材料与试剂
1. 50 mL 培养管（Corning/Falcon，目录号：352070）
2. 15 mL 培养管（Corning/Falcon，目录号：352196）
3. 1 mL PE/PP 注射器（avantor/VWR，目录号：613-2001）
4. 100 mL PE/PP 注射器（Th.Geyer/Becton Dickinson，目录号：6287774）
5. Oak Ridge 高速 PPCO 离心管（Thermo Fisher Scientific/Nalgene，目录号3139-0030）
6. 250 或 500 mL 离心瓶（Thermo Fisher Scientific/Nalgene，目录号：3141-0250 或 3141-0500）
7. 手术刀或剃须刀片
8. 17 或 18 号钝头注射器针头（例如， B. Braun Sterican® ，18G / 1.2 × 40 mm，目录号：4038088 ）
9. 300 或 500 mL Pyrex 烧杯
10. Vivaspin 20 离心浓缩器（30 k 截留分子量）（Sartorius Stedim，目录号：VS2021）
11. A. tumefaciens C58C1 (Rif R , Tet R )（社区资源；NCBI:txid176299）
12. 在用于植物转化的双元载体中，在 CaMV 35S 启动子的控制下，感兴趣的蛋白酶的表达构建体。在这里，我们在 pART27 (Spec R )中使用 His 标记的番茄植物蛋白酶的表达构建体转化为根癌农杆菌菌株 C58C1 ( Reichardt 等人， 2018 年）。用空表达载体（此处为 pART27）转化的农杆菌用作对照
13. A. tumefaciens C58C1 与 pBin61 中的 p19 沉默抑制器（Kan R ，Rif R ，Tet R ）（ Voinnet 等。 , 2003 年)
14. 本塞姆氏烟草种子（Agroscience GmbH，诺伊施塔特，德国）
15. N. benthamiana植物，在 25°C 和 16:8 小时昼夜循环条件下在播种基质上生长。三周以上的植物用 1.48 g/LN (20%)、P (20%) 和 K (20%) 包括微量营养素的通用肥料浇灌。
注意：表达水平在开花植物中大大降低。因此，在植物开始抽苔之前使用它们，通常是在它们长到四到五周大的时候
16. 大观霉素（Duchefa，目录号：S0188）； 100 mg/mL H 2 O 储备液，储存于 -20°C
17. 利福平（Duchefa，目录号：R0146）； DMSO 中的 100 mg/mL 储备溶液，储存在 -20°C
18. 四环素（Duchefa，目录号：T0150）； 70% (v/v) 乙醇中的 25 mg/mL 储备溶液，储存在 -20°C
19. 硫酸卡那霉素（Duchefa，目录号：K0126）； 50 mg/mL H 2 O 储备液，储存于 -20°C
20. 胰蛋白胨（Duchefa，目录号：T1332）
21. 镍 (Ni)-NTA 琼脂糖（Qiagen，目录号：30210），在 4°C 下储存
22. Bio-Rad Protein Assay kit II ，以牛血清白蛋白为标准蛋白（Bio-Rad，目录号：5000002）
23. 考马斯蛋白染色剂（例如 InstantBlue、abcam，目录号：ISB1L）
24. 定制合成的合成底物肽，纯度 >90%，EAHLD[sY]I[sY]TQM 和 EAHLA[sY]I[sY]TQM（sY = 磺基酪氨酸），（PepMic，中国苏州）。冻干肽储存在 -20°C。工作溶液可在 4°C 或 -20°C 下储存一个月。避免反复冷冻/解冻循环
25. MgCl 2 ·6H 2 O（Carl Roth，目录号：3532.1）
26. NaCl （Carl Roth，目录号：9265.2）
27. KCl （Carl Roth，目录号：6781.1）
28. NaH 2 PO 4 ·2H 2 O（Carl Roth，目录号：T879.2）
29. Na 2 HPO 4 ·2H 2 O（Carl Roth，目录号：T877.1）
30. NaOH（Carl Roth，目录号：P031.3）
31. 丁香酮（Carl Roth，目录号： 6003.2），储存于 -20°C
32. 咪唑（Carl Roth，目录号：3899.4 ）
33. 2-( N-吗啉代)-乙磺酸(MES ·H 2 O) (Carl Roth，目录号：6066.2 )
34. 酵母提取物（Carl Roth，目录号：2904.3 ）
35. 冰醋酸（Carl Roth，目录号：7332.1 ）
36. 甘油（Carl Roth，目录号：4043.1 ）
37. 乙腈（Carl Roth，目录号：7330.2 ）
38. 三氟乙酸（Carl Roth，目录号：P088.1 ）
39. H 2 O，HPLC 级（Carl Roth，目录号：A511.2 ）
40. LB 培养基（溶原肉汤）（参见食谱）
41. 渗透缓冲液（见配方）
42. 提取缓冲液、反应缓冲液（见配方）
43. 结合缓冲液（见配方）
44. 洗脱缓冲液（见配方）
45. 凝胶过滤缓冲液（见配方）
46. 溶剂 A （见配方）
47. 溶剂 B （见配方）
48. 溶剂 C （见配方）

