材料和试剂

1.黑色壁和透明平底的 96 孔测定板（Corning，目录号：3904）
2.PYREX® Delong 摇床锥形瓶，带超深挡板，250 和 1,000 mL（Corning，目录号：4450-250、4446-1L）
3.1.5 mL 微量离心管（USA Scientific，目录号：1615-5500）
4.15 mL 离心管，锥形，无菌，聚丙烯（VWR，目录号 89039-664）
5.血清移液管，无菌包装（Corning，目录号：4487、4488、4489、4490）
6.250 mL 离心管（Corning，目录号：430776）
7.10 kDa NMWL Ultra-4 离心过滤装置（ Amicon ，目录号：UFC803008）
8.蛋白胨（Research Products International，目录号：P20250）；常温保存
9.酵母提取物（ Thermo Scientific，目录号：J23547-A1）；常温保存
10.葡萄糖（VWR，BDH Chemicals，目录号：BDH9230）；常温保存
11.山梨糖醇（Sigma-Aldrich，CAS 50-70-4）；常温保存
12.甲醇（Sigma-Aldrich，CAS 67-56-1）；常温保存
13.细菌琼脂（VWR，生命科学，目录号：J637）；常温保存
14.G418 硫酸盐（Fisher Bioreagents，CAS 108321-42-2）；储存于 4 ℃
15.PureCube INDIGO Ni- MagBeads （磁珠）（Cube Biotech，目录号：75225）
16.磁铁，>835 KA/m（Magneto Inc.，亚马逊）
17.Pierce 荧光蛋白酶活性试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：23266）
a.FTC-酪蛋白（5 mg/mL 超纯水）
b.TPCK-胰蛋白酶（50 mg/mL 在 tris 缓冲盐水中）
c.Tris 缓冲盐水（25 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.2）
18.酵母培养基（见食谱）
BMGY
BMMY
YPD
YPD + G418 (4 mg/mL) 琼脂平板
19.缓冲区（见食谱）
结合缓冲液 pH 8.0
洗涤缓冲液 pH 8.0
洗脱缓冲液 pH 8.0
磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4
20.解决方案（见食谱）
10% 甘油
5% 甲醇
1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0
10 × YNB
500 ×生物素

菌株

1.毕赤酵母GS115（Invitrogen，目录号：C18100）
2.毕赤酵母GS116 < Cn MPR1> (Aaron and Gelli , 2020)

设备

1.-80 °C冰箱
2.-20 °C冰箱
3.4 °C冰箱
4.酸度计
5.Vortex（Scientific Industries，SKU：SI-0236 或同等产品）
6.吊桶式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R；208 V，60 Hz）
7.Innova 4200 孵化摇床（New Brunswick）或等效温控摇床
8.移液器（Eppendorf、P20、P200、P1000）
9.电源（Bio-Rad，型号： PowerPac Universal Power Supply）
10.蛋白凝胶电泳仪（Bio-Rad，型号：Mini-PROTEAN）
11.酶标仪（Molecular Devices，型号： SpectraMax M5e）

程序

以下部分中的步骤是使用甲基营养酵母Pichia pastoris完成的，用于表达重组蛋白。重点重组 Mpr1 6XHIS蛋白是从巴斯德毕赤酵母菌株中分离出来的，该菌株使用由从新型隐球菌KN99 中分离出的MPR1 cDNA组成的构建体进行转化，在 pPIC9K 主链的 C 端带有 6XHIS 标签，如主要文章中所述（亚伦和盖利2020）。该质粒赋予对 G418 的抗性，将其添加到琼脂平板 (4 mg/mL) 中，用于转化毕赤酵母的原始选择和冷冻扩增 (-80 °C ) 当前协议的库存。在整个协议中，我们在无菌场中在明火下处理开放培养物，每 24 小时至少通过明场显微镜检查一次细菌污染。下面描述的体积和浓度最适合我们的目的，但可能需要针对其他实验进行缩放。以下协议可分为三个阶段：（1）生长、诱导和表达； (2)分离纯化； (3) 验证和存储。

