在 15 μL 的无核酸酶水中。
24. IP 或输入 cDNA 后逆转录 12 μL RNA，并根据制造商的方案使用 PowerUp TM SYBR TM Green Master Mix 分析 RNA 水平。表 4 列出了 qPCR 测定中使用的引物，图 6 中列出了 METTL3 酶富集研究方案。

图 6。 METTL3 在感兴趣的目标 RNA 上富集的调查方案。该卡通片是使用 Biorender.com 创作的

J. 通过 SELECT进行靶向 m 6 A 编辑的特异性

1. 在 12 孔板中播种 100,000 个细胞，孵育约 16 小时以达到 80% 的汇合度。
2. 用不同成分的 ABA 诱导的 m 6 A 修饰系统转染细胞 24 小时（1.2 µg dCas13b-PYL + 0.8 µg gRNA，1.2 µg dCas13b-M3 + 0.8 µg gRNA，1.2 µg dCas13b-PYL + 1.2 µg ABI-M3 + 0.8 µg gRNA）。质粒与 Lipofectamine 2000 的比例为 100 ng:0.2 µL 。
3. 将 100 µM ABA 或 DMSO 添加到转染了 dCas13b-PYL+ABI-M3+gRNA 的细胞中，孵育 24 小时。
4. 如上所述收获用于 RNA 提取的细胞。
5. 将 1.5 µg 总 RNA 与 40 nM 上引物、40 nM 下引物和 5 µM dNTP 混合在 17 µL 的 1 × CutSmart 缓冲液中。
6. 运行以下 PCR 程序以退火 RNA 混合物：90 °C （1 分钟）、80 °C （1 分钟）、70 °C （1 分钟）、60 °C （1 分钟）、50 °C （1 分钟）和 40 °C （6 分钟）。
7. 用 3 μL 的酶混合物孵育 17 μL 的退火产品，其中含有 0.01 U Bst 2.0 DNA 聚合酶、0.5 U SplintR 连接酶和 10 nmol ATP。
8. °C 下孵育上述最终混合物（总计 20 μL） 20 分钟，在 80 °C下孵育20 分钟。
9. TM SYBR TM Green Master Mix通过 qPCR 分析 DNA 水平。简而言之，混合 2 μL 的步骤 J8 产品、5 μL 主混合物、1 μL 正向底漆和 1 μL 反向底漆，以及 1 μL 无核酸酶水，以准备 qPCR 反应。使用 95°C 2 分钟和 40 个 95°C 15 秒和 60°C 1 分钟循环的设置运行 qPCR，然后是 95°C 15 秒的解离步骤，然后 60°C 1 分钟和 95 °C 15 秒。

K. 光感 m 6 A 书写

1. 播种2,000,000个 HEK293T 细胞，孵育约 16 小时以达到 75% – 80% 的汇合度。
2. 用 ABA 诱导的 m 6 A修饰系统的不同成分转染细胞 24 小时（6 µg dCas13b-PYL + 4 µg gRNA，6 µg dCas13b-M3 + 4 µg gRNA，6 µg dCas13b-PYL + 6微克 ABI-M3 + 4 微克 gRNA）。质粒与 Lipofectamine 2000 的比例为 100 ng:0.2 µL 。
3. 用 100 µM ABA 或 ABA-DMNB（见下文注释）处理细胞，暴露和不暴露在 405 nm 光下 2 分钟。
4. 再孵育细胞 24 小时。
5. 收获细胞用于 RNA 提取、m 6 A-IP 和 RT-PCR，如上所述。
注意：光笼 ABA，ABA-DMNB，是由实验室成员通过用 4,5-二甲氧基-2-硝基苄基 (DMNB) 笼罩 ABA 合成的，可以通过 405 nm 光去除。光是从荧光显微镜发出的（型号信息在设备部分提供）。此外，引物信息可在 G 部分找到。通过 m 6 A 免疫沉淀法研究 m 6 A 水平。

