材料和试剂

1. 60 × 15 mm Nunc TM细胞培养/培养皿（Thermo Fisher，目录号：150288）
2. 150 × 21 mm Nunc TM细胞培养/培养皿（Thermo Fisher，目录号：168381）
3. 15 mL Falcon 管（Thermo Fisher，目录号：12565268）
4. #1.5 厚度 12 mm 盖玻片（ Neuvitro ，目录号：NC0319857）
注：3 ×丙酮、3 ×乙醇洗涤，无菌水漂洗3 × ；储存在无菌水中。
5. 细胞培养板，尺寸 24 孔，无菌，平底，组织培养处理（Sigma，目录号：SIAL0524）
6. 注射器过滤器Millex -GP，33 mm，PES，0.22 µm，伽马灭菌，亲水性，FDA，CE，50 pc/PAK（Millipore，目录号： MPSLGPM33RS）
7. Eppendor f® Safe-Lock 微量离心管，1.5 mL（Sigma ，目录号： T9661 ）
8. 45 个单位的木瓜蛋白酶（沃辛顿，目录号：PAPL LS003119）
9. 汉克斯平衡盐溶液 (HBSS)、钙、镁（Gibco，目录号：24020-117），储存于 4 °C
10. Lipofectamine TM 2000 转染试剂（Invitrogen，目录号：11668030），储存于 4 °C
11. Brefeldin A 溶液 (1,000 × ) （ BioLegend ，目录号： 420601），5 mg/mL，储存于 4 °C
12. 银环蛇毒素 (BTX)、Alexa Fluor® 647 (AF647) 结合物（Thermo Fisher ，目录号： B35450）
以 1 mg/mL 的浓度重悬于 H 2 O
添加叠氮化钠（Sigma，目录号：199931）
将小等份储存在 -20 °C。避免冷冻和解冻。避光
13. 筒箭毒碱五水合物（Sigma ，目录号： T2379-100MG）
重悬于 H 2 O
将等分试样储存在 4 °C
14. 水合物_ （西格玛，目录号：D7693-5MG）
在 DMSO 中重新悬浮以制成 80 mM 库存溶液，储存在 -20 °C。
15. LysoTracker TM Green DND-26 （Invitrogen，目录号：L7526），1 mM，储存于 -20 °C
16. Magic Red Cathepsin-B Assay kit （ ImmunoChemistry Technologies，目录号：937），在 4°C 下储存
将 200 µL DMSO 重新悬浮到小瓶中，制成 250 ×库存，储存在 4 °C。
无菌 H 2 O 以 1:10稀释 250 × DMSO 原液，制成 25 ×子原液。立即使用。
17. 来自大鼠血浆的凝血酶（Sigma，目录号：T5772-100UN），冻干粉
在 1 mL 中重悬，制成 100 U/ml (20 × ) 的储备液，储存在 -20 °C。
18. 二甲基亚砜 (DMSO) （Sigma，目录号：D4540），≥99.5%（GC），适用于细胞培养
19. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2 （Gibco，目录号：20012027），适用于细胞培养
20. 水，细胞培养级（Corning，目录号：15363651）
21. 硼酸盐缓冲液(5 mL)（参见配方）
硼酸（Fisher，目录号：A73-500）
硼砂（Sigma，目录号：B-9876）
22. 1 mL 0.05% DNaseI （参见配方）
DNaseI （Boehringer，目录号：10104159001，100 mg 来自牛胰腺，II 级）
MgSO 4 （Fisher，目录号：BP213-1）
HBSS（Gibco，目录号：24020-117）（不含 Pen-Strep）
23. 聚-L-赖氨酸原液（见配方）
5 毫克瓶装聚-L-赖氨酸氢溴酸盐，分子量 = 300,000，冻干粉，经伽马辐照， BioXtra ，适用于细胞培养（Sigma，目录号：P5899-5MG）
24. 解剖媒体（见食谱）
HBSS（ Gibco ，目录号：24020117）
D-葡萄糖（Sigma，目录号：G6152-100g 或 G5767-500g）
HEPES（Sigma，目录号：H4034-100g 或 H-7523-50g）
Pen-Strep（ Gibco ，目录号：15140148，20 mL）
25. 脑消化酶（混合物 A）（见食谱）
PBS（ Gibco ，目录号：21600069，或 DPBS，目录号：14190-144）
DL-半胱氨酸盐酸盐（Sigma，目录号：C9768）
BSA（Sigma，目录号：A7906-100G）
D-葡萄糖（Sigma，目录号：G6152）
26. 电镀介质（见配方）
含酚红的DMEM 高葡萄糖 (1 × ) + L-Glut w/o Sod。焦油。（Gibco，目录号：11965092）
FBS（Gibco，目录号：26050-070）
27. 生长培养基（见食谱）
含有酚红的 Neurobasal A（NBA）培养基（Gibco，目录号：10888022）
B-27补充剂（50 × ）（Gibco，目录号：17504044）
GlutaMAX-I 100 × （Gibco，目录号：35050061）

