材料和试剂
纸巾（Garden® ，目录号：6610）
50 × 50 cm 滤纸（ Qualy® ，目录号：1282）
实验室胶片（Parafilm® ，目录号： PM-996 ）
1.5 mL 微管（Eppendorf® ，目录号：0030120086）
2.0 mL 微管（Eppendorf® ，目录号：0030120094）
0.1–10 μL吸头（Eppendorf® ，目录号：0030000838）
2–200 μL吸头（Eppendorf® ，目录号：0030000889）
50–1,000 μL吸头（Eppendorf® ，目录号：0030000927）
96 孔微孔板（Corning® ，目录号：3595 ）
石英比色皿（ Daigger Scientific® ，目录号：EF22153L/ FX22153L ）
10 mL容量瓶（ISO：3819， Laborglas® ，目录号：9110608）
50 mL容量瓶（ISO：3819， Laborglas® ，目录号：9110617）
100 mL 容量瓶（ISO：3819， Laborglas® ，目录号：9110624）
250 mL 容量瓶（ISO：3819， Laborglas® ，目录号：9110636）
600 mL 容量瓶（ISO：3819， Laborglas® ，目录号：9110648）
1,000 mL 容量瓶（ISO：3819， Laborglas® ，目录号：910654）
10 mL 烧杯（ISO：4788， Laborglas® ，目录号：9139608）
100 mL 烧杯（ISO：4788， Laborglas® ，目录号：9139624）
250 mL 烧杯（ISO：4788， Laborglas® ，目录号：9139636）
500 mL 烧杯（ISO：4788， Laborglas® ，目录号：9139744）
1,000 mL 烧杯（ISO：4788， Laborglas® ，目录号：9139754）
玻璃贴纸（ Laborglas® ，目录号：9108805）
1,000 mL 琥珀色瓶（ Laborglas® ，目录号：91806545 ）
净化水
2-巯基乙醇（纯度≥99%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：8057400250）
2-硫代巴比妥酸（TBA，纯度≥98%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：T5500）
5,5-二硫双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，纯度≥ 98%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：D8130）
5-磺基水杨酸水合物（纯度≥95%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：390275）
牛血清白蛋白（BSA）（ Sigma-Aldrich® ，目录号：A-4503）
氯化钙（CaCl 2 ，ACS）（Sigma-Aldrich® ，目录号：C1016）
乙二胺四乙酸（EDTA，纯度≥99%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：S26-36）
谷胱甘肽还原酶（GSH-Rd，100-300 单位/mg 蛋白质）（Sigma-Aldrich® ，目录号：G3664）
辣根过氧化物酶 (HRP)（25,000 单位）（Sigma-Aldrich® ，目录号：P8250）
L-谷胱甘肽还原型（GSH，纯度 98%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：G4251）
氯化镁（MgCl 2 ，ACS）（Sigma-Aldrich® ，目录号：208337）
酚红（Sigma-Aldrich® ，目录号：114529）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.138 M NaCl，0.0027 M KCl ，pH 7.4）（Sigma-Aldrich® ，目录号：P3813）
氰化钾（纯度≥97%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：31252）
铁氰化钾（纯度≥99%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：702587）
氢氧化钠（NaOH，纯度≥97%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：221465）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 · H 2 O，ACS）（Sigma-Aldrich® ，目录号：S9638）
叔丁基氢过氧化物 70% 水溶液（Sigma-Aldrich® ，目录号：B2633）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2'-磷酸还原四钠盐水合物（NADPH，纯度≥93%）（Sigma-Aldrich® ，目录号：N1630）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad® ，目录号：500-0006）
TRIS- Ultrapure TM （纯度≥99.9%）（Invitrogen® ，目录号：15504-020）
盐酸（HCl，ACS，纯度 36.5%–38%）（Synth® ，目录号：A1028.01.BJ）
焦没食子酸（纯度≥99.9%）（Synth® ，目录号：A1052.01.AE）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 HPO 4 ，纯度≥99%）（默克® ，目录号：AO150099.010）
乙醇（ACS，纯度 99.5%）（默克® ，目录号：108543）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ，纯度≥99.5%）（默克® ，目录号：6329）
氯化钾（KCl，ACS）（Vetec®，目录号： 104）
氯化钠（NaCl，ACS）（ Vetec® ，目录号：V003132 ）
过氧化氢（H 2 O 2 ，ACS，纯度 35%）（ Dinâmica® ，目录号：1857）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ，ACS）（ Dinâmica® ，目录号：P.10.0513.009.00）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ，ACS）（Dinâmica® ，目录号：P.10.0513.012.00）
稳定溶液（2.7 mM EDTA 和0.7 mM 2-巯基乙醇）（参见配方）
Drabkin 的解决方案（参见食谱）
1 μg / μL原液（见配方）
3% (w/v) 5-磺基水杨酸水合物（100 个样品）（参见配方）
硫代巴比妥酸溶液 (TBA) 0.67%（200 个样品）（参见配方）
1 M HCl （见食谱）
0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0（用于 250 个重复样品分析）（参见配方）
10 mM DTNB（用于 250 个重复的洗涤红细胞样本和 100 个重复的血清样本）（参见食谱）
溶液 1：1.71 M NaCl、34 mM KCl 、14 mM K 2 HPO 4 、0.1 M Na 2 HPO 4 （参见配方）
解决方案 2：90 mM CaCl 2 （参见配方）
解决方案 3：0.11 M MgCl 2 （参见配方）
溶液 4：0.1% 酚红（见配方）
磷酸盐缓冲溶液 A （见配方）
过氧化物酶溶液 (HRP) （参见食谱）
缓冲液 b （见食谱）
1 M NaOH （见食谱）
1 M TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 8.0（用于 150 个重复样品分析）（参见配方）
10 mM 邻苯三酚溶液（用于 250 个重复样品分析）（参见配方）
50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA（用于 500 个重复样品分析）（参见配方）
1% NaHCO 3和 1 mM EDTA （参见配方）
10 mM HCl 溶液（参见配方）
0.1 M 还原型谷胱甘肽 (GSH)（用于 60 个重复样品分析）（参见食谱）
10 U/mL 谷胱甘肽还原酶 (GSH-Rd)（用于 60 个重复样品分析）（参见食谱）
7 mM叔丁基过氧化氢（用于 125 个重复样品分析）（参见配方）
4 mM NADPH（用于 60 个重复样品分析）（参见配方）
0.1 M NaH 2 PO 4 ·H 2 O（用于 200 个样品分析）（参见配方）
1 M 过氧化氢 (H 2 O 2 ) （参见食谱）