设备

1. 微量离心机（Eppendorf ，型号：5418 R ）
2. 带用于 15/50 mL 管的摆动转子的台式离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
3. 用于 250/500 mL 瓶的 RC-3B 冷冻离心机（Sorvall Instruments）
4. 用于 30 mL 试管的 RC6+ 冷冻离心机（Sorvall Instruments）
5. UV/Vis 分光光度计（例如，Eppendorf Biophotometer，目录号：634-0839）
6. 带真空泵的干燥器 (5 L)
7. 旋转轮（例如， Steinberg Systems，型号：SBS-LBM-200）
8. 用于 28 和 37°C 平板培养的微生物培养箱
9. Enrich SEC 650 10 × 300 凝胶过滤柱（Bio-Rad，目录号：7801650）
10. 快速蛋白质液相色谱系统。我们使用了 NGC Quest 系统（Bio-Rad，目录号 788-0003）
注意：也可以使用其他色谱系统，例如ÄKTA Pure（Cytiva，目录号：29018226）。
11. 真空浓缩器，例如 Savant SpeedVac（Thermo Fisher Scientific，目录号：SPD1030A）
12. 标准 SDS-PAGE 设备（例如，来自 Bio-Rad 的 Mini-PROTEAN Tetra Cell 和铸造模块，目录号：1658000EDU 和 1658015EDU）
13. 电泳电源（例如，Bio-Rad 的 PowerPac Basic，目录号：1645050）
14. PTFE（聚四氟乙烯；Teflon TM ）膜，例如 Supelco Empore TM固相萃取盘（Millipore Sigma/Supelco，目录号：66887U）
程序

A. 本塞姆氏叶中植物蛋白酶的瞬时表达

1. 含有 phytaspase 表达载体或空载体控制的A. tumefaciens C58C1 的单个菌落，并将它们重新悬浮在 500 μL 的 LB 培养基中。
2. 用适当的抗生素（利福平，100 µg/mL；四环素，25 µg/mL；大观霉素，100 µg/mL）将重新悬浮的菌落均匀地涂抹在 LB 板上。
注意：目标是获得细菌草坪。
3. 同样，在含有卡那霉素（50 μg/mL）而不是大观霉素的 LB 板上，将携带 P19 表达结构的单个农杆菌菌落重新悬浮在 500 μL 的 LB 中。
4. 在 28°C 下孵育 48 小时。
5. 使用 6 mL渗透缓冲液（参见食谱）从各自的板中洗掉细菌，并将悬浮液转移到 15 mL 培养管中。
6. × g离心 10 分钟收集细胞；丢弃上清液。
7. 将细胞重新悬浮在 6 mL 的渗透缓冲液中。
8. 确定 600 nm 处的光密度 (OD)。
9. 将两种悬浮液混合在 50 mL 培养管中，并用渗透缓冲液稀释，以获得 50 mL 的渗透溶液，最终 OD 600为 0.7，用于 phytaspase 表达构造和 1：0 用于 P19 沉默抑制器。
10. 对空向量控件执行相同的操作。
11. 使用没有针头的 1 mL 塑料注射器将悬浮液注入本塞姆氏植物叶子的背面（图 1A，视频 1）。
注意：用食指支撑对面的叶子。使用温和的压力，小心不要伤害叶子。渗透区域被水浸透；它们变得比叶子的其余部分更暗。尝试使用尽可能少的渗透点渗透尽可能多的叶面积。