设备

1. 手术剪刀（锋利的/钝的）4-6”（Fine Science Tools，目录号：14028-10）
2. Dumont 镊子 Super Fine #7（Fine Science Tools，目录号：11271-30）
3. 对于大脑解剖：配备双顶部和底部照明的立体显微镜，以及 6倍和 12倍放大目镜/物镜。
4. 5 mL Nunc TM血清移液器（ Thermo Scientific ，目录号： 170355N）
5. 10 mL Nunc TM血清移液器（ Thermo Scientific ，目录号： 170356N）
6. 25 mL Nunc TM血清移液器（ Thermo Scientific ，目录号： 170357N）
7. Nikon Ti-E Perfect Focus 倒置荧光显微镜，配备全内反射荧光 (TIRF) 装置，配备 100 × /1.49NA 物镜和Andor iXon + DU897 EM 相机
8. 用于显微镜实时成像的CO 2培养箱
9. 35 毫米培养皿 | 1.5号盖玻片| 14 毫米玻璃直径 |无涂层（ MatTek ，目录号： P35G-1.5-14-C）
10. 二级生物安全柜
11. SciSpin MINI 微量离心机 BLUE，带 8 × 1.5/2.2 mL 转子，(7,000 rpm/2,680 × g )（ SciQuip ，目录号： SS-6050 和 SS-6058）

软件

1. ImageJ (Fiji) 软件（从https://imagej.net/software/fiji/免费下载）
2. 微软Excel

程序

A. 海马神经元电镀制备

注意：步骤 1 - 5 应在无菌条件下在组织培养室和 II 级生物安全罩中进行，配备真空瓶系统和吸气罩。
1. 将聚-L-赖氨酸库存溶液稀释到 50 µg/ mL 的工作溶液。添加适量的工作溶液以覆盖放置在 24 孔板（~500 µL/孔）或 35 mm MatTek玻璃底盘（~1 mL/孔）孔内的玻璃盖玻片，并在 37 °C 下孵育至少 2 小时或过夜，根据我们的经验，这个范围覆盖了盖玻片表面，以便正确粘附海马神经元。
2. 在无菌细胞培养级水中清洗盖玻片三次。
3. 用 500 µL 电镀介质 (DMEM + 10% FBS)（最终体积的一半）填充包含单个盖玻片的 24 孔板的每个孔，并在 37 °C 和 5.0% CO 2 下孵育直至电镀（见注释 #4下面）。
4. 解冻混合物 A 和 DNase I。在 15 mL Falcon 管中混合 5 mL 混合物 A + 45 单位木瓜蛋白酶粉末，并在 37°C 水浴中孵育 15 分钟，直到木瓜蛋白酶完全溶解。然后，加入 1 mL 的 0.05% DNase I，通过 0.22 μm 过滤器对混合物进行过滤灭菌，并将溶液在室温下保存在 15 mL Falcon 管中长达 2 小时。
5. 在 150 毫米培养皿中，在 37 °C 和 5.0% CO 2下预热 ~25 mL 电镀介质（DMEM + 10% FBS）。

B. 小鼠海马神经元分离和电镀 [改编自Kaech 和 Banker (2006) ]

注意：步骤 1 – 8 可以在标准实验室工作台上完成。步骤 9 – 16 应在配备真空瓶系统和吸气罩的 II 级生物安全罩中完成。步骤 4 - 8 应快速完成，最好在 30 分钟内完成，以避免组织恶化。
1. 在 P0（第 0 天）和 P2（第 2 天）收集小鼠新生儿。让幼崽接触一袋温水或预热的加热垫。
2. 用水和肥皂清洁解剖工具，然后用 70% 乙醇清洗。
3. 盘 A 和 B：将 ~ 8 mL 的解剖介质放入两个 60 mm 盘中，并放入冰桶内的 15 mL Falcon 管中（图 1）。
4. 用手术剪刀将幼崽斩首到 A 盘中，其中包含解剖介质。轻轻摇动以清除血液（图 1A）。
5. 使用两个 Dumont 镊子剥去皮肤和头骨。将大脑隔离到 B 盘中（图 1B）。
6. 用 Dumont 镊子沿着中线分割大脑。取出后侧的小脑并丢弃。将半球的内侧朝上放置。插入 Dumont 镊子 ~45° 并翻转，取出中脑（腹侧部分）。剥离脑膜（覆盖皮层的膜）和血管（图1C）。
7. 确保海马体（海马/香蕉形）可见且完好无损。要隔离海马体，通过刺穿大脑底部并使用 Dumont 镊子沿海马体的顶部边缘切割来稳定半球（图 1C）。

图 1.从小鼠 P0到P2 新生儿海马体的分离，用于原代海马体培养。 (A)斩首； (B)去除大脑； (C)收获海马体（底部图中的虚线勾勒出轮廓）。数字 4–7 对应于程序 B中的步骤。（改编自https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/neurobiology/neurobiology-protocols/isolation-of-mouse-primary-neurons.html ）。

