材料和试剂
1.玻璃培养基瓶 200 mL（Fisher Scientific，目录号：FB800250）。
2.培养皿 60 × 15 mm 500/ cs （Fisher Scientific，目录号：FB0875713A）
3.移液器吸头 2 – 200 µL Eppendorf ® epT.IPS 。（Eppendorf，目录号：022492039）
4.移液器吸头 50–1,000 µL Eppendorf ® epT.IPS 。（Eppendorf，目录号：022492055）
5.Eppendorf® Safe-Lock 1.5 mL微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204 ）
6.Corning® 15 mL 离心管（Corning，目录号：430791 ）
7.C. elegans菌株来自秀丽隐杆线虫遗传学中心：N2 Bristol（ WormBase ID：WBStrain00000001； dvIs15 ）、CL2122（WBStrain00005101）和 CL2355 [WBStrain00005106； smg-1 (cc546); pCL45 [Psnb-1::人淀粉样蛋白 β 1-42::3' UTR（长）； Pmtl-2::GFP]]
8.大肠杆菌菌株 OP50（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫遗传学中心，明尼苏达州）
9.芽孢杆菌菌株 NCIB3610（Bacillus Genetic Stock Center，目录号：3A1 和 1A96）
10.七水硫酸镁（ MgSO 4 · 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
11.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
12.磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P2222）
13.磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4 · 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：7782-85-6）
14.氯化钠（ NaCl ）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
15.NaClO次氯酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：13440）
16.氢氧化钠（ NaOH ）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
17.蛋白胨（BD， Bacto TM ，目录号：211677）
18.琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
19.胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
20.100% 乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
21.二水氯化钙（CaCl 2 · 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
22.Luria 肉汤 (LB)（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
23.辛醇（1-辛醇）（Sigma-Aldrich，目录号：472328）
24.双乙酰（DA）（丁烷-2,3-二酮）（Sigma-Aldrich，目录号：B85307）
25.M9 缓冲器（见配方）
26.线虫生长培养基 (NGM) 琼脂（见食谱）
27.磷酸钾缓冲液（见配方）
28.1 M MgSO 4 · 7H 2 O（见配方）
29.无水乙醇中的胆固醇（5 mg/mL）（参见食谱）
30.1 M CaCl 2 （见食谱）
31.磷酸钾缓冲液（1 M KPO 4 ，pH 6.0）（参见配方）
32.LB 媒体（见食谱）
33.漂白溶液（见食谱）
34.1 N NaOH （见食谱）
35.0.5% DA（见配方）
36.S-基础缓冲液（参见食谱）

设备
1.摇床（ Axyos Technologies，目录号：S04036.tu）
2.解剖显微镜（Carl Zeiss，目录号：3944010970）
3.市售画笔数：10/0； 0.2 × 0.2 × 6.5 英寸（Princeton art & Brush，目录号：B0043GCYSI）。
4.高压灭菌器（美国Tuttnauer ，型号：6690）
5.蠕虫选择。蠕虫镐可以购买（Genesee Scientific，目录号：59-AWP），也可以按照Wollenberg等人的描述在实验室制作。 (2013)。
6.离心机（Eppendorf，型号：5430）
7.台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
8.本生灯（ Humbolt ，目录号：H-5870）
9.计时器（ Hinotek ，目录号：PS-360A）

软件
1.Microsoft Excel（微软公司，雷德蒙德，美国）
2.GraphPad Prism 8（ GraphPad软件公司）

程序
A.C.线虫保养
1.将大肠杆菌OP50 菌落接种到200 mL 烧瓶中的50 mL Luria- Bertani (LB) 肉汤中，并在 37°C 下轻轻搅拌孵育过夜。
2.将大约 200 μL的大肠杆菌OP50 过夜培养物（1 × 10 8 CFU/mL）播种到 60 mm NGM 琼脂板上。使用前在 37°C 下孵育板过夜。
3.使用热灭菌的铂丝挑将 50–100 个混合阶段的幼虫蠕虫（N2、CL2122 和 CL2355 菌株）转移到新的大肠杆菌OP50 种子 NGM 琼脂板上。将蠕虫保持在 20°C。
4.每 2-3 天重复步骤 A3 进行维护。