视频 1.本塞姆氏烟草植物的农杆菌渗入

12. 继续在 25°C 和 16:8 小时昼夜循环下种植植物。
13. 渗透后五天收获叶子。
塞姆氏烟草瞬时蛋白表达的最佳时间取决于感兴趣的蛋白质，需要通过实验确定。如果观察到由于蛋白酶过表达导致表达的蛋白酶降解或组织坏死，则可能必须选择较早的时间点以获得最大产量。
14. 使用刀片或手术刀去除中央静脉。
15. 将剩余的叶子材料从上面朝下放入一个烧杯（一个用于表达结构，一个用于空载体对照），其中含有大约 100 mL 的提取缓冲液（参见食谱），置于冰上（图 1B）。
16. 将烧杯放入干燥器中，在 75 mbar 下真空浸润提取缓冲液 2 分钟；然后，慢慢释放真空。
17. 将叶子吸干（图 1C）。将它们堆叠在一起，将它们卷起来（图 1D），然后将它们放入 100 mL 塑料注射器的桶中（图 1E）。

本塞姆氏叶中的瞬时蛋白表达。 A. 农杆菌悬浮液渗入N. benthamiana叶的背面。 B. 将叶子收获到提取缓冲液中。 C. 真空浸润后吸水纸上的叶子。 D、E. 叶子一层一层地堆起来并卷起来 (D)，以便将它们放入 100 mL 塑料注射器 (E) 的桶中。 (F) 放置在离心瓶中的注射器筒示意图。

18. 将注射器筒放入 250/500 mL 离心瓶中（图 1E、F），并在 4°C 下以 1,500 x g旋转 7 分钟，以收集细胞间液（质外体清洗）。
19. 将洗涤液转移到 Oak Ridge 离心管中，并在 4°C 下以 20,000 × g离心澄清。
20. 将上清液转移到新管中
21. 添加咪唑至终浓度为 4 mM。

B. 植物蛋白酶的纯化

His 标记的植物蛋白酶通过金属螯合亲和层析在 Ni-NTA 琼脂糖上分批从质外体洗涤液中纯化，然后（可选）在Enrich SEC 650 10 × 300凝胶过滤柱上进行尺寸排阻层析。作为对照，来自空载体渗入植物的质外体洗涤液经过相同的纯化程序。
1. 将 500 μL 的 Ni-NTA 琼脂糖（储存缓冲液中琼脂糖珠的 50% 浆液）移入 15 mL 培养管中，并在 500 x g下旋转 2 分钟以沉淀基质。准备两根管子，一根用于重组蛋白酶，一根用于从空载体渗透植物中进行模拟纯化。
2. 要清洗基质，请使用移液器去除缓冲液。注意：小心不要吸出沉淀的基质。加入 10 mL 结合缓冲液（参见食谱），轻轻混合并向下旋转，然后像以前一样取出缓冲液。重复两次。最后一次洗涤后，在 1 mL 的结合缓冲液中重新悬浮。
3. 将步骤 A19 中的质外体洗涤液添加到基质中，并在 4°C 下在旋转轮上孵育 1 小时。
4. 如上所述通过离心收集基质，并用 12 mL 结合缓冲液洗涤三次，如步骤 B2 中所述。
5. 最后一次洗涤步骤后小心取出缓冲液。
6. 加入 600 µL 洗脱缓冲液（见食谱），离心沉淀，回收上清液。重复两次。
7. 根据制造商的说明，使用 Vivaspin 离心浓缩器（30 k 分子量截止）通过超滤将三个 600 μL 洗脱物组合起来，并将体积减少到大约 100 μL。
8. 对于缓冲液交换，添加 500 μL 无咪唑的洗脱缓冲液。像以前一样将体积减少到 100 μL（步骤 B7）。重复三遍。
9. （Stintzi等人， 2022 年）通过 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色评估纯度 ADDIN EN.CITE Laemmli1970277(Laemmli, 1970)

277

277

17

Laemmli, U. K.Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4.

