材料和试剂

1.蛋白质：PSD-95、IRSp53、Shank3、GKAP 和 Homer3 [参见Feng 等人。 (2022)蛋白质生产细节]
2.兔骨骼肌肌动蛋白（Cytoskeleton, Inc.，目录号：AKL99），来自兔骨骼肌的罗丹明肌动蛋白（Cytoskeleton, Inc.，目录号：AR05）
3.脂质成分：
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）（Avanti，目录号： 850457P）
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) [18:1 PI (4,5) P2]（Avanti，目录号： 850155P ）
1,2-二油酰-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](DGS-NTA)（Avanti，目录号： 790404P）
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000]（PEG5000PE）（Avanti，目录号： 880230P）
4.荧光团：
Alexa Fluor TM 647 NHS 酯（Thermo Fisher，目录号：A20006 ）
Cy3® NHS酯（AAT Bioquest ，目录号：271）
Alexa Fluor TM 488 C 5马来酰亚胺（Thermo Fisher，目录号：A10254 ）
DiO高氯酸盐（AAT Bioquest ，目录号：22066）
5.腔室盖玻片（Labtek® ，目录号：155409）
6.琥珀色玻璃瓶（Thermo Fisher，目录号：B7800-1-9A）
7.Hellmanex III (赫尔玛 Analytics TM ，目录号：Z805939）
8.气密注射器 [Agilent，目录号：5190-1471 (2 μL )、5190-1483 (10 μL )、5190-1493 (25 μL ) 和 5190-1507 (100 μL )]
9.氯仿（ Scharlab ，产品代码：10289473）
10.NaOH（ Scharlab ，目录号：SO04251000）
11.胆酸钠（Sigma，目录号：27029）
12.BSA（ Goldbio ，目录号：A-421-500）
13.ATP（Sigma，产品编号：A6144）
14.MgCl 2 （VWR Chemicals BDH® ，目录号：BDH9244）
15.NaH 2 PO 4 （Millipore，目录号：567545）
16.KH 2 PO 4 （Sigma，目录号：P0662）
17.NaCl（Santa Cruz Biotechnology® ，目录号：SC-203274）
18.KCl （VWR Chemicals BDH® ，目录号：26764）
19.Tris-HCl（ Goldbio ，目录号：T-400-5）
20.DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma，目录号：D0632）
21.CaCl 2 （Sigma，目录号：C4901）
22.HiTrap脱盐柱（ Cytiva ，目录号：89501-384）
23.PBS 缓冲液（参见配方）
24.反应缓冲液（参见配方）
25.G 缓冲区（参见食谱）

设备

1.水浴锅（Shel lab，型号：1201-2E）
2.烤箱培养箱（Binder GmbH，艺术编号：9010-0002）
3.高速离心机（Eppendorf，目录号：540600097）
4.AKTApurifier （GE Healthcare，美国）
5.蔡司 LSM 800 显微镜（蔡司）
6.纳米水滴

软件

1.斐济 (ImageJ)

程序

A.单层囊泡 (SUV)的制备

1.将单个脂质库存（溶解在氯仿中）加热至室温。
2.使用玻璃注射器（有关此处使用的注射器的详细信息，请参见材料和方法）制备具有以下成分的脂质混合物：95.9% POPC、2% DGS-NTA (Ni)、2% PI (4,5) P2 和 0.1% PEG5000PE。
在玻璃瓶中混合以下成分：
POPC（13.16 mM 库存） 7.1 μL
DGS-NTA (Ni)（4.74 mM 库存） 0.42 μL
PIP2（500 μM库存） 3.9 μL
PEG5000PE（170 μM库存） 0.57 μL
请注意，计算上述脂质量以覆盖单个盖玻片孔（即总共 75 μg ）。
3.在旋转的氮气流下干燥脂质混合物。脂质干燥后，您会看到多个白色层粘附在小瓶壁上（图 1）。注意 1% DiO 包含高氯酸盐染料以标记脂质，以便在图 1 中获得更好的可视化效果。

图 1. 图像显示干燥的脂质层粘附在玻璃瓶壁上。包含1% DiO染料以标记脂质，以便更好地展示。

4.继续在真空下干燥脂质至少 1 小时，以确保去除残留的氯仿。
5.在≤ 300 μL （再悬浮体积/柱注入体积由柱分辨率决定）的 PBS 缓冲液中用剧烈移液和涡流重新悬浮脂质混合物，辅以 1% v/v胆酸钠。一旦完全溶解在含有洗涤剂的缓冲液中，脂质应该是完全透明的。
6.将溶解的脂质混合物置于与无洗涤剂 PBS 缓冲液平衡的HiTrap脱盐柱中。使用 FPLC 系统和池分数，在 280 nm 处检测到紫外线吸光度，然后用 PBS 缓冲液稀释到所需的体积。添加 150 μL的脂质溶液以覆盖每个井玻璃以生成 SLB。