设备
0.1–2.5 μL微量移液器（Eppendorf® ，目录号：4924000010）
0.5–10 μL微量移液器（Eppendorf® ，目录号：4924000029）
2–20 μL微量移液器（Eppendorf® ，目录号：4924000045）
10–100 μL微量移液器（Eppendorf® ，目录号：4924000053）
20–200 μL微量移液器（Eppendorf® ，目录号：4924000061）
100–1,000 μL微量移液器（Eppendorf® ，目录号：4924000088）
离心机（Eppendorf® ，型号：5804R）
净水器 (GEHAKA ® , Master System)
酶标仪（ Biotek® 、 Power Wave XS）
分光光度计（Shimadzu® ，型号：UV1800）
数字微孔板混合器（IKA® ，型号： MS3）
水浴锅（ Quimis® ，型号：Q334M-24 ）
分析天平（Denver Instrument® ，型号：APX200）
-80°C超低温冰箱（ColdLab® ，型号： CL200-86V）
冰箱（Electrolux® ，型号：RDE 32）
涡旋搅拌混合器（Quimis® ，型号： G220）
磁力搅拌器（ Quimis® ，型号： Q2461-22 ）
pH计（ Tecnal® ，型号： Tec05 ）
高压灭菌器（ Ecel® ，型号： EC 21D）
通风柜（ Permution® ，型号： NBR 7094）

软件
Gen5（ BioTek® ）
UVProbe ( Shimadzu ® )
Statistica （ StatSoft® ） _
微软 Office 365（微软® ）

程序
样品采集

在干燥/不含抗凝血剂（约 5.0–9.0 mL 血液）和肝素化（0.2 mL 肝素中约 1.5 mL 血液）管中通过尾部切口收集妊娠大鼠的全血样本。这些血液量足以处理用于氧化剂和抗氧化生物标志物测量的样品。
收集后在 4–8 °C 下冷藏 30 分钟。
注意：样品不能储存在湿冰上。使用肝素管获取洗涤过的红细胞样本（图 1）：

图 1. 获得洗涤过的红细胞的程序。使用 BioRender.com 创建。
x g离心肝素管中的血液样本10 分钟。
丢弃血浆（浅黄色上清液）和血沉棕黄层（白细胞和血小板，半透明上清液）。
笔记： 1 )如果各相分离不当，重复离心。如果相不再分离，则丢弃样品。 2) 如果样品中脂质浓度高，血浆颜色会变白。将 2 mL 的 PBS 1 × (pH 7.4) 添加到红细胞样品中进行洗涤。
以 1,575 × g离心1 分钟。
丢弃上清液（半透明上清液）。
重复程序 A3c–e 三次。
识别用于Hb、TBARS 和 SH 水平测量的三个微管（图 2）：
i )直接在每个微管（总共三个）中吸取 50 μL洗涤过的红细胞样品（从前面的步骤中获得的颗粒），用于以后测量 Hb、TBARS 和 SH 水平。 50 μL洗涤过的红细胞的微量管中加入 950 μL纯净水。 iii) 通过倒置轻轻地使样品均匀化。 iv) 将等分试样储存在 -80 °C直至检测（最多可稳定六个月）。

图 2. 使用纯净水在清洗后的红细胞中测量 Hb、TBARS 和 SH 水平的等分试样。使用 BioRender.com 创建。
确定用于 Hb、SOD、H 2 O 2 、GSH- Px和 CAT 水平测量的五个微管（图 3）：
i ) 将 50 μL洗涤过的红细胞样品（从前面步骤中获得的沉淀）直接移入每个微管（总共五个）中，用于 Hb、SOD、H 2 O 2 GSH- Px和 CAT 的活性测量。 ii) 在每个微管中加入 950 μL稳定溶液（参见配方 1）。 iii)通过倒置轻轻地使样品均匀化。 iv) 将等分试样储存在 -80 °C直至检测（最多可稳定六个月）。

使用稳定溶液对清洗过的红细胞进行 Hb、SOD、H 2 O 2 、GSH- Px和 CAT 水平测量的等分试样。使用 BioRender.com 创建。
干/游离抗凝管中的血清样本采集（在步骤 1 中提到，图 4）：
x g离心干管中的血液样本10 分钟。
使用微量移液器收集血清并将其放入另一管中。接下来，丢弃颗粒。
将血清等分试样直接移入六个微管中进行蛋白质定量 (20 μL ) 、TBARS (550 μL ) 、SH (10 μL ) 、H 2 O 2 (20 μL ) 、SOD (5 μL )和 GSH- Px (5 μL )在每个微管中使用特定标识。
储存在 -80 °C直至分析（稳定长达六个月）。

图 4. 获得血清的程序。使用 BioRender.com 创建。
洗涤过的红细胞中的血红蛋白 (Hb) 定量

用 Hb [用纯净水（步骤 A3g）和稳定溶液（步骤 A3h）稀释]取经鉴定的微管。
注意：血红蛋白浓度测量在纯净水和/或稳定溶液中是相似的，因为它们对于确定氧化剂和抗氧化剂浓度的正常化是必要的。因此，两个微孔板将用于 Hb 测定（一个用于纯化水，另一个用于稳定溶液）。将涡旋搅拌器中的样品均质化。
移液器 200 在微孔板的两个孔中加入μL Drabkin溶液（见配方 2）作为空白。
移液器197.5 μL Drabkin溶液和 2.5 μL样品（洗涤过的红细胞）在微孔板的每个孔中（一式两份）。
覆盖微孔板并使用微孔板混合器在 750 rpm 下混合 1 分钟以进行均质化。
将微孔板在 25°C 下静置 10 分钟。
轻轻拍打微孔板的两侧数次以轻轻混匀。
使用 Gen5 软件测量 546 nm 波长的吸光度。
计算 Hb 浓度（参见数据分析）。