示范性成果
以下是一些示例性结果（图 7），改编自原始文章“可诱导和可逆的 RNA N6-甲基腺苷编辑” （Shi 等。 , 2022) 。

图 7.主要检测的示例性结果。 A) 带有 HA 标签的 dCas13b-PYL 和带有 Flag 标签的 ABI-M3nls 构建体的蛋白质表达。 B) 表达的 dCas13b-PYL 和 ABI-M3nls 的定位。两种蛋白质都位于细胞核中。 C)通过可诱导的 m 6 A 书写系统在靶向 ACTB mRNA 上的靶向 m 6 A 沉积。 M3指的是m 6 A writer，METTL3，M3*指的是没有催化功能的METTL3突变体。 m 6 A 水平只能通过诱导型 m 6 A 书写平台 (dCas13b-PYL + ABI-M3 + gRNA) 在 ABA 存在下提高至与阳性对照 (dCas13b-M3 + gRNA) 相当的水平，但如果没有 ABA 或使用催化失活 M3*，则不会观察到增加。结果标准化为 dCas13b-PYL + sgRNA + ABA 组。 D) 安装的 m 6 A 对目标 ACTB mRNA 稳定性的影响。通过可诱导的 m 6 A 写入平台在 ACTB mRNA 上安装的 m 6 A 使 mRNA不稳定，就像报道的 dCas13b-M3 + sgRNA 一样。结果标准化为 dCas13b-PYL + ABI-M3 + NT-sgRNA + ABA 组。 E)通过 SELECT 测定在目标 Malat1 lncRNA 上通过诱导型 m 6 A 擦除系统靶向 m 6 A 水平去除。较小的 Ct 值反映了较高量的 SELECT-PCR 全长产物，表明目标上 m 6 A 的富集较低。 ALK 指的是 m 6 A 橡皮擦，ALKBH5，而 ALK* 指的是没有催化功能的 ALKBH5 的突变版本。 m 6 A 水平只能通过诱导型 m 6 A 擦除平台 (dCas13b-PYL + ABI-ALK + gRNA) 在 ABA 存在下降低至与阳性对照 (dCas13b-ALK + gRNA) 相当的水平，但没有 ABA 或使用无催化活性的 ALK* 时，观察不到增加。结果标准化为 dCas13b-PYL + sgRNA + ABA 组。 F) ABA 去除后 METTL3 在目标 ACTB mRNA 上的募集。诱导型m 6 A书写平台的METTL3酶可通过ABA处理募集至靶位点，洗涤去除ABA后释放。结果标准化为 dCas13b-PYL + sgRNA + ABA 组。

数据分析

对于每个测定，进行三个独立试验以获得数据并且不排除数据。使用 GraphPad Prism 8.0 通过单向方差分析对数据和统计数据进行分析。 p值小于0.05记为*，小于0.01记为**，小于0.001记为***，小于0.0001记为****。

笔记

1. RNA 提取和其他 RNA 相关实验应在冰上或 4 °C 下进行，以避免 RNA 降解，因为 RNA 完整性很重要。
2. 我们建议研究人员自行优化 m 6 A-IP 中片段化过程的时间，因为从热循环仪中取出 PCR 管的速度和添加 EDTA 会影响片段化 RNA 的大小。通常，100到300 nt 之间的大小是最佳的。
3. 对于本协议中提到的所有转染程序，在 OMEM 中分别混合质粒和Lipofectamine 2000 转染试剂，然后根据制造商的协议将它们组合并混合。
4. 为了扩增我们克隆的质粒，需要 LB 培养基和含有氨苄青霉素钠盐的 LB 平板，因为所有质粒都具有氨苄青霉素抗性。

食谱

1. 含氨苄青霉素的 LB 平板
试剂终浓度数量
LB肉汤 25克/升 25 克
琼脂 15克/升 15 克
100 mg/mL 氨苄西林钠盐 100微克/毫升 1毫升
DDH 2 O 不适用 980 毫升
总容积不适用 1,000 毫升

a. 将 25 克 LB 肉汤和 15 克琼脂溶解在 1 L 体积的玻璃瓶中的 980 mL ddH 2 O 中。
b. 将 LB 肉汤液体在 121°C 下高压灭菌 15 分钟。
c. 当高压灭菌的液体冷却至 30 – 40 °C 时，将 1 mL 的 100 mg/mL 氨苄青霉素溶液加入其中。
d. 使用血清移液器将 15 mL 的制备溶液转移到 10 厘米的培养皿中。
e. 让琼脂板在层流罩中冷却并干燥 20 分钟。
f. 将盘子存放在 4 °C 的塑料袋中。

2. LB媒体
试剂终浓度数量
LB肉汤 25克/升 25 克
DDH 2 O 不适用 985 毫升
总容积不适用 1,000 毫升

a. 将 25 克 LB 肉汤溶解在 1 L 体积的玻璃瓶中的 985 mL ddH 2 O 中。
b. 将 LB 肉汤液体在 121°C 下高压灭菌 15 分钟。
c. 当 LB 培养基冷却时，将其储存在 4°C。 LB 培养基在 4°C 下的保质期为三个月。