8. 使用 10 mL 血清移液器，将两个海马体轻轻转移到含有解剖介质的 15 mL Falcon 管中。如果需要，重复这些步骤以收获更多的海马体。
注意：在生物安全罩内工作用于协议的其余部分。
9. 吸出解剖介质，在约 8 mL 的冷 HBSS（不含抗生素）中清洗海马体两次。
注意：小心不要吸出海马体。
10. 吸出 HBSS。每两个海马体添加 ~ 1 mL 脑消化酶（5 mL 混合物 A + 45 单位木瓜蛋白酶 + 1 mL 0.05% DNaseI ）。在 37°C 下孵育 15 分钟。每 2-5 分钟用手轻轻翻转试管几次，以便在此步骤中外层的死细胞分离。
注意：对于电镀神经元的生存能力来说，温度为 37 °C 而不是更高是至关重要的。
11. 缓慢而轻柔地吸出脑消化酶。用 ~6 mL 的电镀介质（DMEM + 10% FBS）清洗两次，在 37 °C下预热。
12. 吸出电镀介质，每两个海马体加回 ~ 1.2 mL 的电镀介质。使用 P1000 微量移液器上下移液 7-10 次以分离海马体（避免产生气泡）。让碎片下沉 3-5 分钟。
13. 移液器将含有分离细胞的上清液顶部的 1 mL 移入新的 15 mL Falcon 管中，并添加 5 mL 的电镀介质，总体积为 6 mL 。
14. 24 孔板中的电镀细胞：将约 500 μL 的细胞移入含有 500 μL 预热电镀介质的 24 孔板的每个孔中。仔细混合每个孔。本协议中用于实验的细胞密度是 24 孔板的 12 孔中的两个海马体，相当于每孔约 70,000–125,000 个细胞。
15. 2下孵育细胞（见注释 #4下面），持续 1-5 小时，使细胞附着在盖玻片上。
16. 使用 P1000 微量移液器一次轻轻吸出电镀介质，并立即用每孔 1 mL 的生长介质（NBA + B-27 + GlutaMAX ）替换。该培养基应在 37 °C和 5.0% CO 2的培养箱中预热（见注释 #4下面）。在 37 °C 和 5.0% CO 2下孵育细胞（参见注释 #4下面）。
注意：在更换培养基时不要让盖玻片变干。
17. 每天在显微镜下检查平板的神经元密度、生长和健康状况。在体外天数 (DIV) 2 中，健康神经元中应该可以看到带有生长锥的神经突（图 2A ）。在 DIV 4-5，轴突（橙色箭头）和树突（绿色箭头）可通过形态学识别（图 2B ）。从这个阶段开始，神经元就可以进行转染和成像了。到 DIV 9–10 时，轴突和树突继续生长并广泛地成束（图 2C ）。如果不转染轴突荧光蛋白，研究人员可能会发现很难辨别单个轴突。

图 2.培养的原代海马神经元在(A) 天体外 (DIV) 2、(B) DIV 4、(C) DIV 9 时的生长。神经元以 1:12 稀释度接种，即两个海马体接种于 12 24 孔板中的孔，产生 75,000–125,000 个细胞/盖玻片。图像是使用 Nikon Plan Fluor 40 × /1.3NA 油物镜使用微分干涉相差 (DIC) 光学器件拍摄的。星号 = 体细胞；箭头指向轴突（橙色箭头）或树突（绿色箭头）。比例尺 = 10微米。

C. 转染培养的小鼠海马神经元

注意：此协议是根据建议使用 Lipofectamine 2000（ Invitrogen TM ； https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-culture/transfection-protocol/lipofectamine-2000 .html ）。该协议用于在 DIV 5 – 8 的 24 孔神经元板中转染一个盖玻片；根据所需的盖玻片数量进行相应调整。这些步骤应在组织培养室的无菌生物安全罩下完成。
1. 准备两个 1.5 mL Eppendorf 管。
a. 在管 1 中，添加 50 μL （体积调整）的生长培养基 + 400–800 ng 将被转染的无内毒素纯化质粒。对于PrP-mCherry ( mCh ) 质粒，我们添加了 800 ng。通过轻弹 Eppendorf 管的尖端混合并孵育 5 分钟。
b. 在管 2 中，添加 48 μL的生长培养基 + 2 μL的 Lipofectamine 2000。通过轻弹 Eppendorf 管的尖端混合并孵育 5 分钟。
2. 在 MINI 微量离心机中快速旋转管 1 和管 2（约 5 秒）。
3. 孵育 5 分钟后，通过逐滴移液将稀释的 DNA（管 1）与稀释的 Lipofectamine 2000（管 2）结合起来。通过轻弹 Eppendorf 管的尖端进行混合，并将混合物在室温下孵育 30 分钟。
4. 500 μL培养基从 24 孔板的每个孔中转移到 24 孔板的空孔中，其中神经元已接种 5-8 天（DIV 5-8），并添加500 μL的新生长培养基向这些孔中加总 1mL。这将是在转染后添加回每个神经元孔的介质，以允许转染前每个孔中分泌的神经营养因子的转移。
5. 将 100 μL的质粒-Lipofectamine 2000 混合物添加到电镀神经元的 24 孔板的每个孔中。在 37°C 和 5.0% CO 2下孵育2 小时（参见下面的注释 #4 ）。
6. 2 小时后，用步骤 4 中准备的生长培养基替换每个含有神经元的孔中的所有培养基。质粒转染的蛋白质表达取决于质粒、表达的蛋白质和转染的浓度，但最早可能发生在 45转染后 min 至 1 h。
笔记：
a. 在 Lipofectamine 2000 中孵育超过 3 – 4 小时会导致毒性。
b. 该协议通常产生 1% – 5% 的转染效率，这对于观察单个神经元和单个轴突中的荧光蛋白表达很有用。