Nature

Nature

680-68522752591970

10.1038/227680a0

（图 2A）。
注意：许多以高水平表达的蛋白酶足够纯，可以在此阶段进一步表征（例如参见图 2A 中的 P69A）。然而，对于需要最高纯度的应用（例如，用于分析底物特异性的 PICS 分析，如Reichardt 等人，2018 年所报道），我们建议通过凝胶过滤进一步纯化，详见以下步骤 B10–B14。
10. 将样品应用于Enrich SEC 650 10 × 300凝胶过滤柱（或类似物），在 50 mM磷酸钠缓冲液 pH 7.0、300 mM NaCl 中以 0.5 mL/min 在NGC Quest（Bio-Rad）色谱系统上进行平衡。
11. 监测 280 nm 的紫外吸光度；以 200 µL 的分数收集柱洗脱液。图 2B 显示了番茄植物蛋白酶 2 (Phyt2) 的结果。
12. 对于最高纯度，在进一步的实验中仅使用峰值最大值处的分数。或者，汇集所有峰级分，如上所述通过超滤浓缩（步骤B 7），添加甘油至 50% 最终浓度，并储存在 -20°C。
13. 使用商业 Bradford 测定系统确定蛋白质浓度（例如， Bio-Rad 蛋白质检测试剂盒 II) 按照制造商的说明进行操作。

N. benthamiana植物的质外体提取物中纯化番茄植物蛋白酶。 A. 通过金属螯合亲和层析在 Ni-NTA 琼脂糖上对从质外体提取物中纯化的植物蛋白酶进行 SDS-PAGE 分析。将大约 2 (Phyt4)、5 (Phyt5) 或 6 µg（Phyt1、Phyt2、P69A）蛋白质上样到凝胶上。显示考马斯染色的 10% 凝胶；标记蛋白的分子量以 kDa 表示。 B. 通过凝胶渗透色谱法进一步纯化 Phyt2。洗脱体积以毫升显示。在 280 nm 处监测蛋白质洗脱，并显示为蓝色的 m(illi) A(吸光度) U(nits)；收集 200 µL 级分并使用荧光肽底物测定 Phyt2 活性。随着相对荧光每分钟增加，活动以红色任意单位显示。从 Reichardt 等人修改。 (2018)，图 3a 和 4a ( Reichardt 等。 , 2018 年）。

C. 体外裂解试验

用合成寡肽作为底物测试纯化的目标蛋白酶的活性和切割特异性。可以从商业供应商处获得纯度 >90% 的冻干定制合成肽。必须选择氨基酸序列以匹配感兴趣的蛋白酶的底物要求。为了分析番茄植物蛋白酶的切割特异性，我们使用了包含 PSK 的五个残基（[sY]I[sY]TQM；sY = 磺基酪氨酸）的十聚体肽，在 N 末端具有五个额外的前体衍生氨基酸（EAHLD[ sY]I[sY]TQM) 和第二个肽，其中切割位点的关键 Asp 残基被 Ala (EAHLA[sY]I[sY]TQM) 取代。
1. 将冻干肽重悬于 ddH 2 O 中；根据两个磺基酪氨酸残基 ( ε 260 = 566 M -1 cm -1 )的摩尔消光系数，在 260 nm 处通过分光光度法确定浓度。
2. 设置体外消化（参见食谱）。准备两个管子，一个含有 140 nM 的纯化植物酶，第二个含有等量的模拟纯化部分。
注意：使用高质量的微量离心管（例如，原装 Eppendorf 管），并在此步骤和方案 C 的后续步骤中提示。低质量的离心管可能会将增塑剂泄漏到样品中，这不利于 MS/MS 分析。
3. 通过添加 5 µM 底物肽开始反应并在 30°C 下孵育。
注意：肽底物的摩尔浓度是蛋白酶的 3,000 倍。但是，这不能一概而论。测定中蛋白酶的数量和所需的底物浓度取决于正在研究的蛋白酶的特性，并且必须相应地进行调整。
4. 准备六个微量离心管，每个离心管含有 90 μL 的 0.1% 三氟乙酸 (TFA)。
5. 在 0 分钟、10 分钟、30 分钟、1 小时、5 小时、24 小时时取 10 μL 等分试样来停止反应。将等分试样添加到含有 90 μL 0.1% TFA 的管中。