A.重组Mpr1蛋白的表达

1.在 YPD + G418 (4 mg/mL) 琼脂板上划线毕赤酵母GS116 菌株（Aaron 和Gelli ，2020）。将板在 30°C 下孵育 72 小时。
注意：任何感兴趣的基因都可以亚克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。
2.从 G418 板中选择一个菌落，并使用火焰灭菌的接种环直接转移到含有 50 mL BMGY 培养基（参见食谱）的 250 mL 带挡板的锥形瓶中。
注意：与非挡板锥形瓶相比，使用带挡板的锥形瓶大大增加了生物量生产。
3.孵育P. pastoris培养物 24 小时，以 300 rpm 的速度摇动。用铝箔松散地盖住烧瓶，以便进行气体交换。
4.x g离心5 分钟。
注：BMGY培养基营养丰富，容易污染培养物；因此，每 24 小时检查一次培养物是否存在任何可能的污染。在我们的案例中，通过明场显微镜检查培养物以排除污染。
5.丢弃上清液并使用 25 mL BMMY（参见食谱）洗涤沉淀物 1-3 次，然后涡旋沉淀物直至其完全重悬。在两次洗涤之间以 3,724 x g的速度向下旋转颗粒。在 BMMY 中重悬细胞并测量 600 nm 处的光密度 (OD 600 )。
注意：按照步骤 1 - 5，我们通常会在 20 mL BMMY 中看到大约 25 的 OD 600 。
6.将细胞混合物添加到所需体积的 BMMY 中，以将培养物稀释至最终 OD 600 = 1。用无菌粗棉布盖住烧瓶，以便进行适当的气体交换。
7.在 30°C 下孵育诱导培养物，摇动 24 小时。
8.将山梨糖醇和甲醇添加到培养物中，最终浓度分别为 50 g/L 和 0.5%。在 30°C 下孵育，摇动 24 小时。
注意：山梨糖醇是一种非抑制性碳源，我们发现甲醇与山梨糖醇的共同喂养机制会增加生物量产量（图 1 和 2）。

图 1.毕赤酵母生物量生产的可视化。 A.在 BMMY 中启动诱导，OD 600 = 1.0。 B. 在 BMMY 中诱导 24 小时后，在与 50 g/L 山梨糖醇和 0.5% 甲醇共同喂养之前。 C。在与山梨糖醇和甲醇共同喂养 24 小时后。在此阶段，OD 600的测量值通常远高于 18。

图 2.补充山梨糖醇的毕赤酵母培养物的光密度。使用 0.5% 甲醇 (MeOH) 或与 0.5% MeOH 和 50 g/L 山梨糖醇或 2% MeOH 和 50 g/L 山梨糖醇共同补料的培养物的光密度 (OD 600 )比较。在起始 OD 600的BMMY 培养基中接种毕赤酵母 24 小时后，将培养物共喂养 1.在共同喂养开始 24 小时后记录培养物的OD 600测量值。

B.重组Mpr1蛋白的分离纯化

1.对于PureCube INDIGO Ni- MagBeads ，在 15 mL 锥形离心管中混合并等分珠子，然后短暂离心珠子；然后，将等分试样放在强磁铁附近，以便用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水去除和更换储存缓冲液上清液。将珠子放在冰上并查看制造商 ( PureCube ) 提供的协议以获取更多信息。
注意：如果诱导 250 mL 培养物，请使用存储中的 750 µL 珠子。这相当于大约 188 µL 的珠子（25% 的存储溶液包含结合能力为 70 mg/mL 的珠子）。
2.在液体循环中将珠子高压灭菌 15 分钟。在继续之前让珠子冷却。
3.P. pastoris文化的最终 OD 600 。将培养物倒入离心瓶中。
毕赤酵母培养物的光密度 (OD 600 ) ，从 ~8 到 >20（图 2）。
4.以 3,724 × g离心5 分钟。倒出并保留上清液。
5.每 500 mL 收集的培养上清液中加入 1.5 mL 的 25% (v/v) Ni- MagBeads 。在 30 °C 下孵育，以 250 rpm 的速度摇动 30分钟。
6.使用强力磁铁从上清液中收集 Ni- MagBeads 。将上清液倒入新容器中，然后取出磁铁并将珠子重新悬浮在 6 mL 的结合缓冲液中。将重新悬浮的珠子转移到 15 mL 锥形管中。至少重复两次。用 10 mL 的结合缓冲液清洗，直到收集完所有珠子。
7.将收集的珠子放入离心管中，并在 4°C 下以 3,724 x g离心5 分钟。
8.磁性沉淀MagBeads并去除结合缓冲液。向珠子中加入 10 倍珠子体积的洗涤缓冲液。移除磁铁并涡旋至少 2 分钟。
注意：每个 250 mL 培养体积，最初接收 188 μL 的珠子，在此步骤中用 1.88 mL 洗涤缓冲液洗涤。我们发现清洗一次足以去除任何异物，但仍清洗三次而没有明显的MagBeads损失。
9.短暂离心并用磁铁收集管底部的珠子，以便于将洗涤缓冲液更换为洗脱缓冲液。使用洗脱缓冲液初始珠体积的两倍。涡流珠 5 分钟并以 3,724 × g离心在 4 °C 下放置 5 分钟。
注意：在此阶段可以执行多个洗脱步骤以丰富 Mpr1；然而，我们发现一个洗脱步骤就足够了。
10.将含蛋白质的洗脱缓冲液上清液转移到 10 kDa NMWL Ultra-4 离心过滤装置中。
11.x g离心并浓缩样品15 分钟。用 Bradford (Bradford, 1976) 的方法测量蛋白质浓度。
注意：此步骤的时间可能会有所不同，具体取决于所需的最终浓度和添加的洗脱缓冲液的数量。在我们的例子中，上述条件产生了大约 300 µL 的蛋白质悬浮在洗脱缓冲液中。在步骤 11 之后将 PBS 更换为洗脱缓冲液，离心 8 分钟而不是 15 分钟。平均而言，从 500 mL BMMY 培养物中提取了 2.5 mg Mpr1（图 3）。