D. 布雷菲德菌素 A (BFA) 治疗

注意：D - K 部分将演示 PrP PG14 -mCh 表达神经元的实验程序。相同的程序适用于PrP WT -mCh （对照）或任何其他感兴趣的膜蛋白。
1. 在 ER 中保留 PrP PG14 -mCh
a. 按照程序 C准备转染混合物（Lipofectamine 2000 + 质粒）。在 100 μL混合物中，加入 0.5 μL 1,000 × BFA溶液（1:200 稀释）。
b. 将含有 BFA 的转染混合物应用于神经元。每孔 BFA 的最终浓度为 5 μg /mL (1×)。
c. °C和 5.0% CO 2下孵育 1 小时（参见注释#4 下面）并用 5 μg /mL BFA替换介质再 1-5 小时（图 3A ）。
注意：孵育时间越长，蛋白质表达越高，但从 ER 泄漏到其他隔间的更多。
d. 使用实时成像对体细胞和轴突中的PrP PG14 -mCh 表达模式进行成像。在实时成像过程中使用与 BFA 相同的媒体。
注意：神经元可以用细胞器特异性抗体进行免疫染色，以确认蛋白质在给定时间在细胞区室中的定位（参见Chassefeyre等人，2021 年的示例）。
2. 从 ER释放 PrP PG14 -mCh
a. 重复程序 D中的步骤 1a–1c 。
b. 在 5 μg /mL BFA 处理 2-6 小时后，用在 37 °C和 5.0% CO 2下预热的新生长培养基更换培养基（参见下面的注释 #4 ；图 3B ）。
c. 每 10–30 分钟在体细胞和轴突中转染后一两天对PrP PG14 -mCh 表达模式进行成像。 PrP PG14 -mCh的信号应该表现为沿着轴突长度的大而圆的点状聚集体，并且在体细胞中表现为大的点状聚集体。确认 PrP PG14 -mCh 如前所述转运到体细胞中的溶酶体中（ Chassefeyre 等人，2021 年），按照程序 H中的步骤操作。
注意：神经元可以用细胞器特异性抗体进行免疫染色，以确认蛋白质在给定时间在细胞区室中的定位（参见Chassefeyre等人，2021 年的示例）。

图 3. Brefeldin A (BFA) 治疗海马神经元的时间表。 (A) 将 PrP PG14 -mCh 放在 ER 中。 (B)从 ER 中释放 PrP PG14 -mCh。

E. 成像 BTX-AF647 标记的表面PrP及其随后的内化（图 4）

1. 将金环蛇毒素结合序列 (BBS) 克隆到PrP中已在Chessefeyre中进行了全面描述等。 (2021)。简而言之，在mCh和PrP序列下游mCh下游的 C 端之间的接头中的BspEI位点插入了一个 13 个氨基酸的 BBS 标签 (WRYYESLEPYPD) ，这表明不会改变PrP运输或内吞物形成。 MoPrP.Xho载体中 PrP PG14 -mCh-BBS的无内毒素纯化推荐用于原代神经元的转染。
2. 程序 C中概述的 Lipofectamine 2000 协议，用PrP WT - mCh -BBS 或 PrP PG14 -mCh-BBS转染 DIV 5-8 的神经元。
3. 转染后两天，用在生长培养基中稀释的 150 μM筒箭毒碱氯化物处理神经元，并在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育 2 小时（参见下面的注释 #4 ；图 4B）。
与神经元表面的乙酰胆碱 ( ACh ) 受体结合。筒箭毒碱阻断ACh受体，从而减少 BTX-AF647 结合和背景荧光信号。
4. 将含有筒箭毒碱的生长培养基替换为含有7 μg /mL BTX-AF647 的生长培养基，并在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育神经元 1 小时（参见下面的注释 #4 ）。
5. 用生长培养基清洗并立即或一天后对实时 BTX-AF647 信号进行成像。

图 4. (A) BTX-AF647 处理海马培养神经元的示意图和 (B) 时间线。转染一天后PrP PG14 -mCh-BBS 内吞进入内吞囊泡和/或 PrP PG14 -mCh-BBS 在内吞小体中积累的实时成像示意图。

