材料与试剂
人脂肪来源的间充质干细胞（HMSC-AD）（ ScienCell ，目录号：7510）；储存：液氮
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Fisher Scientific，目录号：10010031）；储存：室温（RT）
纤连蛋白（ ScienCell ，目录号：8248）；储存：-80 °C。储存前将试剂分装到工作体积中
间充质干细胞生长补充剂和基础培养基（完整试剂盒）（ ScienCell ，目录号：7501）；储存：-20℃，避光
台盼蓝（0.4%）（Thermo Fisher，目录号：15250061）；存储：RT
胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher，目录号：25200056）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作体积中
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，目录号：12483020）；储存：分装成工作体积并储存在-20°C
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)（Thermo Fisher，目录号：14040117）；存储：RT
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：472301）；贮藏：室温，避光
聚-L-鸟氨酸（PLO）（Sigma-Aldrich，目录号：P4957）；储存：4°C
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM)，高葡萄糖，不含谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，11-960-044）；储存：2 – 8 °C，避光
层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：L2020）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
Neurobasal 培养基（ Thermo Fisher，目录号：21103049）；储存：4℃，避光
B-27 补充剂（50 × ），无血清（Thermo Fisher，目录号：17504001）；储存：-20℃，避光。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
GlutaMAX TM补充剂（ Thermo Fisher，目录号：35050061）；贮藏：室温，避光
青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
吗啡胺（Sigma-Aldrich，目录号：SML0868）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
成纤维细胞生长因子 8 (FGF8)（R&D Systems，目录号：423-F8-025）；储存：-80 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
LDN-193189（STEMCELL Technologies，目录号：72147）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
SB431542（STEMCELL Technologies，目录号：72232）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
脑源性神经营养因子（BDNF）（ PeproTech ，目录号：450-02）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
TissuePrint -HV 套件（Axolotl Bioscience）；储存：-20 °C。用于 BIO X 打印机
TissuePrint -LV 试剂盒（Axolotl Bioscience）；储存：-20 °C。在 Aspect RX1 打印机上使用
TissuePrint交联剂（Axolotl Bioscience）；储存：-20 °C。用于 BIO X 和 Aspect RX1 打印机
LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒（Thermo Fisher，目录号：L3224）；储存：-20℃，避光
福尔马林溶液，中性缓冲，10%（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）；存储：室温
Triton X-100（Sigma-Aldrich，9036-19-5）；存储：室温
正常山羊血清（Abcam，目录号：ab7481）；储存：-20 °C。将试剂分装到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
一抗：抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体-神经元标记物（Abcam，目录号：ab1120）；储存：-20 °C。将试剂等分到工作卷中。避免多次冷冻/解冻循环
一抗：抗 β-III 微管蛋白 (TUJ1) 抗体 - 神经元特异性（R&D Systems，目录号：MAB1195）；储存：-20 °C。将试剂等分到工作卷中。避免解冻/冷冻循环
二抗：山羊抗小鼠 (Alexa Fluor® 488 )（Thermo Fisher，目录号：D1306）；储存：4℃，避光
二抗：山羊抗兔 (Alexa Fluor® 568 )（Thermo Fisher，目录号：A11011）；储存：4℃，避光
DAPI （Thermo Fisher，目录号：D1306 ）；储存：-20 °C（储备溶液）或 4 °C（稀释溶液）。避免多次冷冻/解冻循环
FLIPR 膜电位测定试剂盒蓝色（Molecular Devices，目录号：R8042）；储存：组分A：RT；组分 B：4 °C
氯化钾（ KCl ）（Caledon，目录号：5920170）；存储：RT
多巴胺特异性酶联免疫测定（ELISA）试剂盒（ Abnova ，目录号：KA3838）；储存：4°C
冷冻管（STEMCELL Technologies，目录号：200-0555）
T-75 烧瓶，组织培养处理
50 mL 和/或 15 mL 锥形，无菌
各种尺寸的移液器吸头（1,000 μ L 、200 μ L 、20 μ L ），经过灭菌和过滤
Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：66662）
康宁® CoolCell®容器（Cole Palmer，目录号：RK-04392-00）；储存：室温/-80 °C
12 孔细胞培养板（Sigma-Aldrich，目录号：M8687 ）
LOP 打印头（Aspect Biosystems，目录号：1256）
网格，正方形，50 × 50 mm，10 件装（Aspect Biosystems，目录号：2067）
RX1 管，74 厘米（Aspect Biosystems，目录号：7779）
RX1 管，54 厘米（Aspect Biosystems，目录号：7777）
没有端盖和尖盖的空墨盒，3 mL（CELLINK，目录号：CSC010300502）
无菌标准锥形生物打印喷嘴，22 G（CELLINK，目录号：NZ4220005001）
母/母鲁尔锁适配器（CELLINK，目录号：OH000000010）
5 cc luer lock 注射器 w/o 针头（Terumo Medical Corporation，目录号：SS-05L）
各种尺寸的血清移液器（25、10、5 和 1 mL）
液氮杜瓦瓶
对照组细胞培养基（见食谱）
实验细胞培养基（见食谱）
完全间充质干细胞 (MSC) 培养基（参见食谱）
在 PBS 中稀释 PLO（参见食谱）
在 DMEM 中稀释层粘连蛋白（参见食谱）
钙黄绿素AM 和 Ethidium Homodimer-1 溶液（参见配方）
0.1% Triton-X 溶液（参见配方）
5% NGS 溶液（参见配方）
一抗溶液（见配方）
二抗溶液（参见配方）
300 nM DAPI 溶液（参见配方）
70% 乙醇溶液（见配方）
氯化钾溶液（见食谱）
10 % DMSO 冷冻培养基溶液（参见配方）