B.C. elegans通过漂白同步

1.让蠕虫生长到成虫阶段。
2.通过用 M9 缓冲液清洗板（参见配方 1），在 15 mL 试管中回收妊娠成虫。
3.在室温下以 400 × g （在标准台式离心机上约 1,500 rpm）离心 2 分钟来沉淀蠕虫，并弃去上清液。
4.执行 1–3 次洗涤，直到缓冲液中没有细菌（没有浊度）。
5.将 5 mL 漂白溶液（参见配方 8）加入试管中，并在室温下剧烈摇晃最多 5 分钟。漂白时间超过 5 分钟会杀死卵。
6.通过在 15 mL 离心管中加入 10 mL 的 S-basal 缓冲液来稀释反应。
7.× g快速离心（因为处理可能仍然有效）1 分钟并弃去上清液。
8.用 S-basal 缓冲液填充管子，再清洗颗粒三次。使用解剖显微镜检查。
9.将鸡蛋放入未播种的 NGM 板中，并在 20°C 下孵育 18–24 小时。应提供适当的通风以获得 L1 阶段的所有动物。
10.用 1 mL 的 S-basal 缓冲液清洗每个 NGM 板，将 L1 种群转移到播种有相应细菌食物的 NGM 琼脂板上，并孵育直到它们达到年轻成人阶段（1 天大的 L4），大约 48 小时之后。大多数线虫菌株在用大肠杆菌OP50 或B. subtilis NCIB3610播种的 NGM 介质上保持在 20°C 。

C.行为分析

1.大肠杆菌OP50 或B. subtilis NCIB3610 细菌细胞上喂食线虫N2、CL2122 和 CL2355 菌株，从L1 幼虫期到 20°C 的成年期。
2.辛醇或 DA 作为驱虫剂或引诱剂进行排斥和吸引行为测定。
3.清洗大肠杆菌OP50 或B. subtilis NCIB3610 应变喂养的不同年龄的成虫三次，以去除任何残留的细菌，并将它们放置在没有食物的 NGM 板中。
4.对于驱虫剂测定，食物饥饿后 1 小时，将先前浸入 100%辛醇溶液中的画笔毛放在移动的动物面前。
5.辛醇的逃逸响应时间记为从暴露于驱虫剂到开始向后或逃逸运动的时间 (s)。
6.辛醇的反应时间，请使用在蠕虫开始回归时停止的计时器，向后移动（图 3 和 4）。
7.对于引诱剂测定，在食物饥饿后 1 小时，将先前浸入 0.5% DA 的画笔头发放在移动的动物前面 1.5 厘米的乙醇中。
注意：在吸引力测试中标记培养皿外 1.5 厘米的距离（用两个点或线，一个用于刷子所在的位置，另一个用于蠕虫所在的位置），以便测试可重现（图 2）。

2.C. elegans对驱虫辛醇或有吸引力的双乙酰(DA)的响应时间测定方案。在驱虫试验中，将蘸有辛醇的画笔放在蠕虫的头前并启动计时器。当蠕虫开始回归时停止它。对吸引力测定做同样的事情，但在这种情况下，将画笔浸入 DA 1.5 厘米处在蠕虫前面，并在蠕虫开始向 DA 方向向前移动时停止计时器。蠕虫的运动可以在以下链接中可视化： https://www.youtube.com/watch?v=klOJb0DDGGU&ab_channel=NeuroAIUWLaboratory。从视频中可以看出，ALM+AVM神经刺激能够产生回避行为；刺激干扰向前运动并启动向后运动。检查运动神经元的神经活动（DB 神经元是前 -> 后顺序）表明刺激引起神经活动行波的方向性变化，从前 -> 后到后 -> 前。这种转变的标志是前运动神经元的高度持续活动。

8.将 DA 响应时间记为从 DA 演示到 DA 方向开始向前移动的时间（s）（图 3 和 4）。

图 3. B. subtilis介导的C. elegans期间的认知改善老化。不同年龄（以天为单位，x 轴）的 OP50 和 NCIB3610 定殖的 N2 蠕虫（分别为红色和绿色柱）对驱虫剂（辛醇，左）和引诱剂 [双乙酰] 的平均响应时间（以秒为单位， y轴） (DA), 右] 博览会。结果代表一式两份进行的三个独立实验的平均值±标准差。给出了重复执行的三个独立实验之一的典型结果（平均值±SEM）。来自Cogliati等人。（2020）。

图 4.枯草芽孢杆菌改善了表达泛神经元 Aβ 聚集体的秀丽隐杆线虫的行为反应。 OP50 和 NCIB3610 定殖（分别为红色和绿色柱）CL2122（对照或 CL2122 wt ，左）和 CL2355 [CL2355 表达泛神经元 Aβ1-42 的阿尔茨海默病 (AD) 模型，右] 100% 辛醇（驱虫剂）和 CL2122（对照或 CL2122 wt ，左）和 CL2355（表达泛神经元 Aβ1-42 的 AD 模型，右）蠕虫至 0.5%双乙酰（DA，引诱剂）。给出了三个独立实验（一式两份进行）的典型结果（平均值±标准偏差）。星号表示统计显着性（*p < 0.1；***p < 0.001；ns，无显着差异，p > 0.5）。