F. Dynasore处理抑制网格蛋白介导的神经元细胞表面 PrP PG14 -mCh 内吞作用

1. 按照程序 E步骤 1 和 2 使用PrP PG14 -mCh-BBS转染 DIV 5–8 神经元。转染后一两天，添加 0.5 μL的 80 nM Dynasore DMSO 库存至 500 μL生长培养基，混合均匀，并应用于神经元。在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育 30 分钟（参见下面的注释 #4 ）（图 5A）。
2. 将介质替换为生长介质 + 150 μM筒箭毒碱 + 80 μM Dynasore并在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育 1 小时（参见下面的注释 #4 ）（图 5B）。
3. 用生长培养基替换培养基 + 7 μg /mL BTX-AF647 + 80 μM Dynasore并在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育 1 小时（参见下面的注释 #4 ）（图 5B）。
4. 立即用生长培养基和图像神经元替换培养基，然后在一天后的所需时间点，对PrP WT /PG14 -mCh-BBS 内化和/或内吞体中的聚集以及这些事件中网格蛋白介导的内吞作用的要求进行成像（图 5B）。

图 5. (A) BTX-AF647 用Dynasore处理培养的海马神经元的示意图和 (B) 时间线。在 PrP PG14 -mCh- BBS 表达后一天内监测网格蛋白介导的内吞作用对PrP PG14 -mCh-BBS 内化和/或内吞物形成的抑制。

G. 在细胞表面切割PrP

1. Chassefeyre等人描述了凝血酶切割序列 (TCS) 标记的构建体MoPrP.Xho PrP PG14 -mCh-TCS的克隆。 (2021)。简而言之，将 TCS 标签 (LVPRGS) 插入到mCh下游的BspEI位点，并显示不会改变PrP运输或 PrP PG14 -mCh内吞物形成。 MoPrP.Xho载体中PrP PG14 -mCh-BBS的无内毒素纯化被推荐用于原代神经元的转染（图 6A）。
2. 程序 C中概述的 Lipofectamine 2000 协议，使用 PrP PG14 -mCh-BBS在 DIV 5 – 8 转染神经元（图 6B）。
3. 在生长培养基 + Lipofectamine 2000 转染混合物中在 37 °C 、5.0% CO 2中孵育 2 小时后（参见下面的注释 #4 ），将培养基替换为生长培养基 + 5 单位/mL 的凝血酶蛋白酶。在 PrP PG14 -mCh 内吞物形成的实时成像前最多 2 天在 37 °C 、5.0% CO 2 （参见下面的注释 #4 ）下孵育神经元（图 6B）。

图 6. (A) 示意图和 (B) 凝血酶治疗时间线培养的海马神经元。
PG14 -mCh 在 TCS 位点的裂解及其从细胞表面的释放。

H. LysoTracker TM检测酸性内溶酶体

1. 程序 C （图 7A）中所述，使用 PrP PG14 -mCh培养和转染神经元。
2. 制备 50 nM的LysoTracker TM Green（或其他所需的具有不同荧光染料的LysoTracker ）。在 37 °C 和5.0% CO 2条件下，在LysoTracker中孵育 DIV 5–8 神经元2 小时（参见下面的注释 #4 ）。在活体成像之前，在生长培养基中清洗 2–3 次并在 37 °C 和5.0% CO 2中孵育 30 分钟（参见下面的注释 #4 ）。不要等待超过 30 分钟，因为LysoTracker TM信号可能会随着时间的推移而变暗（图 7B）。
3. 使用配备 488 nm 激光的显微镜获得的实时图像LysoTracker TM Green 信号（图 7B）。
笔记：
a. LysoTracker TM Green：最佳激发波长约为 504 nm，最佳发射波长约为 511 nm。
b. LysoTracker TM荧光信号可能较弱（Chassefeyre 等人，2021 年）。图像LysoTracker TM按照供应商的建议处理神经元，在我们的协议中，这是在使用LysoTracker TM处理细胞后 30 分钟到 1 小时内。这将避免在较长时间的LysoTracker TM处理后可能发生的光漂白。使用降低的激光功率成像有助于避免图像采集过程中的光漂白，以及使用其他显微镜（例如晶格光片显微镜）成像。理想情况下，该检测应与其他溶酶体蛋白标记物（如 LAMP1）或 Magic Red ® （参见程序第 I 部分）结合使用。

I. Magic Red ®组织蛋白酶 B 检测可检测降解溶酶体中组织蛋白酶 B 的活性（图 7）

1. 程序 C中所述，用 PrP PG14 -mCh培养和转染神经元。
2. 在无菌 H 2 O中稀释Magic Red ®的250 × DMSO 原液。将 10 μL加入 24 孔板的每个孔中，其中铺有 5 – 8 个神经元，包含 250 μL生长培养基。在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育 2 小时（参见下面的注释 #4 ）（图 7B ）。
3. 用生长培养基清洗含有 Magic Red ® 的孔2 – 3 次。在实时成像（图 7B ）之前，在 37 °C 和5.0% CO 2下孵育 30 分钟（参见下面的注释 #4 ）。
4. 使用配备 561 nm 激光的荧光显微镜获得的实时图像 Magic Red ®信号（图 7B ）。
笔记：
a. Magic Red ®的激发波长为 592 nm，最佳发射波长为 628 nm。
b. LysoTracker TM Green 和DeepRed Magic Red ®可以在同一个实验中结合使用，以交叉验证在体细胞和轴突中存在降解性和酸性内溶酶体细胞器的观察结果。