D. 质谱样品制备

在质谱 (nanoLC-ESI-MS/MS) 分析之前，样品需要脱盐并浓缩在 C18 ZIP 吸头或 StageTips ( Rappsilber 等。 , 2003 ) 。
1. 为了准备 StageTips，使用皮下注射针从嵌入 C18 珠子的 PTFE 膜中冲出小圆盘，并将它们放入 200 µL（黄色）移液器吸头中。每个尖端使用两个圆盘。 StageTip 准备的完整详细信息在Rappsilber中给出等。 ( 2003 ) 。
2. 要调节 StageTips，添加 50 µL 溶剂 A （参见食谱）并在微量离心管中以 2,300 × g在 4°C 下旋转 1 分钟。
3. 加入 100 µL 溶剂 B （参见食谱）洗涤两次，然后如上旋转。
4. 应用步骤 C5 中的样品并以 800 × g旋转在 4°C 下保持 1 分钟。
5. 加入 150 µL 溶剂 B 并以 2,300 × g旋转洗涤两次在 4°C 下保持 1 分钟。
6. 将 StageTips 转移到新的微量离心管中，加入 20 µL 溶剂 C 洗脱两次（参见食谱）；以 800 × g离心在 4°C 下保持 1 分钟。
7. 在真空浓缩器中干燥样品并继续进行 nanoLC-ESI-MS/MS 分析或储存在 -20°C 直至进一步分析。

数据分析

Phytaspases 是 Asp 特异性蛋白酶。它们在天冬氨酸残基的羧基侧切割底物蛋白。源自 PSK 前体 EAHLD[sY]I[sY]TQM 的肽在此作为植物蛋白酶底物进行了测试，因此预计会在天冬氨酸 (D) 和磺基酪氨酸 (sY) 之间被切割。为了确认切割的 Asp 特异性，我们使用了第二个肽，其中关键的 Asp 残基被 Ala 取代。Ala 取代的肽 EAHLA[sY]I[sY]TQM 预计不会被植物蛋白酶或与原始肽相比，裂解效率要低得多。在 MS/MS 数据中搜索从两种底物肽生成的任何裂解产物。作为搜索参数，不要指定特定的酶，并将肽前体的质量公差设置为 5 ppm，碎片离子的质量公差设置为 0.02 Da（注意：质量公差设置可能因所用质谱仪的分辨率和质量精度而异）。磺基酪氨酸侧链不是很稳定，导致硫酸盐丢失，蛋氨酸在质谱分析中经常被氧化。因此，允许甲硫氨酸氧化和酪氨酸硫酸化作为 MS 搜索过程中的可变修饰。仔细检查用于诊断 D-sY 键裂解的肽的搜索结果。这些分别是 Ala 取代肽和原始肽的 N 末端切割产物 EAHLA 和 EAHLD，以及两种底物肽相同的 C 末端切割产物 [sY]I[sY]TQM。请注意，C 端切割产物包含两个磺基酪氨酸和一个甲硫氨酸残基，导致许多可能的变体。因此，在我们对 Phyt2 切割特异性的分析中，我们使用 N 末端肽进行定量。我们将 EAHLD 和 EAHLA 裂解产物量化为 b 系列和 y 系列的 MS/MS 碎片离子的离子强度总和。 Reichardt 等人显示的结果。 ( 2020 )在图 4 和补充图 S11 中表明，与其 Ala 取代的变体相比，PSK 衍生肽的切割效率更高。 EAHLA 衍生的碎片离子占相应 EAHLD 衍生离子的 20% ± 8%，这与两个前体离子以相同效率裂解时预期的 1 比 1 比率有显着差异。