通过 Bradford 方法定量血清样品中的蛋白质浓度（Bradford，1976）

在微量管中用 100 份纯净水稀释一份血清样品。
注：其他稀释度可根据实验进行测试。确定 BSA 解决方案的六个微管：0、0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 μg / μL 。
μg / μL储备溶液（参见配方 3）中为标准曲线设置准备 BSA 溶液，移取以下体积的 BSA 和纯净水：

以一份试剂与四份纯净水的比例稀释蛋白质测定染料试剂浓缩物，以制备 Bradford 试剂。
例如：用 40 mL 纯化水稀释 10 mL 蛋白质测定染料试剂浓缩液。注意：根据将使用的孔数计算 Bradford 试剂的数量。移液器 190 将μL的 Bradford 试剂注入微孔板的每个孔（标准曲线和样品孔）。
将每个 BSA 溶液的移液器 10 μL移入标准曲线孔中（一式两份）。用尖端均质化。
将 10 μL的血清样品移入其他孔中（一式两份）。用尖端均质化。
使用 Gen5 软件测量 595 nm 波长下的吸光度。
计算总蛋白浓度（见数据分析）。

硫代巴比妥酸反应物质 (TBARS)

制备 3% (w/v) 5-磺基水杨酸水合物（参见配方 4）和 TBA 0.67%（参见配方 5）溶液。
加500 μL血清或洗过的红细胞到含有 500 μL 3% 5-磺基水杨酸水合物。
将微管涡旋 10 s。
x g离心微管3 分钟。
将微管在 25°C 下放置 15 分钟。
吸取上清液并将其储存在新的微管中。
注意：避免移取棕色颗粒。加入 500 μL纯净水作为空白。
加500 μL上清液至 500 μL的 TBA 溶液在每个样品的管中。
涡流管 10 s。
在水浴中将混合物在 95°C 下加热 30 分钟，管子部分密封。
在冰上冷却 10 分钟以停止进一步的反应。
接下来的步骤 (a–e) 不要超过 30 分钟：
在 25 °C 下平衡空白和样品。
移液器 300 两孔取μL纯化水作为空白。
移液器300 μL样品进入微孔板的每个孔（一式两份）。
轻轻拍打微孔板的两侧数次以轻轻混匀。
使用 Gen5 软件测量 535 nm 波长下的吸光度。
计算 TBARS 浓度（参见数据分析）。

还原硫醇基 (-SH)

准备 0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0 溶液（参见配方 7).
准备 10 mM DTNB 溶液（参见配方 8).
对于洗涤过的红细胞中的 -SH 量化：
移液器 200 μL的0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0在两个孔中作为空白。
将 195 μL的 0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0 溶液移入其他孔中（一式两份）。
吸取 1.0 μL洗涤过的红细胞（一式两份，空白孔除外）。
10 mM DTNB 溶液的移液器 4.0 μL移入样品井（一式两份）。
覆盖微孔板并使用微孔板混合器在 750 rpm 下混合 10 分钟以进行均质化。
在 412 nm 波长处测量吸光度。
对于 -SH 血清定量：
移液器 200 μL的0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0在两个孔中作为空白。
将 175 μL的 0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0 溶液移入其他孔中（一式两份）。
吸取 5.0 μL血清（一式两份，空白孔除外）。
10 mM DTNB 溶液的移液器20 μL移入样品井（一式两份）。
使用微孔板混合器以 750 rpm 的速度混合微孔板 10 分钟。
使用 Gen5 软件测量 412 nm 波长的吸光度。
计算-SH 浓度（参见数据分析）。

过氧化氢 (H 2 O 2 )

准备以下解决方案：
解决方案 1 （见食谱 9）。
解决方案 2（参见方法 10）。
解决方案 3（参见方法 11）。
解决方案 4（参见方法 12）。
磷酸盐缓冲液A （见食谱 13）。
过氧化物酶溶液 (HRP)（参见配方 14）。
准备缓冲溶液 B（参见配方 15）。
移液器 110 取μL缓冲液B加入微孔板的两个孔中作为空白。
洗涤过的红细胞中的H 2 O 2定量：
将5 μL的洗过的红细胞样品移入其他孔中（一式两份）。
将 105 μL的缓冲溶液 B 移入样品井中。
使用微孔板混合器以 750 rpm 的速度混合微孔板 10 s。
微孔板在 37°C 下孵育10 分钟。
吸取 10 μL的 1 M NaOH（参见配方 16）以终止反应。
在 620 nm 波长处测量吸光度。
对于血清样品中的H 2 O 2定量：
将 10 μL的血清样品移入其他孔中（一式两份）。
移液器 100 将μL缓冲液 B 加入样品孔中。
使用微孔板混合器以 750 rpm 的速度混合微孔板 10 s。
将微孔板在 37°C 下孵育 10 分钟。
吸取 10 μL的 1 M NaOH 以停止反应。
使用 Gen5 软件测量 620 nm 波长下的吸光度。
计算 H 2 O 2浓度（见数据分析）。

超氧化物歧化酶 (SOD)

准备 1 M TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 8.0 溶液（参见配方 17）。
准备 10 mM 邻苯三酚溶液（参见配方 18）。
移液器 147 μL的 1 M TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 8.0 溶液作为空白放入微孔板的两个孔中。
移液器 144 μL的 1 M TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 8.0 到其他井中（一式两份）。
吸取 3.0 μL洗涤过的红细胞/血清（一式两份，空白孔除外）。
轻轻拍打微孔板的两侧数次以轻轻混匀。
将 3.0 μL的 10 mM pyrogallol 溶液添加到所有孔中，包括空白（30 s，用于在所有微孔板中移液）。
轻轻拍打微孔板的两侧数次以轻轻混匀。
在 25°C 和 420 nm 波长下测量 0 (T0) 和 10 (T10) 分钟时间间隔内的吸光度。
使用 Gen5 软件计算 SOD 浓度（参见数据分析）。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH- Px或GPx ）