图 7. (A) LysoTracker TM或 Magic Red ®组织蛋白酶 B 检测的示意图和 (B) 时间线。在降解内溶酶体中探测 PrP PG14 -mTagBFP2 。

J. 图像采集和轴突识别

1. 预热显微镜上的孵化室，直到温度达到稳定的 37°C。提前准备 CO 2室。
2. MatTek培养皿上对 24 孔板中 #1.5 玻璃盖玻片上生长的原代神经元进行实时成像。将约 500 μL新生长培养基和约 500 μL旧生长培养基的混合物从培养孔中添加到每个 35 mm MatTek培养皿中，并将培养皿保持在 37 °C 和5.0% CO 2之前（参见下面的注释 #4 ）将盖玻片放在里面（第 3 步）。
3. 使用带有倾斜细尖的 Dumont 镊子，从边缘拿起盖玻片。注意不要掉落盖玻片，将其翻转到玻璃底部区域内的MatTek培养皿底部，使细胞面朝下。
4. °C和 5.0% CO 2环境中将MatTek培养皿安装在显微镜载物台上。在成像前让细胞在该环境中稳定 10-15 分钟。
5. 使用具有高 NA 的 60 ×或 100 ×物镜，定位使用宽场或荧光照明的转染细胞。根据神经元形态区分树突与轴突(Encalada 等人，2011）。找到孤立的轴突区域并获取图像。
注意：除非另有说明，否则成像的轴突区域属于轴突中部区域，定义为距离体细胞和轴突末端至少约 200 μm的位置。

数据分析

A. 使用 ImageJ 定量PrP PG14 -mCh轴突内吞密度

1. 从获取的每个原始图像中减去背景荧光：在 ImageJ 中转到处理 - 减去背景，使用“预览”调整滚球半径（尝试滚球半径默认 = 50）。
2. 使用分段线工具绘制 ROI 作为轴突顶部的轮廓（图 8 ）。调整线宽以覆盖轴突宽度，这将取决于正在分析的轴突的宽度（下面的示例，线宽 = 1）。

PG14 -mCh的神经元轴突图像中减去背景荧光。屏幕截图显示 ImageJ 中的窗口，其中包含在背景减法后表达 PrP PG14 -mCh的培养的海马小鼠神经元轴突的代表性图像（左），以及同一轴突图像的窗口，其中绘制了分段线 ROI 以勾勒出轴突（右） ). 使用亮度和对比度 (B&C) 工具帮助可视化轴突轮廓。

要识别 PrP PG14 -mCh内吞物：
3. 在 ImageJ 中，转到分析 - 绘图配置文件。在手动检查数百张图像后（Chassefeyre 等人，2021 年），我们将轴突内的内吞物定义为 PrP PG14 -mCh 荧光斑点，其强度至少是小 PrP PG14 -mCh 囊泡强度的五倍（图 9 ；参见注释 #5 ）。

图 9.图 8 中轴突中PrP PG14 -mCh 荧光斑点的曲线图。图 8 中轴突荧光强度的曲线图，是从 ImageJ 中的分段线 ROI 特征的绘图中获得的。 y 轴表示沿轴突的PrP PG14 -mCh 点源以任意单位 (AU) 表示的荧光强度（灰度值）。在对荧光强度平均值进行目视检查后，将阈值设置为 AUs = 500，以指定代表来自 PrP PG14 -mCh 囊泡的信号的最小峰。然后将阈值设置为 500 个 AU 的囊泡强度的五倍，以将其指定为 PrP PG14 -mCh内吞物。然后通过手动计算峰值来计算PrP PG14 -mCh内吞体的密度。 Chassefeyre中进一步详细描述了阈值的定义等。 (2021) 。
4. 计算每个轴突图像的PrP PG14 -mCh内吞密度，作为每个轴突长度高于阈值强度（图 9 ）的峰数。分析的轴突片段的长度等于分段线的长度（参见步骤 2）。将数字除以长度× 100 以获得聚集体密度/100 μm 。每个神经元仅分析一个轴突区域；这将是N 个轴突。
5. 统计分析：如果数据集呈正态分布，则显示平均值±SEM 并酌情执行学生t检验或方差分析/多重比较检验。如果数据集不是正态分布的，则显示箱线图、小提琴图或所有数据点并使用非参数检验，例如 Wilcoxon 秩和检验或适当的多重比较检验。