食谱

1. LB 培养基（溶原肉汤）
试剂终浓度数量
胰蛋白胨 10克/升 10克
酵母抽提物 5克/升 5克
氯化钠
琼脂（仅适用于固体培养基）
氢气_ _ 5克/升
15克/升
不适用 5克
15 克
高达 1 升
高压灭菌 20 分钟。冷却至 60°C，然后从 1,000 ×储备液中加入抗生素。如果需要固体培养基，可用于液体培养或倒板。

2. 浸润缓冲液
试剂终浓度数量
氯化镁2 (1 M) 10毫米 1毫升
MES-NaOH（0.5 M，pH 5.6） 10毫米 2毫升
乙酰丁香酮 (100 mM)
氢气_ _ 0.15毫米
不适用 1.5 毫升
95.5 毫升
全部的不适用 100 毫升

3. 提取缓冲液、反应缓冲液
试剂终浓度数量
NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 (1 M, pH 6.5 ) 50毫米 10毫升
氯化钾 (1M)
氢气_ _ 200毫米
不适用 40 毫升
150 毫升
全部的不适用 200 毫升

4. 结合缓冲液
试剂终浓度数量
NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 (1 M, pH 7.0 ) 50毫米 10毫升
氯化钾 (1M)
咪唑 (1 M)
氢气_ _ 200毫米
4毫米
不适用 40 毫升
0.8 毫升
149.2 毫升
全部的不适用 200 毫升

5. 洗脱缓冲液
试剂终浓度数量
NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 (1 M, pH 7.0 ) 50毫米 5毫升
氯化钾 (1M)
咪唑 (1 M)
氢气_ _ 200毫米
200毫米
不适用 20毫升
20毫升
55 毫升
全部的不适用 100 毫升

6. 凝胶过滤缓冲液
试剂终浓度数量
NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 (1 M, pH 7.0 ) 50毫米 50 毫升
氯化钠 (1 M) 300毫米 300 毫升
氢气_ _
全部的不适用
不适用 650 毫升
1,000 毫升

7. 溶剂A
试剂终浓度数量
冰醋酸 0.5%（体积比） 0.5 毫升
乙腈 80%（体积比） 80 毫升
H 2 O，HPLC 级
全部的不适用
不适用 19.5 毫升
100 毫升

8. 溶剂B
试剂终浓度数量
冰醋酸 0.5%（体积比） 0.5 毫升
H 2 O，HPLC 级
全部的不适用
不适用 99.5 毫升
100 毫升

9. 溶剂C
试剂终浓度数量
冰醋酸 0.5%（体积比） 0.5 毫升
乙腈 50%（体积比） 50 毫升
H 2 O，HPLC 级
全部的不适用
不适用 49.5 毫升
100 毫升

