材料和试剂
1. 125 mL 烧瓶（PYREX，目录号：4980）
2. 2,800 mL 烧瓶（PYREX，目录号：4420）
3. 移液器吸头
4. 血清移液管
5. 1 L 离心瓶（ Thermo Scientific， Nalgene TM ，目录号：3141-1006）
6. 70 mL 超速离心瓶（Beckman Coulter，目录号： 355622）
7. 37 mL超速离心管（Beckman Coulter，目录号： 344058）
8. 组织研磨机（DWK Life Sciences，目录号： 8853030040）
9. Luria 肉汤（Research Products International，目录号： L24400-5000.0）
10. 很棒的肉汤（Research Products International，目录号：T15100-5000.0）
11. 琼脂（BD，Bacto TM ，目录号：214010）
12. Tris（American Bio，目录号：AB02000-05000）
13. 氯化钠（NaCl）（Dot Scientific，目录号：DSS23020-5000）
14. 甘油（JT Baker，目录号：2136-03）
15. 硫酸卡那霉素（American Bio，目录号：AB01100-00010）
16. 大观霉素（ Research Products International，目录号：S23000-25.0 ）
17. 氯霉素（Sigma，目录号：C0378-25G）
18. 蔗糖（ Sigma-Aldrich，目录号： S0389-1 KG）
19. IPTG（异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷）（American Bio，目录号：AB00841-00010）
20. PMSF（苯甲基磺酰氟）（Dot Scientific，目录号：DSP20270-25）
21. 2-巯基乙醇（ Sigma-Aldrich，目录号：M6250-100ML ）
22. 表达YejM / LapB复合体的 BL21 (DE3) star plysS stra的甘油原液（舒米，2022 ）
23. 盐酸（ JT Baker，目录号： 9535-00 ）
24. LB 培养基（见食谱）
25. LB 琼脂平板（见食谱）
26. 结核病培养基（见食谱）
27. 1 M Tris-HCl，pH 7.8 （参见配方）
28. 裂解缓冲液（见配方）
29. 稀释缓冲液（见配方）
30. 73% 蔗糖（见食谱）
31. 53% 蔗糖（见食谱）
32. 20% 蔗糖（见食谱）

设备

1. 移液器（P200、P 1000）
2. 移液器控制器（ BrandTech Scientific，型号： accu -jet pro）
3. -80℃超低温冷冻箱（ PHCbi ，型号：MDF-U76VA-PA）
4. 微生物培养箱（VWR，型号：F Air 6.3 CF）
5. 培养箱摇床（New Brunswick，型号： Innova TM 44）
6. 离心机（ Thermo Scientific Sorvall ，型号：BP8）
7. 超速离心机（Beckman，型号： Optima TM LE-80K）
8. 高压微流化仪（ Avestin ，型号： Emulsi Flex-C3）
9. 定角转子（Beckman Coulter，型号：Type 45Ti）
10. 吊桶式转子（ Beckman Coulter，型号：SW 28）
11. 超纯水系统（Millipore，型号：Reference A+）
12. pH计（ Apera ，型号：pH700）

程序

A. 制备全细胞膜

1. 在含有 50 µg/mL 硫酸卡那霉素、50 µg/mL 壮观霉素和25 µg / mL氯霉素（ Kan + Spe +凸轮+ ）。在 37°C 的微生物培养箱中孵育板过夜。
2. 125 mL 烧瓶中的20 mL LB 培养基（ Kan + Spe + Cam + ）中。在 37 °C下以 220 rpm 的转速摇动过夜，使细胞生长。
3. 将 10 mL 的过夜培养物转移到2,800 mL 烧瓶（总共 2 L）中的1 L TB 培养基（ Kan + Spe + Cam + ）。在 37°C 下以 220 rpm 的转速将细胞培养至0.6 的OD 600 。
4. 将 200 μL 的 1 M IPTG 添加到 1 L 的细胞培养物中（最终浓度为 0.2 mM），并在 30°C 下孵育细胞，并以 220 rpm 的转速再摇动 4 小时。
5. x g离心培养物10 分钟以收获细胞。
6. 在补充有 1 mM PMSF 和 5 mM 2-巯基乙醇的40 mL 裂解缓冲液（参见食谱）中重悬细胞沉淀。在这一步，重悬的细胞可以在液氮中快速冷冻并储存在-80 °C超低温冰箱中，或者直接进入步骤 A7 以破碎细胞。
7. 将细胞转移到40 mL 组织研磨器中。通过推拉研磨杵 10-20 次使细胞均质化。
8. 的高压 microfluidizer中用两次通过打破细胞。
9. x g离心10 分钟去除细胞碎片。
10. 将上清液转移到70 mL 超离心瓶中，并将裂解缓冲液添加到 ~ 50 mL 的最终体积。小心平衡超速离心瓶。
11. 在 Beckm an Coulter 45Ti 转子中以 40,000 rpm （185,677 g ）在 4 °C下超速离心 2 小时。离心后保留膜沉淀。