准备以下解决方案：
注意：所有溶液（50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7.6 和 7 mM 叔丁基氢过氧化物除外）和试剂必须保存在冰上，直到进行测定。 0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0 溶液（参见配方 7）。
50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7.6 溶液（参见配方 19 ）。
1% (w/v) NaHCO 3和 1 mM EDTA 溶液（参见配方 20 ）。
10 mM HCl 溶液（参见配方 21）。
0.1 M 还原型谷胱甘肽 (GSH) 溶液（参见配方 22 ）。
10 U/mL 谷胱甘肽还原酶 (GSH-Rd) 溶液（参见配方 23 ）。
7 mM叔丁基氢过氧化物溶液（参见配方 24 ）。
4 mM NADPH 溶液（参见配方 25 ）。
准备包含以下内容的 MIX 解决方案：
注意：MIX 溶液必须在检测前立即制备。建议在多达 16 个重复样品中触发反应。如果您准备 16 个以上的重复样品，由于反应之间的时间很长，结果会有所不同。 240 μL的 0.1 M GSH 溶液。
1,200 μL的 10 U/mL GSH-Rd 溶液。
1,200 μL的 4 mM NADPH。
将此 MIX 解决方案放在冰上。
移液器 100 μL的 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7.6 溶液在微孔板的所有孔中。
将 1.0 μL的血清或 0.5 μL的洗涤红细胞移入所有孔中（一式两份）。
轻轻拍打微孔板的两侧数次以轻轻混匀。
MIX 溶液的移液器50 μL移入所有孔中。
轻轻拍打微孔板的两侧数次以轻轻混匀。
7 mM 叔丁基氢过氧化物溶液的移液器20 μL移入所有孔中（以启动反应）。
注意：将 7 mM 叔丁基氢过氧化物溶液移入样品井需要 15 秒，并在多达 16 个重复样品中触发反应。快速均质化微孔板。
使用 Gen5 软件在 340 nm 波长的微孔板中，在 25°C 下每隔一分钟测量吸光度 5 分钟。
计算 GSH- Px浓度（见数据分析）。

过氧化氢酶 (CAT)

准备 0.1 M NaH 2 PO 4 ·H 2 O 溶液（参见配方 26 ）。准备 1 MH 2 O 2溶液（参见配方 27 ）。验证过氧化氢摩尔浓度：将 1,000 μL的 0.1 M NaH 2 PO 4 ·H 2 O 溶液移入石英比色皿（比色皿 1）中作为参考位置的空白。
将 990 μL的 0.1 M NaH 2 PO 4 ·H 2 O 溶液移至另一个位于读数位置的石英比色皿（比色皿 2）中。
在 UV1800 分光光度计中选择 AUTO ZERO进行校准。
等到吸光度达到零。
将比色皿 1 保持在参考位置。
将 10 μL的 1 MH 2 O 2添加到比色杯 2 中。
快速均质化。
将比色皿 2 返回到读数位置。
在 240 nm 波长处测量吸光度。
计算过氧化氢实际摩尔浓度（参见数据分析和注释）。
清洗两个比色杯。移取 999 μL的 0.1M NaH 2 PO 4 ·H 2 O 溶液和 1.0 μL洗涤过的红细胞到石英比色皿（比色皿 1）中作为空白（在参考位置）。将 978 μL的 0.1M NaH 2 PO 4 ·H 2 O 溶液与 1.0 μL洗涤过的红细胞移至另一个位于读数位置的石英比色皿（比色皿 2）中。中选择自动归零。等到吸光度达到零。将 21 μL的 1 MH 2 O 2添加到石英比色皿 2 中以进行快速均质化。 UVProbe软件在 240 nm 的 UV1800 分光光度计中在 25°C 下执行动力学测量 2 分钟。计算 CAT 浓度（参见数据分析）。

数据分析
为确保样品均匀性，根据每个样品中估计的蛋白质浓度（分别为红细胞和血清的血红蛋白和总蛋白质）调整所有测量值。

化验为了确定在足月妊娠大鼠中重现每种参考方法所需的最小样品体积和试剂浓度，对试剂进行了递减量测试，直到获得的结果等于文献中建立的其他文章的参考值。在 25 °C下对所有样品一式两份进行分析。
血红蛋白吸光度以每分升 (dL) 血红蛋白的克数 (g) 表示，在 546 nm 处测量（ Tentori和Salvati ，1981 年），并使用复合氰化高铁血红蛋白（血红蛋白-氰化物）单体在 546 nm（11.0 mM）处的消光系数计算-1 cm -1 ) ( Assendelft and Zijlstra , 1975) 和孔中溶液的光程 (0.6 cm)，使用 Gen5 软件。
Hb=(A*80*16114.5)/(11.0 (mM)*0.6 (cm)*10*1000)
Hb =血红蛋白浓度，单位为 g/dL A =平均样品吸光度 – 空白吸光度 80 =稀释因子（ Drabkin溶液体积/样品体积） 16114.5 =血红蛋白单体摩尔质量（复杂的氰化高铁血红蛋白 - 血红蛋白 - 氰化物单体，在 546 nm 处） 10 =从 L 到 dL 的转换 1000 =从毫克到克的转换
总蛋白浓度使用 Gen5 软件通过 Bradford 的方法 (1976) 确定总蛋白质吸光度值以对氧化应激生物标志物进行归一化。总蛋白浓度由从标准曲线获得的线性方程确定。标准曲线是从标准物质的浓度与其来自检测系统的信号强度之间的关系获得的连续增加或减少的点。图中最重要的部分是二次方程，从中可以计算出浓度。该图还提供了 R 2的值，即角系数的值。 R²的值越接近1，点线性回归描述的线越好，旨在得到线≥0.99。量化需要了解测得的响应与分析物浓度之间的依赖关系。线性通过内部或外部标准化获得，并制定为数学表达式，用于计算实际样品中待测分析物的浓度。连接两个变量的直线方程为：
y=ax+b
y = 测得的响应（吸光度） x = 浓度 a = 分析曲线的斜率 = 灵敏度 b = x = 0 时与 y 轴的交点
®中的标准曲线计算线性方程，请按照图 5–8 中描述的步骤进行操作：