图 3. 在添加山梨糖醇的培养基中生产 Mpr1。从用 0.5% 甲醇 (MeOH)、0.5% MeOH 补充 25 g/L 山梨糖醇或 0.5% MeOH 和 50 g/L 山梨糖醇培养的培养物中提取的 Mpr1 重组蛋白的数量比较。数据代表来自四种不同文化的 Mpr1 提取物。当甲醇浓度保持在 0.5% 时，山梨糖醇的添加促进了 Mpr1 蛋白的产生。

12.通过 SDS-PAGE 电泳评估重组蛋白的纯度。
注意：考马斯亮蓝或银染 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶将显示分离的重组蛋白。蛋白质银染是一种超灵敏的蛋白质检测方法，可用于检查分离物中是否存在污染蛋白质。在步骤 11 之后，通过银染 SDS-PAGE 电泳检查Mpr1 重组蛋白产生了一条多肽带（图 4）。

C.Mpr1 的活性、纯度和储存

1.在保存一部分 Mpr1 重组蛋白用于蛋白水解活性和其他测定后，将剩余部分快速冷冻在液氮中并储存在-80°C。
注意：蛋白水解活性测定需要 50 µL 或大约最终洗脱体积的 10%。我们在各种储存条件下进行了蛋白水解活性测定（数据未显示），发现与未进行冻融的蛋白质相比，液氮冷冻保存仅产生少量蛋白水解活性损失。
2.对酶标仪进行编程，使其在至少一小时内以 5 分钟的间隔测量荧光（485/538 nm 激发/发射），在读数之间摇动。灵敏度应设置为中或低。
3.按照制造商的说明，在 4°C 下逐渐解冻 FTC-酪蛋白（5 毫克/毫升）和 TPCK-胰蛋白酶（50 毫克/毫升）的等分试样。将三缓冲盐水中的 FTC-酪蛋白稀释至 10 μg/mL，并暂时储存在 4°C。
注意：10 mL 的 10 µg/mL FTC-酪蛋白足以用于 96 孔板。
4.将 TBS 中的 Mpr1 重组蛋白稀释至 200 μg/mL 和 20 μg/mL，这样在完成时每个稀释至少有 350 μL。留出 350 μL 用于这些稀释的 TBS 作为空白。
5.在 TBS 中将解冻的 TPCK-胰蛋白酶等分试样稀释至 1 µg/mL。
6.添加 100 μL 的 200 μg/mL Mpr1、20 μg/mL Mpr1、1 μg/mL TPCK-胰蛋白酶和 TBS 空白，以在不透明壁（黑色或白色）、底部透明的 96 孔板中加入三孔。
7.在每口井中加入 100 μL 的 10 μg/mL FTC-酪蛋白。
注意：由于此步骤的时间敏感性，最好使用多通道移液器完成此操作，尽管血清学移液器可能就足够了。
8.取下板上的盖子并将其放入板读取器中。在添加 FTC 酪蛋白后 5 分钟开始执行该程序。蛋白水解活性是通过荧光共振能量转移信号的减少来测量的（图 5）。

数据分析

图 4. 重组 Mpr1 金属蛋白酶的纯化。使用 (A) 考马斯染色和 (B) 银染 10% SDS-page 凝胶对分离的 Mpr1 重组蛋白进行 SDS-PAGE 分析，在还原条件下使用蛋白质分子标记（右泳道，kDa ）。粗体箭头表示重组 Mpr1 蛋白为单个条带（左泳道）。