致谢

描述这些程序的原始研究论文（ Reichardt 等。 , 2018 年和 2020 年）；我们实验室的研究得到德国研究基金会 (DFG) 的支持。

利益争夺

没有宣布财务或非财务竞争利益。

参考

Beloshistov, RE, Dreizler, K., Galiullina, RA, Tuzhikov, AI, Serebryakova, MV, Reichardt, S., Shaw, J., Taliansky, ME, Pfannstiel, J., Chichkova, NV,等人。 (2018)。 Phytaspase 介导的前体加工和伤口激素系统素的成熟。新植醇218(3)：1167-1178。
Cedzich, A.、Huttenlocher, F.、Kuhn, BM、Pfannstiel, J.、Gabler, L.、Stintzi, A. 和 Schaller, A.（2009 年）。蛋白酶相关 (PA) 结构域和 C 端延伸是酶原加工、分泌途径内的分类和番茄枯草杆菌酶 3 (SlSBT3) 活性所必需的。生物化学杂志 284(21)：14068-14078 。
Chichkova, NV、Galiullina, RA、Beloshistov, RE、Balakireva, AV 和 Vartapetian, AB (2014)。 Phytaspases：参与植物细胞死亡的天冬氨酸特异性蛋白酶。 Russ J Bioorg Chem 40(6)：606-611。
Chichkova, NV, Galiullina, RA, Mochalova, LV, Trusova, SV, Sobri, ZM, Gallois, P. 和 Vartapetian, AB (2018)。拟南芥植物蛋白酶：鉴定和特性。功能植物生物学45(2)：171-179。
Chichkova, NV, Shaw, J., Galiullina, RA, Drury, GE, Tuzhikov, AI, Kim, SH, Kalkum, M., Hong, TB, Gorshkova, EN, Torrance, L., 等。（2010）。 Phytaspase，一种可重定位的细胞死亡促进植物蛋白酶，具有 caspase 特异性。 EMBO J 29(6)：1149-1161。
Janzik, I.、Machereux, P.、Amrhein, N. 和 Schaller, A. (2000)。 Le SBT1，一种来自番茄植物的枯草杆菌酶。昆虫细胞中的过度表达、纯化和表征。生物化学杂志 275(7)：5193-5199 。
Meyer, M.、Leptihn, S.、Welz, M. 和 Schaller, A.（2016 年）。植物枯草杆菌酶前肽作为分子内伴侣和成熟蛋白酶抑制剂的功能表征。生物化学杂志 291(37)：19449-19461 。
Narayanan, S.、Sanpui, P.、Sahoo, L. 和 Ghosh, SS (2017)。 phytaspase 的异源表达和功能表征，一种半胱天冬酶样植物蛋白酶。 Int J Biol Macromol 95：288-293。
Ottmann, C.、Rose, R.、Huttenlocher, F.、Cedzich, A.、Hauske, P.、Kaiser, M.、Huber, R. 和 Schaller, A.（2009 年）。 Ca 2+独立性和番茄枯草杆菌酶 3 同二聚化激活的结构基础。 Proc Natl Acad Sci USA 106(40)：17223-17228。
Rappsilber, J.、Ishihama, Y. 和 Mann, M. (2003)。在蛋白质组学中用于基质辅助激光解吸/电离、纳米电喷雾和 LC/MS 样品预处理的停走式提取技巧。肛门化学75(3)：663-670。
Reichardt, S.、Piepho, H.-P.、Stintzi, A. 和 Schaller, A.（2020 年）。干旱诱导番茄落花的肽信号。科学367(6485)：1482-1485。
Reichardt, S.、Repper, D.、Tuzhikov, AI、Galiullina, RA、Planas-Marques, M.、Chichkova, NV、Vartapetian, AB、Stintzi, A. 和 Schaller, A.（2018 年）。番茄枯草杆菌酶家族包括几种具有 caspase 特异性的细胞死亡相关蛋白酶。科学报告8(1)：10531。
Schaller, A., Stintzi, A., Rivas, S., Serrano, I., Chichkova, NV, Vartapetian, AB, Martínez, D., Guiamét, JJ, Sueldo, DJ, van der Hoorn, RAL, 等。 (2018)。从结构到功能——植物枯草杆菌酶的全家福。新植醇218(3)：901-915。
Stintzi, A.、Stührwohldt, N.、Royek, S.、Schaller, A. (2022)。使用类别特异性抑制剂鉴定同源蛋白酶/底物对。载于：Klemenčič, M.、Stael, S.、Huesgen, PF（编辑）。植物蛋白酶和植物细胞死亡。分子生物学方法，第 2447 卷。Humana，纽约，纽约州。 https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2079-3_6。
Voinnet, O.、Rivas, S.、Mestre, P. 和 Baulcombe, D. (2003)。基于番茄浓密矮化病毒 p19 蛋白抑制基因沉默的增强型植物瞬时表达系统。植物杂志 33(5)：949-956。