图 5. 从标准曲线计算线方程的步骤 1、2 和 3

图 6. 从标准曲线计算线方程的第 4 步

图 7. 从标准曲线计算线方程的第 5 步

图 8. 从标准曲线计算线性方程的步骤 6 和 7
y = 测得的响应（吸光度） x = 总蛋白浓度，单位为μg / μL 457.94 = 分析曲线的斜率 = 灵敏度 127.53 = x = 0 时与 y 轴的交点 0.9978 = 角度系数注意：如果 R 2值 < 0.98，重复标准曲线测量。
要计算血清样本中的总蛋白浓度，请遵循以下示例：考虑到血清样品的吸光度为 500，计算如下：
y=457.94x+127.53
500=457.94x+127.53
x=(500-127.53)/457.94
x = 0.81 μg / μL样品中的总蛋白。要将μg / μL转换为 g/dL，请将浓度值除以 10。
注意：如果血清样品的吸光度值高于1.0 BSA溶液浓度的吸光度（标准曲线），则必须将血清样品用纯化水进行1:2稀释，重新测定吸光度。然后，总蛋白质浓度值 (g/dL) 必须乘以稀释因子（在这种情况下，乘以 2）。
硫代巴比妥酸反应物质 (TBARS) 使用 Gen5 软件在 535 nm 处测量吸光度。结果分别表示为洗涤过的红细胞或血清样品中每毫克 Hb 或总蛋白的nM TBARS（ nM /mg Hb 或总蛋白）。 MDA-TBA 复合消光系数为 1.56 × 105 M -1 cm -1在 25 ºC（ Buege和 Aust，1978）和 0.9 cm 光程用于计算。
TBARS= {[(A/(156000 (M)*0.9 (cm) ))*2]/(Hb or PTN mass (mg) )}*10^9
TBARS = 以nM /mg Hb 或总蛋白表示的硫代巴比妥酸活性物质浓度 A =平均样品吸光度 – 空白吸光度 2 =样品稀释系数 10 9 =从 M 到nM的转换 Hb =通过Drabkin溶液获得的浓度，以 g/dL 表示总蛋白 (PTN) =由于 Bradford 方法获得的 PTN 浓度以μg / μL表示，因此需要将其除以 10 以转换为 g/dL
按照以下步骤获取 Hb 或 PTN 质量（mg）：要将 g/dL（Hb 或 PTN 浓度）转换为 mg/mL，必须乘以 10（g 转换为 mg，dL 转换为 mL）。此外，使用的体积 (0.5 mL) 必须在最后一次转换后通过乘法插入。最后，总转化为：Hb 或 PTN 浓度 (g/dL x 10) = Hb 或 PTN 浓度 (mg/mL x 0.5 mL) = Hb 或 PTN 质量 (mg)

还原硫醇基 (-SH) 使用 Gen5 软件在 412 nm 处测量吸光度。结果表示为每 mg Hb 或总蛋白的 mM SH（mM/mg Hb 或总蛋白）。计算中使用了5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) 消光系数（25°C 时为 14150 M -1 /cm -1 ）（Riddles 等人，1983 年）和 0.6 cm 光程。
SH= [((A/(14150 (M)*0.6 (cm) )))/(Hb or PTN mass (mg) )]* 10^3
SH =以 mM/mg Hb 或总蛋白为单位的浓度 A =平均样品吸光度 – 空白吸光度 10 3 =从 M 到 mM 的转换 Hb =通过Drabkin溶液获得的浓度，以 g/dL 表示 PTN =由于 Bradford 法获得的 PTN 浓度表示为μg / μL ，因此需要将其除以 10 以换算为 g/dL
按照以下步骤获取 Hb 或 PTN 质量（mg）：要将 g/dL（Hb 或 PTN 浓度）转换为 mg/mL，必须乘以 10（g 转换为 mg，dL 转换为 mL）。此外，测定中使用的样品体积 (mL) 必须在最后一次转换后通过乘法插入最后，总转化为：Hb 或 PTN 浓度 (g/dL x 10) = Hb 或 PTN 浓度（mg/mL x 测定中使用的样品体积）= Hb 或 PTN 质量（mg）

过氧化氢 (H 2 O 2 ) 使用 Gen5 软件在 620 nm 波长下测量吸光度。结果表示为每毫克血红蛋白或总蛋白的µM H 2 O 2 (µM/mg Hb 或总蛋白)。 H 2 O 2酚红氧化的消光系数是根据我们实验室在 37 °C (0.0296 µM -1 cm -1 ) 和 0.33 cm 光程下调整后的标准曲线计算得出的。
H_2 O_2= ((A/(0.0296 (µM) * 0.33 (cm))))/(Hb or PTN mass (mg))
H 2 O 2 = µM/mg Hb 或总蛋白浓度 A =平均样品吸光度 – 空白吸光度 Hb =通过Drabkin溶液获得的浓度，以 g/dL 表示 PTN =由于 Bradford 法获得的 PTN 浓度表示为μg / μL ，因此需要将其除以 10 以换算为 g/dL
按照以下步骤获取 Hb 或 PTN 质量（毫克）：要将 g/dL（Hb 或 PTN 浓度）转换为 mg/mL，必须乘以 10（g 转换为 mg，dL 转换为 mL）。此外，测定中使用的样品体积 (mL) 必须在最后一次转换后通过乘法插入。最后，总转化为：Hb 或 PTN 浓度 (g/dL x 10) = Hb 或 PTN 浓度（mg/mL x 测定中使用的样品体积）= Hb 或 PTN 质量（mg）