3. 1 × TBST 缓冲液
试剂终浓度数量
Tris碱基 2.42克/升 2.42 克
氯化钠 8克/升 8克
吐温20 0.1% 1毫升
DDH 2 O 不适用 995 毫升
总容积不适用 1,000 毫升

a. 将 2.42 克 Tris 碱和 8 克 NaCl 溶解在 1 L 体积的玻璃瓶中的 995 mL ddH 2 O 中。
b. 将 1 mL Tween-20 加入瓶中并充分混合。
c. 使用前将缓冲液存放在室温下。

4. 1 ×膜转移缓冲液
试剂终浓度数量
甘氨酸 1.44克/升 1.44 克
Tris碱基 3.03克/升 3.03 克
甲醇 20% 200 毫升
DDH 2 O 不适用 800 毫升
总容积不适用 1,000 毫升

a. 将 1.44 克甘氨酸和 3.03 克 Tris 碱溶解在 1 L 体积的玻璃瓶中的 800 mL ddH 2 O 中。
b. 向瓶中加入 200 mL 甲醇并充分混匀。使用前储存在 4°C。

5. 1 ×凝胶电泳缓冲液
试剂终浓度数量
Tris碱基 3.04克/升 3.04 克
甘氨酸 1.44克/升 1.44 克
安全数据表 1克/升 1克
DDH 2 O 不适用 995 毫升
总容积不适用 1,000 毫升

a. 将 1.44 克甘氨酸、3.04 克 Tris 碱和 1 克 SDS 溶解在 1 L 体积的玻璃瓶中的 995 mL ddH 2 O 中。
b. 使用前将缓冲液储存在室温下。

6. 碎片缓冲液，10 ×
试剂终浓度数量
Tris-HCl，pH 7.0 (1 M) 100毫米 100 µL
氯化锌2 (1 M) 100毫米 100 µL
DDH 2 O 不适用 800 微升
总容积不适用 1,000 微升

a. 将 800 μL 的无核酸酶水与 100 μL（1 M 库存）的 Tris-HCl（pH 7.0）和 100 μL 的 ZnCl 2 （1 M 库存）混合。
b. 新鲜准备缓冲区。

7. 6 A-IP 研究的5 × IP 缓冲区
试剂终浓度数量
Tric-HCl，pH 7.4 (1 M) 50毫米 0.5 毫升
氯化钠 (5 M) 750 毫米 1.5 毫升
IGEPAL-CA-630（10% 体积/体积） 0.5% 体积/体积 0.5 毫升
DDH 2 O 不适用 10毫升
总容积不适用 10毫升

a. 混合 0.5 mL Tris-HCl（1 M，pH 7.4）、1.5 mL NaCl（5 M）和 0.5 mL IGEPAL-CA-630（10% vol/vol），总体积为 10 mL 无核酸酶水。
b. 新鲜准备缓冲液以备使用。

8. m 6 A 洗脱缓冲液
试剂终浓度数量
5 × IP缓冲区 1 × 90 微升
20 mM m 6 A 盐 2.67毫米 60 微升
RNasin Plus 核糖核酸酶抑制剂不适用 7 微升
无核酸酶水不适用 293 微升
总容积不适用 450 微升

9. 用于 RNA 交联免疫沉淀的洗涤缓冲液
试剂终浓度数量
DPBS 不适用 50 毫升
吐温20 0.02% 10 微升

10. NT-2 缓冲液，5×
试剂终浓度数量
Tric-HCl，pH 7.4 (1 M) 250毫米 12.5 毫升
氯化镁2 , 1 M 5毫米 0.25 毫升
氯化钠 (5 M) 750 毫米 7.6 毫升
IGEPAL-CA-630（10% 体积/体积） 0.25% 体积/体积 1.25 毫升
DDH 2 O 不适用 50 毫升
总容积不适用 50 毫升

11. 蛋白酶 K 消化缓冲液
试剂终浓度数量
蛋白酶K 不适用 5 µL
安全数据表 (10%) 1% 15 µL
NT-2 缓冲液，5 × 不适用 30 µL
无核酸酶水不适用 100 µL
总容积不适用 150 µL

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 (R21CA247638) 的支持。
我们承认我们之前发表在《自然通讯》上的工作“可诱导和可逆的 RNA N6-甲基腺苷编辑” 。 DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29665-y。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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