B. 使用 ImageJ 对轴突进行共转运分析

该协议用于分析非PrP货物（在本例中为 Lamp1-EGFP内溶酶体）和 PrP PG14 -mCh 囊泡或内分泌体的共同转运（或不）沿着培养小鼠海马神经元的轴突移动（或不移动）。
1. 程序 C中的步骤，用所需质粒共转染神经元。在这种情况下，神经元与 PrP PG14 -mCh (400 ng) 和 Lamp1-EGFP (400 ng)共转染。收集 PrP PG14 -mCh 和 Lamp1-EGFP 通道的图像，如程序 J中所示。
2. 使用拆分通道在 ImageJ 中打开图像。如上面的步骤 A 所示，从每个原始图像中减去背景荧光（图 8，左）。
3. 如上面的步骤 A 所示，使用分段线工具将 ROI 绘制到第一个通道的轴突上（图 8，右）。调整线宽以覆盖轴突宽度，这将取决于正在分析的轴突的宽度（下面的示例，线宽 = 1）。
4. 在 ImageJ 中，转到 Image – Stacks – Reslice [/]…此步骤将绘制一个 kymograph，显示 Lamp-1-EGFP 粒子（x 轴）随时间（y 轴）的轨迹（图 10 ）。

图 10. Lamp1-EGFP 囊泡在培养的海马神经元轴突中的转运。 ImageJ 的屏幕截图显示了轴突的 kymograph 的代表性图像，显示了 Lamp1-EGFP 移动或静止囊泡的轨迹。电影长 5 分钟，使用尼康 TIRF 显微镜以 1 帧/秒（1 赫兹）的帧速率收集。对于获取的所有图像和电影，曝光时间设置为 100毫秒 (查瑟菲尔等人，2021）。

5. 使用命令-E 或使用 ImageJ 中的 ROI 管理器将从 Lamp1-EGFP 图像绘制的 ROI 转移到 PrP PG14 -mCh 图像。
6. 在 ImageJ 中，转到 Image – Stacks – Reslice [/]… 此步骤将绘制一个 kymograph，显示 PrP PG14 -mCh 粒子（x 轴）随时间（y 轴）的轨迹（图 11 ）。

图 11. PrP PG14 -mCh 囊泡在培养的海马神经元轴突中的转运。 ImageJ 的屏幕截图显示了轴突的 kymograph 的代表性图像，显示了 PrP PG14 -mCh 移动或静止囊泡的轨迹。电影长 5 分钟，使用尼康 TIRF 显微镜以 1 帧/秒（1 赫兹）的帧速率收集。对于获取的所有图像和电影，曝光时间设置为 100毫秒（ Chassefeyre等人，2021 年）。

7. 在 kymographs 上绘制线条以注释两个通道上的所有可识别轨道（图 12，左侧和中间面板）。使用亮度和对比度 (B&C) 工具帮助可视化昏暗的轨道。
注意：轨迹/轨迹的指定，包括荧光暗淡的轨迹/轨迹，由用户凭经验确定。如有必要，可以调整对比度设置以可视化所有轨道，但建议在所有轨道（包括暗轨道）的指定中使用一致性。
8. 将轨道复制并粘贴到同一图像上以可视化重叠轨道（图 12，右面板）。

PG14 -mCh 囊泡运动的 kymographs 分析。 PrP PG14 -mCh（左面板，红色）和 Lamp1-EGFP（中间面板，绿色）囊泡轨道/轨迹的代表性 kymograph 图像。组合（右面板，黄色）轨道/轨迹表示共同运输事件。

9. 通过计算共同运输轨迹的数量除以所有轨道的数量（PrP PG14 -mCh） × 100，计算每个 kymograph 的共同运输轨迹的百分比。这表明 PrP PG14 -mCh 囊泡/内吞体与Lamp1-EGFP 囊泡。在 Microsoft Excel 中记录数字。仅分析一个神经元的每个轴突一个 kymograph。
10. 进行统计分析。如果数据集呈正态分布，则显示表示±SEM，并根据需要执行学生 t 检验或方差分析/多重比较检验。如果数据集不是正态分布的，则显示箱线图、小提琴图或所有数据点并使用非参数检验，例如 Wilcoxon 秩和检验或适当的多重比较检验。

笔记

1. 收集三个生物复制的数据集，即从具有相同遗传背景的三只不同小鼠接种的初级海马神经元，在不同时间点独立接种。
2. 联合运输分析需要对货物移动进行适当的时间分辨率。例如，要对PrP WT -mCh或 PrP PG14 -mCh 囊泡的运输进行成像，合适的采集速率为 10 帧/秒，持续 15 秒。相比之下，要成像 PrP PG14 -mCh内吞体的运动，它们在很大程度上是静止的或移动非常缓慢，请使用 1 帧/秒 5 分钟。查阅以前关于细胞器或膜结合隔室不同动力学的文献，以获得用于定量分析的最佳延时视频质量。
3. 细胞体成像需要宽场成像或共聚焦模块的解卷积。在轴突中，宽场或伪 TIRF 足以进行定量成像，因为薄轴突区域的离焦光很少。
4. 在我们的实验中，用于培养海马小鼠神经元的培养箱被设置为 5.5% CO 2以确定观察到的来自家系的CO 2水平的微小波动不会导致 CO 2水平降至 5.0% 以下，这是用于实验的标准水平海马神经元培养（Kaech 和 Banker，2006）。众所周知，小鼠海马神经元可以在 >5% CO 2中生长（盖斯勒等人，2013）。在 TIRF 显微镜成像期间，CO 2由一个罐提供，该罐将 5.0% CO 2连续稳定地输送到显微镜培养/成像室。
5. 内吞体的灰度值阈值是根据经验独立确定的，适用于每个图像/单个轴突。