超氧化物歧化酶 (SOD) 使用 Gen5 软件在 420 nm 的微孔板中，在 25 °C 的 0 (T0) 和 10 (T10) 分钟的时间间隔内立即测量吸光度。对于计算，使用空白和样品在时间 T0 和 T10 的吸光度。 SOD 的活性通过样品对邻苯三酚的抑制百分比间接计算。因此，计算是按照以下步骤进行的：
计算 SOD 样品对邻苯三酚自氧化的抑制百分比：

x%= ((Abs Sample T10 – Abs Sample T0))/(Abs Blank T10 – Abs Blank T0)*100
x% = SOD 样品中邻苯三酚自氧化的百分比因此，邻苯三酚自氧化的抑制等于 100 – x%。
考虑到 1 IU 是能够抑制 50% 邻苯三酚氧化的体积，SOD 活性的计算（ Marklund和Marklund ，1974）：

y= (50%*0.003)/(100-x%)
y =抑制 50% 邻苯三酚自氧化的样品体积 (mL) 50% =等于 1 U SOD 的邻苯三酚抑制百分比 0.003 =测定中样本的体积 (mL) 100-x% =样品抑制邻苯三酚的百分比
SOD酶活性：

[SOD]= 100/(y (mL)*Hb or PTN mass (mg))
[SOD] =以 IU/mg Hb 为单位的酶活性 Y =抑制 50% 邻苯三酚自氧化的样品体积 (mL) 100 =从 dL 到 mL 的转换系数，参考 Hb 值（1 dL = 100 mL） Hb = 通过Drabkin溶液获得的浓度，以 g/dL 表示 PTN = 由于 Bradford 法获得的 PTN 浓度表示为μg / μL ，因此需要将其除以 10 以换算为 g/dL
按照以下步骤获取 Hb 或 PTN 质量（mg）：要将 g/dL（Hb 或 PTN 浓度）转换为 mg/mL，必须乘以 10（g 转换为 mg，dL 转换为 mL）。此外，测定中使用的样品体积 (mL) 必须在最后一次转换后通过乘法插入。最后，总转化为：Hb 或 PTN 浓度 (g/dL x 10) = Hb 或 PTN 浓度（mg/mL x 测定中使用的样品体积）= Hb 或 PTN 质量（mg）
谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH- Px ) 的吸光度变化 (ΔA 340 )，结果表示为 mM 的 GSH- Px /min/mg Hb 或总蛋白。 NADPH 消光系数（6.220 M -1 cm -1在 25 °C）（ Fruscione等人，2008）和 0.5 cm 光程用于计算。
GSH-Px= [(((∆A_(340/min))/(6220 (M)*0.5 (cm) )))/(Hb or PTN mass (mg) )]*10^3
GSH- Px =以 mM/min/mg Hb 或总蛋白为单位的活性 ΔA 340/min =吸光度平均值 10 3 =从 M 到 mM 的转换 Hb =通过Drabkin溶液获得的浓度，以 g/dL 表示 PTN =由于 Bradford 法获得的 PTN 浓度表示为μg / μL ，因此需要将其除以 10 以换算为 g/dL
按照以下步骤获取 Hb 或 PTN 质量（mg）：要将 g/dL（Hb 或 PTN 浓度）转换为 mg/mL，必须乘以 10（g 转换为 mg，dL 转换为 mL）。此外，测定中使用的样品体积 (mL) 必须在最后一次转换后通过乘法插入。最后，总转化为：Hb 或 PTN 浓度 (g/dL x 10) = Hb 或 PTN 浓度（mg/mL x 测定中使用的样品体积）= Hb 或 PTN 质量（mg）
过氧化氢酶 (CAT) 过氧化氢摩尔浓度：验证 H 2 O 2吸光度后，执行方程式以了解溶液的摩尔浓度。例如，H 2 O 2吸光度为0.416，H 2 O 2在25℃时的摩尔吸光率为43.6。所以： C=A/ε → C=0.416/43.6 → C = 0.0095 M = 9.5 毫米
C =浓度 ( mMol /L) A =吸光度 ε =摩尔吸光度 (M -1 )
因此，虽然比色皿中的溶液浓度应为 10 mM（理论值），而不是 9.5 mM。要校正溶液浓度，请执行以下等式：
1个 × V 1 = C 2 × V2 _
C 1 =实际浓度 V 1 =移液体积 C 2 =制备的H 2 O 2溶液的浓度 V 2 = 比色皿 2 中要吸取的体积
9.5 毫米× V 1 = 10 毫米× 10 µL
V 1 = 10.5 µL – 必须在比色皿中移液以获得 10 mM 的最终溶液的体积。在测定中， H 2 O 2的最终浓度必须为 20 mM。因此，将移入比色皿的溶液体积为 21 µL ( V 1 × 2).
猫活动 UVProbe软件计算每分钟的吸光度变化，结果表示为 mM of CAT/min/mg Hb (mM/min/mg Hb)。 H 2 O 2消光系数（43.6 M -1 cm -1在 25 °C）（Noble 和 Gibson，1970）和 1.0 cm 光程用于计算。
CAT= [(((∆A_(240/min))/(43.6 (M)*1.0 (cm) )))/(Hb mass (mg) )]*10^3
CAT =以 mM/min/mg Hb 为单位的活性 = ΔA 240/min平均吸光度差值 10 3 =从 mol 到 mmol 的转换 Hb =通过Drabkin溶液获得的浓度，以 g/dL 表示
按照以下步骤获取 Hb 质量 (mg)：要将 g/dL（Hb 浓度）转换为 mg/mL，必须乘以 10（g 转换为 mg，dL 转换为 mL）。此外，测定中使用的样品体积 (mL) 必须在最后一次转换后通过乘法插入。最后，总转换为：Hb 浓度 (g/dL x 10) = Hb 浓度（mg/mL x 测定中使用的样品体积）= Hb 质量（mg）

Statistica ( StatSoft )获取和分析所有数据。 p 值 ≤ 0.05 被认为具有统计学意义。
结果平均总蛋白和血红蛋白浓度如图 9 所示。这些测量值分别用于标准化血清和洗涤红细胞中抗氧化酶的活性和氧化还原状态标志物的浓度。与稀释到纯净水中的血红蛋白浓度相比，稀释到稳定溶液中的样品中的血红蛋白浓度更高（p = 0.002， t检验）（图 9）。