图 5. 与 0.5 µg/mL 胰蛋白酶（红色）相比，Mpr1 在 100（深蓝色）和 10 µg/mL（浅蓝色）时的蛋白水解活性。使用 Pierce 荧光蛋白酶测定试剂盒通过荧光共振能量转移 (FRET) 信号的减少来测量蛋白水解活性。在每个时间点减去仅含有蛋白水解底物（FITC 偶联酪蛋白）的对照孔中的平均荧光强度。每个数据点代表三个读数的平均值（条：SD）。用来自五种不同提取物的 Mpr1 蛋白重复该测定，结果相似。 Mpr1 在快速冷冻和储存数周后保留了蛋白水解活性（未显示）。

笔记

1.共同进料优化：我们优化了山梨糖醇和甲醇的浓度以生产我们感兴趣的蛋白质，这是一种具有潜在异常特性的金属蛋白酶。其他蛋白质的山梨糖醇和甲醇的最佳浓度可能与我们在此报告的不同。
2.毕赤酵母初始生长期间使用的培养基很容易被污染；因此，良好的无菌技术对于蛋白质提取的成功至关重要。
3.可变性：该协议对微小偏差具有鲁棒性。例如，潜伏期的持续时间并不总是恰好是 24 小时。
4.环境影响：在整个协议中，在维持无菌条件的过程中产生了大量塑料废物。可以使用替代品，尽管这些替代品可能有其自身的环境缺陷（例如，在清洁程序中使用腐蚀性化学品）。

食谱

A.酵母培养基

1.BMMY媒体
（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、100 mM 磷酸钾 pH 6.0、1.34% YNB、5% 生物素、0.5% 甲醇）
a.将 20 g 蛋白胨和 10 g 酵母提取物混合，加入去离子 H 2 O 至 700 mL。
b.通过高压灭菌器对介质进行消毒（液体循环 121 °C ，20 分钟）。
c.在无菌条件下，加入 100 mL 磷酸钾，pH 6.0，100 mL 10 × YNB，100 mL 5% 甲醇，最后加入 2 mL 500 ×生物素。
2.BMGY媒体
（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、100 mM 磷酸钾 pH 6.0、1.34% YNB、5% 生物素、1% 甘油）
a.将 20 g 蛋白胨和 10 g 酵母提取物混合，加入去离子 H 2 O 至 700 mL。
b.通过高压灭菌器对介质进行消毒（液体循环 121 °C ，20 分钟）。
c.在无菌条件下，加入 100 mL 1 M 磷酸钾，pH 6.0，100 mL 10 × YNB，100 mL 10% 甘油，最后加入 2 mL 500 ×生物素。
3.YPD
（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖、2% 琼脂）
a.将 20 g 蛋白胨和 10 g 酵母提取物混合，加入去离子 H 2 O 至 950 mL。
b.通过高压灭菌器对介质进行消毒（液体循环 121 °C ，20 分钟）。
c.对于液体介质：加入 50 mL 无菌 40%（w/v）葡萄糖并混合。
d.对于琼脂板：在磁力搅拌板上搅拌高压灭菌的混合物时，每升 YPD 培养基添加 50 mL 无菌 40% 葡萄糖。
e.趁热将培养基倒入塑料培养皿（直径 9 厘米）中
f.让琼脂混合物冷却并凝固。

B.缓冲器

1.结合缓冲液 pH 8.0
50 mM NaH 2 PO 4 、300 mM NaCl 和 10 mM 咪唑
2.洗涤缓冲液 pH 8.0
50 mM NaH 2 PO 4 、300 mM NaCl 和 20 mM 咪唑
3.洗脱缓冲液 pH 8.0
（50 mM NaH 2 PO 4 、300 mM NaCl 和 500 mM 咪唑）

C.解决方案

1.10% 甘油
a.将 100 mL 的甘油与 900 mL 的去离子 H 2 O混合。
b.高压灭菌，室温保存。
2.5% 甲醇
a.将 50 mL 甲醇与 950 mL 去离子 H 2 O混合。
b.过滤灭菌并储存在 4°C。
3.1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0
a.将 132 mL 的 1 MK 2 HPO 4与 868 mL 的 1 M KH 2 PO 4混合。用 KOH 将 pH 值调节至 6.0。
b.高压灭菌，室温保存。
4.10 × YNB
a.称取 34 克不含硫酸铵和氨基酸的 YNB。然后，与 100 g 硫酸铵混合并填充至多 1 L 的去离子 H 2 O。
b.过滤灭菌并储存在 4°C。
5.500 ×生物素
a.将 20 毫克生物素溶解在 100 毫升的去离子 H 2 O中。
b.过滤灭菌并储存在 4°C。

致谢

我们承认我们实验室发表的原始研究论文（Aaron 和Gelli ，2020 年），该协议源自该论文。我们感谢 Hartwell 基金会的支持，感谢Gelli实验室成员提供的有用建议。

利益争夺

作者声明不存在财务或其他竞争利益。

参考

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