数据分析与解释
所有测定至少一式两份进行三次。在驱虫试验中，将蘸有辛醇的画笔放在蠕虫的头前并启动计时器。当蠕虫开始回归时停止它。这表示以秒为单位的驱虫响应时间。对吸引力测定做同样的事情，但在这种情况下，将画笔浸入 DA 1.5 厘米处，并在蠕虫开始向 DA 方向向前移动时停止计时器。这表示以秒为单位的吸引力响应时间。计算吸引响应时间和驱避响应时间，并在 Microsoft Excel 中绘制数据。使用GraphPad Prism 8 对数据进行统计分析。结合来自三个独立实验的数据并计算平均值和标准偏差。应用具有显着性截止水平 P < 0.05 的学生 t 检验来比较两组之间的吸引力和排斥时间。

食谱

1.M9缓冲器
3 克 KH 2 PO 4
6 克 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O
5克氯化钠
加水至 1 L。高压灭菌，然后加入 1 mL 的 1 M MgSO 4 。

2.用于 1 L 培养基的线虫生长培养基 (NGM) 琼脂
3.0 克氯化钠
20克琼脂
2.5 克细菌蛋白胨
加水至 972 mL。高压灭菌琼脂，冷却至 55°C，然后添加：
1 mL 1 M MgSO 4 · 7H 2 O（参见配方 3）
1 mL 的 1 M CaCl 2 （参见配方 5）
1 mL 5 mg/mL 胆固醇的无水乙醇溶液（参见配方 4）
25 mL 1 M 磷酸钾缓冲液 pH 6.0（参见配方 6）

3.1 M MgSO 4 · 7H 2 O
溶解 6 克 MgSO 4 50 mL dH 2 O中的七水合物
高压灭菌器（121 °C 20 分钟）
在室温下储存。

4.无水乙醇中的胆固醇 (5 mg/mL)
将 0.25 克胆固醇溶解在 50 mL 的 100% 乙醇中
不要高压灭菌。

5.1 M 氯化钙2
溶解 5.55 g CaCl 2 50 mL dH 2 O中的二水合物
高压灭菌器（121 °C 20 分钟）
在室温下储存。

6.磷酸钾缓冲液（1 M KPO 4 ，pH 6.0）
108.3 克 KH 2 PO 4
35.6 克 K 2 HPO 4
水高达 1 升
高压灭菌器（121 °C 20 分钟）
在室温下储存。

7.LB媒体
将 20 g LB 肉汤溶解在 1 L ddH 2 O中
高压灭菌器（121 °C ，20 分钟）。

8.漂白液
1 mL 的 3% NaClO次氯酸盐
2.5 mL 1 N NaOH （参见配方 9）
0.5 mL 的 dH 2 O

9.1N氢氧化钠
将 2 g NaOH溶解在 50 mL dH 2 O中

10.0.5% 多糖
双乙酰溶解在 100% 乙醇中。双乙酰应在任何实验前立即用乙醇稀释制备。

11.S-基底缓冲液
5.85 克氯化钠
1 克 K 2 HPO 4
6 克 KH 2 PO 4
H 2 O 至 1 L。高压灭菌（121 °C ，20 分钟）。加入 1 mL 胆固醇（乙醇中 5 mg/mL）。

笔记

1.将画笔放在线虫前面时，注意不要接触线虫或琼脂板表面。
2.在驱虫试验中，使用无菌水代替辛醇作为对照，试验在 20 秒时停止以说明自发逆转。
3.仅对倒转进行评分，这是通过观察尾巴的向后运动来确定的。中断向前运动或仅用头后退不计分。
4.在引诱剂测定中，使用乙醇代替 DA 作为对照。

致谢

这项工作得到了 CONICET ( Consejo 国家调查局 Científicas y Técnicas ) 和FONCyT ( Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica ）在皮尤拉丁美洲生物科学项目（美国费城）、富布赖特委员会（美国华盛顿特区）和前基金会的帮助下 Antorchas （阿根廷布宜诺斯艾利斯）。我们修改了Stiernagle (2006)的培养基和 NGM 板制备。我们从 Montserrat Porta -de-la-Riva 等人修改了C. elegans同步。 (2012)。该协议基于“多巴胺对秀丽线虫回避行为的调节线虫需要 NMDA 受体 NMR-1”（ Baidya等人，2014 年）。
利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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