B. 分离内膜和外膜

1. 用 40 mL 组织研磨机在 55 mL 的 20% 蔗糖中重新悬浮 ±3 g 膜。
2. 准备六个37 m L 超离心管。在每个管中，从底部到顶部，层 14 mL 的 73% 蔗糖、14 mL 的 53% 蔗糖和 9 mL 的膜重新悬浮在 20% 蔗糖中。
3. °C下，在SW 28 转子中以 23,000 转/分（65,000克）的速度超速离心 18 小时。
4. 分离后，应该有两个波段：上面的波段是 IM，下面的波段是 OM（图 1）。

图 1. IM 和 OM 的分离

5. 切割 P1000 移液器尖端的末端，距离该点约 5 毫米。使用移液器收集上层 IM 层。
6. 使用新的移液器尖端并重复步骤 B5 以收集 OM 层。
7. 要从膜中去除蔗糖，请将 IM 和 OM 分数转移到 70 mL 超离心瓶中。将稀释缓冲液加入瓶中，最终蔗糖浓度为 <10%。小心平衡超速离心瓶。
8. 在 Beckman Coulter 45Ti 转子中以 40,000 rpm （185,677 g ）在 4 °C下超速离心 2 小时。
9. 丢弃上清液并称量膜的湿重。对于 1 g 的膜，添加 10 mL 的裂解缓冲液以使用 40 mL 组织研磨机重新悬浮。
10. 用液氮快速冷冻膜并储存在-80 °C 超低温冰箱中。

笔记

1. 该协议以表达YejM / LapB复合体的大肠杆菌菌株BL21 (DE3) 星形plysS为例，分离 IM 和 OM。该协议也适用于其他大肠杆菌菌株。
2. 本协议中使用的所有缓冲液都保存在 4 °C 。
3. 分离 IM 和 OM 时，对于每个 37 mL 超速离心管，添加的总膜不要超过 0.5 g。否则，IM 和 OM 可能无法很好地分离。
4. 要通过超速离心机去除膜中的蔗糖，必须先将膜稀释至蔗糖终浓度小于 10%。
食谱

1. LB培养基
25 克Luria 肉汤，溶解在 1 升去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。

2. LB琼脂平板
含 1.5% w/v 琼脂的 LB 培养基。

3. 结核培养基
47.6 克极品肉汤和 4 毫升甘油。溶解在 1 L 去离子水中。
在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。

4. 1 M Tris-HCl，pH 7.8
将 121.14 克 Tris 溶解在 800 mL Milli-Q 水中。使用盐酸将 pH 值调节至 7.8。然后加入 Milli-Q 水至终体积为 1 L。

5. 裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.8
300 毫米氯化钠
10% 甘油 (v/v)

6. 稀释缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.8
300 毫米氯化钠

7. 73% 蔗糖
73% w/v 蔗糖
20 毫米 Tris-HCl，pH 7.8

8. 53% 蔗糖
53% w/v 蔗糖
20 毫米 Tris-HCl，pH 7.8

9. 20% 蔗糖
20% w/v 蔗糖
20 毫米 Tris-HCl，pH 7.8

致谢

本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院 NIAID 和 NIGMS 的支持，奖励编号为 R21AI156595 和 R01GM137068。该协议以前用于我们报告的结果（ Shu 和 Mi，2022 ）。

利益争夺

S. S 和 W. M 声明没有利益冲突。

参考

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