图 9. 蛋白质分析。 (A) 在稳定溶液和纯净水中稀释的样品的血红蛋白浓度。 (B) 血清样本的总蛋白浓度。提供每个标记的原始数据。
TBARS 和 SH 测量是在稀释到纯净水溶液中的洗涤过的红细胞样品中进行的，因为稳定溶液会干扰测定结果（图 10）。所有测定中的测定内变异系数被认为很低（高达 10%）。在血清样品中未检测到 CAT 活性。尽管针对此测定测试了 1 至 50 µL 的样本量，但在健康动物中未检测到任何活动。此外，虽然在血清中检测到每毫克总蛋白约 0.044 mM -SH 的浓度，但这些浓度比在洗涤过的红细胞中发现的浓度低约 60 倍 (2.74 mM/mg Hb)（图 11）。

图 10. 洗涤过的红细胞样本中氧化应激状态的生物标志物。足月妊娠大鼠洗涤过的红细胞样本中的抗氧化酶活性和氧化还原状态标志物。 (A) 超氧化物歧化酶 (SOD)； (B) 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH- Px )； (C) 过氧化氢酶 (CAT)； (D)硫代巴比妥酸活性物质（TBARS）； (E) 还原硫醇基团 (-SH)； (F) 过氧化氢 ( H 2 O 2 ) 。提供每个标记的原始数据。

图 11. 血清样本中氧化应激状态的生物标志物。足月妊娠大鼠血清样本中抗氧化酶的活性和氧化还原状态标志物。 (A) 超氧化物歧化酶 (SOD)； (B) 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH- Px )； (C)硫代巴比妥酸活性物质 (TBARS)； (D) 还原硫醇基团 (-SH)； (E) 过氧化氢 ( H 2 O 2 )。提供每个标记的原始数据。

笔记
根据使用的稀释剂（纯净水或稳定溶液），测定血红蛋白 (Hb) 浓度并将其用于使洗涤过的红细胞中的氧化应激生物标志物（SOD、GSH- Px 、CAT、-SH、TBARS 和 H 2 O 2 ）正常化.因此，必须两次测定血红蛋白浓度：在纯净水中和在稳定溶液中。
需要强调的是，在氧化应激生物标志物的所有公式中，Hb 和总蛋白浓度应以质量 (mg) 为单位进行转换。
在TBARS 测定中，所有样品必须在 25°C 下解冻。 TBA 溶液制备后，pH 应低于 2.0。如果 pH 值高于 2.0，则纯化水的电导率可能会受损。
在还原硫醇基团 (-SH)、过氧化氢 (H 2 O 2 )、超氧化物歧化酶 (SOD)、GSH- Px和 CAT 测定中，所有样品都必须在冰上解冻并保持冷却，以免发生降解。
过氧化氢（ H 2 O 2 ）是一种挥发性物质；因此，在执行测定时，有必要执行 H 2 O 2实际摩尔浓度的方程式。
为了减少样品体积和试剂以在微孔板和比色皿之间获得相同的结果，研究人员决定使用每个生物标志物的这些最终方程，遵循比色皿方法的光程（2 mL），但样品和试剂体积被调整为微孔板体积（孔总体积 360 μL ）。

食谱
稳定溶液（2.7 mM EDTA 和0.7 mM 2-巯基乙醇）
乙二胺四乙酸 10 毫升 2-巯基乙醇 0.5 微升 – 8 °C下最多可稳定六个月。
德拉布金的解决方案
铁氰化钾 200 毫克氰化钾 50 毫克碳酸氢钠3 1 克纯净水 1,000 mL 注意： Drabkin 的解决方案对光敏感。保存在 4 °C 的琥珀色瓶中避光。该溶液在 2 – 8°C下最多可稳定六个月。
1 μg / μL原液
在 1 mL 纯净水中稀释 1 g BSA。 – 8 °C下最多可稳定六个月。
3% (w/v) 5-磺基水杨酸水合物（100 个样品）
磺基水杨酸 3 克超纯水 100 mL 在容量瓶中加入纯净水稀释磺基水杨酸。用实验室薄膜密封。保持在 25°C。注意：溶液必须新鲜配制。使用后，丢弃剩余的溶液。
硫代巴比妥酸溶液 (TBA) 0.67%（200 个样品）
在琥珀瓶中的 95 mL 纯净水中稀释 0.67 克 TBA。
保持瓶子部分密封，并在水浴中将溶液加热至 80°C 30 分钟。
等到溶液达到 25°C。
通过添加 1 M NaOH 将 pH 值调节至 2.0（参见配方16）。
将溶液加入烧杯中，用纯净水补足至 100 mL。
注意：溶液必须在检测当天新鲜配制。该解决方案对光敏感。储存在琥珀色瓶中。使用后，丢弃剩余的溶液。
1M 盐酸
在 100 mL 纯净水中稀释 8.3 mL HCl。 – 8 °C下的稳定时间不确定。
0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0（用于 250 个重复样品）
稀释 1.2114 g TRIS- Ultrapure TM和 0.0146 g EDTA。
通过添加 1 M HCl 将 pH 值调节至 8.0（参见配方6）。
将溶液转移到烧杯中，用纯净水补足至 100 mL。
– 8 °C下的稳定时间不确定。
10 mM DTNB（用于 250 个重复的洗涤红细胞样本和 100 个重复的血清样本）
在 2 mL 乙醇中稀释 0.0079 克 DTNB。
分装两个微管中的总体积（每个 1 mL）
密封并储存在-20°C。
注意：溶液必须新鲜配制并储存在-20°C 的密封管中。使用后，丢弃剩余的溶液。
溶液 1：1.71 M NaCl、34 mM KCl、14 mM K 2 HPO 4 、0.1 M Na 2 HPO 4
在容量瓶中混合 8 克 NaCl、0.2 克KCl 、0.2 克 K 2 HPO 4和 1.15 克 Na 2 HPO 4 。
加入 80 mL 纯净水并用实验室薄膜密封。
保持在 25 °C，直到制备缓冲液 B（配方 15）。
制备缓冲液 B 后，在 2–8 °C 下储存。
注意：解决方案在未确定的时间内稳定。
解决方案 2：90 mM CaCl 2
在 30 mL 纯净水中稀释 0.3 g CaCl 2 。
用实验室薄膜均化和密封溶液。
保持在 25 °C，直到制备缓冲液 B（配方 15）。
制备缓冲液 B 后，在 2 – 8 °C下储存。
注意：解决方案在未确定的时间内稳定。
解决方案 3：0.11 M MgCl 2
在 30 mL 纯净水中稀释 0.3 g MgCl 2 。
用实验室薄膜均化和密封溶液。
保持在 25 °C，直到制备缓冲液 B（配方 15）。
制备缓冲液 B 后，在 2 – 8 °C下储存。
注意：解决方案在未确定的时间内稳定。
溶液4：0.1%酚红
在管中的 30 mL 纯净水中稀释 0.3 g 酚红。
将溶液在 54°C 的水浴中均匀化，直至完全溶解。
从水浴中取出溶液。
用实验室薄膜密封管子。
保持在 25 °C，直到制备缓冲液 B（配方 15）。
配制缓冲液 B 后，于 25 °C 保存。
注意：解决方案在未确定的时间内稳定。
磷酸盐缓冲液A
将 2.61 g K 2 HPO 4添加到 150 mL 纯净水中。
用实验室薄膜均化和密封溶液。
将溶液保持在 25°C。
将 2.06 g KH 2 PO 4添加到 150 mL 纯净水中。
用实验室薄膜均化和密封溶液。
将溶液保持在 25°C。
在容量瓶中加入 100 mL K 2 HPO 4溶液并加入 KH 2 PO 4溶液直至达到 pH 7.0。
储存在 2 – 8 °C。
注意：解决方案在未确定的时间内稳定。
过氧化物酶溶液 (HRP)
将 5 mg HRP 溶解在 1 mL 磷酸盐缓冲液 A 中。注意：溶液必须新鲜配制。使用后，丢弃剩余的溶液。