B.支持的脂质双层 (SLB) 的制备

1.Hellmanex III清洗室盖玻璃（井面积为 0.7 cm 2 ）过夜，并在第二天早上用 Milli-Q 水彻底冲洗。
2.°C下用 5 M NaOH 清洗盖玻片 1 小时，然后用 Milli-Q 水彻底冲洗。重复此洗涤步骤三次。
3.在每个清洁过的盖玻片中，添加 500 μL的 PBS 缓冲液以进行平衡、取出和丢弃。
4.加入 150 μL的 SUV，并在 42 °C下孵育 1 小时以生成 SLB。
5.μL的反应缓冲液清洗 SLB三次，以实现 216 倍稀释。需要注意的是，SLB 不应暴露在大气中以防止氧化。
6.在室温下的反应缓冲液中用 1 mg/mL BSA（库存浓度为 100 mg/mL）阻断 SLB 30 分钟。
7.将 2 μM 10% Alexa 647 或 Cy3 标记的、His8 标记的 PSD-95 蛋白添加到 SLB 中，并在室温下与 SLB 一起孵育 1 小时。
8.用反应缓冲液清洗未结合的 His-PSD-95 三次（每次清洗 750 μL ）。
9.使用蔡司 LSM 800 显微镜拍摄的图像（图 2Ai）。

C.PIP2 粘合剂的成像膜定位

1.将 1 μM 10% Alexa 488 标记的 IRSp53 蛋白添加到 SLB 中，并在室温下与 SLB 一起孵育 1 小时。
2.用反应缓冲液清洗 SLBs 三次（每次清洗 750 μL ）以去除任何未结合的 IRSp53 蛋白。
3.使用蔡司 LSM 800 显微镜拍摄的图像（图 2Aii）。

图 2. 支持的脂质双层 (SLB) 上的突触后密度 (PSD) 缩合和肌动蛋白聚合。 (A)荧光图像显示在添加其他 PSD 支架蛋白之前，SLB 上Cy3 标记、His8 标记的 PSD-95 ( i ) 或 Alexa 488 标记的 IRSp53 (ii) 的均匀涂层。 (B)代表性荧光图像显示从 SLB 上的 PSD 冷凝物组装的肌动蛋白丝。 IRSp53 (K4E) 的肌动蛋白结合缺陷突变体显示肌动蛋白与膜上 PSD 凝聚物的捆绑显着减少。呈现了沿虚线的罗丹明标记的肌动蛋白强度的线图。数字改编自 Feng 等人。 (2022) 经许可。

D.肌动蛋白重组和标记肌动蛋白制备

1.用 100 μL去离子水将冻干肌肉肌动蛋白重组为 10 mg/mL，然后在辅以 0.2 mM ATP 和 0.5 mM DTT 的 G 缓冲液中稀释至 0.4 mg/mL。
2.重组后，将肌动蛋白在冰上孵育 1 小时，以解聚在储存过程中形成的肌动蛋白低聚物。在 4 °C下以 14,000 × g进一步离心肌动蛋白悬浮液15 分钟。
3.将上清液转移到新的微量离心管中，并使用NanoDrop测定总蛋白浓度。
4.μL去离子水将冻干罗丹明肌肉肌动蛋白重组为 10 mg/mL ，然后用补充有 0.2 mM ATP 和 1 mM DTT 的 G 缓冲液稀释至 2 mg/mL。
5.将肌动蛋白溶液放在冰上 1 小时，以解聚肌动蛋白低聚物。
6.°C下以 14,000 × g离心罗丹明肌动蛋白重悬液15 分钟。
7.将前 90% 的上清液转移到新管中，并使用 NanoDrop 测定总蛋白浓度和罗丹明标记蛋白的百分比。

E.成像微簇形成和肌动蛋白聚合

1.预混 250 nM的 Shank3、GKAP、Homer3 和 IRSp53，以及 1 μM的 10% 罗丹明标记的肌动蛋白，辅以 1 mM ATP 和 2 mM MgCl 2 。每个腔室玻璃孔中的总溶液体积为 150 μL 。
2.将预混合物添加到标记为 Alexa 647 的 His8-PSD-95 结合的 SLB 中并孵育 20 分钟，以允许在膜上形成微团簇和肌动蛋白聚合。
3.使用 Zeiss LSM 800 显微镜拍摄的图像。混合后 20 分钟内发生肌动蛋白聚合，并在 1 小时后达到平台期。所有数据应在脂质涂层开始后 8 小时内收集。

数据分析

用 FIJI 分析肌动蛋白募集 (ImageJ)
1.使用 FIJI 打开捕获的图像。
2.要分析膜局部簇内的肌动蛋白富集，请在图像上画一条对角线，并通过 Plot Profile 测量荧光强度。请注意，必须使用相同的成像设置来直接比较不同的实验。

食谱

1.PBS缓冲液
10 毫米 NaH 2 PO 4 /1.8 毫米 KH 2 PO 4 , pH 7.4
137 毫米氯化钠
27 毫米氯化钾

2.反应缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 8.0
100 毫米氯化钠
2毫米数字地面电视

3.G缓冲区
5 毫米 Tris-HCl，pH 8.0
0.2 毫米氯化钙2
0.2 毫米 ATP

致谢

这项工作得到了中国科学技术部 (2019YFA0508402)、中国国家科学基金会 (82188101)、香港研究资助局 (RGC) (AoE-M09-12、16104518 和 16101419) 的资助， M. Zhang 的人类前沿科学计划研究资助 (RGP0020/2019)，以及 Z. Feng 的 RGC 普通研究基金 (GRF) 资助 (16102120)。该协议改编自Feng 等人。 (2022) 。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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