食谱

1. 硼酸盐缓冲液(5 mL)
1.24 克硼酸
1.90 克硼砂
溶于 400 mL ddH 2 O，pH 8.5，过滤灭菌，并储存在 4 °C。

2. 1 mL 0.05% DNaseI
50 毫克DNaseI
0.5 mL 的 1.2 M MgSO 4
100 mL 的 HBSS（无 pen-strep）

3. 聚-L-赖氨酸原液
试剂终浓度数量
聚 L-赖氨酸 (1 毫克/毫升) 0.05 毫克/毫升 0.5 毫升
硼酸盐缓冲液 (pH 8.5) 不适用 9.5 毫升
全部的不适用 10毫升

4. 解剖媒体
将 pH 值调整为 7.3，过滤灭菌，并储存在 4°C。
试剂终浓度数量
哈佛商学院不适用 500 毫升
D-葡萄糖
肝素
笔链不适用
不适用
不适用 0.4克
0.834 克
5毫升
全部的不适用 505 mL，pH 7.3，过滤灭菌

脑消化酶（混合物A）
过滤灭菌并在 -20 °C 下储存等分试样。
试剂终浓度数量
PBS
DL-半胱氨酸盐酸盐
牛血清白蛋白
D-葡萄糖不适用
不适用
不适用
不适用 4毫升
1毫克
1毫克
25 毫克
全部的不适用 5毫升

5. 电镀介质
500 mL DMEM 高葡萄糖 (1 × )，含酚红 + L-Glut，不含 Sod。焦油。
50 mL 的胎牛血清
储存在 4 °C 并在电镀前预热至 37 °C。
试剂终浓度数量
数字微机不适用 28 毫升/脑
全部的不适用 28 毫升

6. 培养基
储存在 4 °C 并在电镀前预热至 37 °C
试剂终浓度数量
NBA 不适用 48.875 毫升
谷氨酰胺
B27 不适用
不适用 0.125 毫升
1毫升
全部的不适用 50 毫升

致谢

我们感谢 Romain Chassefeyre和原始研究论文的合著者(Chassefeyre 等人，2021）进行实验。这项工作得到了 NIH/NIA R01AG049483 和 R01AG076745 赠款的支持；由格伦医学研究基金会颁发的衰老生物学机制研究奖；获得劳伦斯埃里森基金会颁发的老龄化新学者奖； SEETC 获得了百特家族基金会的奖励，并得到了泰国政府科技人才发展和促进项目 (DPST) 奖学金的支持。 AV 和 YW 得到了Dorris神经科学中心奖学金的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

我们的鼠标协议由斯克里普斯研究所 (Scripps Research) 的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 审查和批准，所有菌落均按照斯克里普斯研究所动物资源部 (DAR) 推荐的指南进行维护。

参考

Chassefeyre, R.、Chaiamarit, T.、Verhelle, A.、Novak, SW、Andrade, LR、Leitao, ADG、Manor, U. 和 Encalada, SE (2021)。内体分选驱动轴突朊病毒蛋白内吞体的形成。科学进阶7(52)：eabg3693。
Encalada, SE、Szpankowski, L.、Xia, CH 和 Goldstein, LS (2011)。稳定的驱动蛋白和动力蛋白组件驱动哺乳动物朊病毒蛋白囊泡的轴突运输。单元格144(4)：551-565。
Geissler, M.、Gottschling, C.、Aguado, A.、Rauch, U.、Wetzel, CH、Hatt, H. 和 Faissner, A.（2013 年）。初级海马神经元缺乏四种关键的细胞外基质分子，表现出突触结构和功能的异常以及神经元周围网络形成的严重缺陷。 J Neurosci 33(18)：7742-7755。
Hofmann, I. 和 Munro, S. (2006)。 N-末端乙酰化的 Arf 样 GTP 酶定位于溶酶体并影响其运动性。 J Cell Sci 119（第 8 部分）：1494-1503。
Kaech, S. 和 Banker, G. (2006)。培养海马神经元。 Nat Protoc 1(5)：2406-2415。
Khatter, D.、Raina, VB、Dwivedi, D.、Sindhwani, A.、Bahl, S. 和 Sharma, M.（2015 年）。小 GTPase Arl8b 调节哺乳动物 HOPS 复合物在溶酶体上的组装。 J Cell Sci 128(9): 1746-1761。
Satpute-Krishnan, P.、Ajinkya, M.、Bhat, S.、Itakura, E.、Hegde, RS 和 Lippincott-Schwartz, J.（2014 年）。 ER 应激通过分泌途径清除错误折叠的 GPI 锚定蛋白。单元格158(3)：522-533。
Zavodszky, E. 和 Hegde, RS (2019)。错误折叠的 GPI 锚定蛋白由 ER 衍生因子护送通过分泌途径。生活8 ：e46740。