缓冲液B
10.56 mL 纯净水 0.960 mL 溶液 1 0.120 mL 溶液 2 0.120 mL 溶液 3 0.120 mL 溶液 4 0.120 mL 过氧化物酶溶液 (HRP) 注意：溶液必须新鲜配制。使用后，丢弃剩余的溶液。
1M 氢氧化钠
在 0.10 mL 纯净水中稀释 0.040 g NaOH。 – 8 °C下的稳定时间不确定。
1 M TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 8.0（用于 150 个重复样品）
稀释 6.0570 g TRIS- Ultrapure TM和 0.0731 g EDTA。
通过添加 1 M HCl 将 pH 值调节至 8.0（参见配方6）。
将溶液转移到烧杯中，用纯净水定容至 50 mL。
储存在容量瓶中。
– 8 °C下的稳定时间不确定。
10 mM 邻苯三酚溶液（用于 250 个重复样品分析）
在 5 mL 10 mM HCl 溶液中稀释 0.0063 g 焦没食子酸（参见配方21）。注意：溶液必须新鲜配制。由于要称重的连苯三酚数量，最小体积为 5 mL。使用后，丢弃剩余的溶液。
50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7.6（用于 500 个重复样品分析）
稀释 0.6057 g TRIS- Ultrapure TM和 0.1461 g EDTA。
通过添加 1 M HCl 将 pH 值调节至 7.6（参见配方6）。
将溶液转移到烧杯中，用纯净水将溶液定容至 100 mL。
储存在容量瓶中。
– 8 °C下的稳定时间不确定。
1% NaHCO 3和 1 mM EDTA
在容量瓶中将 1 g NaHCO 3和 0.0292 g EDTA 稀释至 100 mL 纯净水。 – 8 °C下的稳定时间不确定。
10 mM HCl 溶液
稀释 50 μL HCl。 – 8 °C下的稳定时间不确定。
0.1 M 还原型谷胱甘肽 (GSH)（用于 60 个重复样品分析）
μL的 10 mM HCl 溶液中稀释 0.0184 g GSH （参见配方21）。注意：溶液必须新鲜制备并保存在冰上。使用后，丢弃剩余的溶液。
10 U/mL 谷胱甘肽还原酶 (GSH-Rd)（用于 60 个重复样品分析）
将 60 μL的 GSH-Rd 添加到 2.940 mL 的 0.1M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0 中（参见配方 7）。注意：溶液必须新鲜制备并保存在冰上。使用后，丢弃剩余的溶液。 7 mM叔丁基过氧化氢（用于 125 个重复样品分析）
在 5 mL 纯净水中稀释 5 μL叔丁基氢过氧化物。注意：溶液必须新鲜配制。使用后，丢弃剩余的溶液。
4 mM NADPH（用于 60 个重复样品分析）
3 1 mM EDTA中稀释 0.010 g NADPH 。注意：溶液必须新鲜制备并在测定过程中保存在冰上。溶液最多可稳定 4 小时。
0.1 M NaH 2 PO 4 ·H 2 O（用于 200 个样品分析）
在 190 mL 纯净水中稀释 2.7598 g NaH 2 PO 4 ·H 2 O。
通过添加 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.0（参见配方 16）。
将溶液转移到烧杯中，用纯净水将溶液定容至 200 mL。
储存在容量瓶中。
注意：溶液在 2–8 °C 下的稳定时间不确定。
1 M 过氧化氢 (H 2 O 2 )
将 970 μL的过氧化氢添加到 9.03 mL 的纯净水中。注意：溶液必须新鲜配制。使用后，丢弃剩余的溶液。

致谢
作者感谢圣保罗州立大学 (UNESP)博图卡图医学院研究支持中心 (RSC) 在研究设计和统计分析方面做出的宝贵贡献。这项工作得到了 FAPESP/巴西（授权号 2016/25207-5）的支持，由Débora Cristina Damasceno教授博士协调 CAPES（高级员工改进协调）[财务代码 001]向 Yuri Karen Sinzato提供奖学金。

利益争夺
作者没有要声明的竞争利益。

伦理
所有实验程序和动物处理均根据巴西动物实验学院提供的指南进行，该指南与美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南一致。当地动物研究伦理委员会（方案编号：832-2010）批准了所有程序。

参考
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