设备

BIO X 打印机 (CELLINK, S-10001-001)
RX1 生物打印机（Aspect Biosystems，46135）
DMI3000B显微镜（徕卡）
X-Cite 系列 120Q 荧光光源（ Excelitas Technologies，XI120-Q）
格式商标 Steri-Cycle TM CO 2培养箱（Thermo Fisher，370）
Infinite M200 Pro 读板机（TECAN，30050303）
共聚焦激光扫描显微镜 (FIPS-Zeiss) 10倍和 20倍放大倍率
Retiga 2000R 数码 CCD 相机（ QImaging ）
生物安全柜（BSC）
水浴锅 (VWR, 89032-299)
Lab Armor TM微珠（ Thermo Fisher，A1254301）
离心机 5810 R（Eppendorf，5811000015）
-80 °C 冰箱
移液器控制器
德诺维克斯 CellDrop FL ( DeNovix CellDrop FL)

软件

Qcapture软件2.9.12
Excel（微软）
ImageJ V1.52a
Prism 5 (GraphPad) 统计软件

程序

培养 MSCs 进行细胞扩增

对于本实验中使用的脂肪来源的 MSC，此协议已从ScienCell协议中略微调整。如果您从不同来源获得 MSC，建议您在扩增细胞时使用 MSC 的特定方案。

用纤连蛋白涂覆 T75 烧瓶
在 BSC 中工作，将 5 mL 的 PBS 和 150 μL的纤维连接蛋白添加到 15 mL 锥形中，以构成 30 μg/mL 纤维连接蛋白溶液。混合并添加到 T75 烧瓶中。
轻轻前后移动烧瓶，然后左右移动，以均匀覆盖板底，确保没有干点。
用 70% 乙醇喷洒烧瓶外部，并放置在 37 °C 和 5% CO 2的培养箱中过夜。
播种细胞
准备完整的 MSC 培养基并将其置于 RT（参见注释 15）。请参阅配方 3。
从培养箱中取出纤连蛋白涂层板，用 70% 乙醇喷洒板，然后放入 BSC 中。
吸出纤连蛋白溶液，并在烧瓶中加入 15 mL 的完整 MSC 介质。将烧瓶放在一边。
从液氮中取出HMSC-AD的冷冻冷冻管，并将其放入 37°C 水浴中，不要浸没盖子。握住盖子并轻轻旋转小瓶。
当一个小冰晶仍然存在时，用乙醇喷洒冷冻管并将其放置在 BSC 中。
小心取下解冻细胞的盖子，不要接触内螺纹。
使用 1 mL 移液器将细胞从冷冻管转移到纤连蛋白涂层烧瓶中，一滴一滴地转移。参见注释 5。
更换烧瓶上的盖子。前后移动板，然后左右移动，使细胞均匀分布。
在显微镜下观察细胞以确保均匀分布。请参阅注 1。
将烧瓶放入 37°C 和 5% CO 2的培养箱中。
至少 16 小时内不要打扰板。
第二天和此后每 48 小时更改一次媒体，直到文化大约 50% 汇合。
文化融合 50% 后，执行每日媒体更改。
当培养物达到大约 90% 汇合时，您可以传代到新的培养板/烧瓶中或冷冻细胞。
改变媒体
将 MSC 媒体加热到 RT。请参阅附注 15。
从培养箱中取出带有 MSC 的 T75 烧瓶。
在显微镜下检查细胞的汇合度和形态。
用 70% 乙醇对板进行消毒，然后放入 BSC 中。
使用 25 mL 血清移液器通过倾斜烧瓶从烧瓶中取出介质，使介质积聚在一个角落并将血清移液器放在那个角落。小心不要刮到烧瓶底部或用移液管接触烧瓶口。
添加 15 mL 的完整 MSC 介质。
在显微镜下检查以确保细胞仍然附着在板表面。
将烧瓶放入 37°C 和 5% CO 2的培养箱中。
传代细胞
将完整的 MSC 介质、胰蛋白酶-EDTA、FBS 和 DPBS 加热到 RT。
从培养箱中取出带有 MSC 的 T75 烧瓶。
在显微镜下检查细胞的汇合度和形态，以确认 MSC 的汇合度在 90% 左右。
用 70% 乙醇对板进行消毒，然后放入 BSC 中。
使用 10 mL 血清移液器从盘子中吸出介质。
通过添加 DPBS 并在不久后将其移除，用 5 mL 的 DPBS 轻轻清洗细胞。
将 5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 添加到烧瓶中，并在 37°C 下孵育大约 1–2 分钟，或直到细胞聚集起来。在孵化过程中检查细胞，看它们是否变圆或脱离平板。
用 70% 乙醇喷洒烧瓶，然后放入 BSC。将胰蛋白酶溶液从烧瓶转移到 50 mL 锥形容器中，其中含有与胰蛋白酶等量的 FBS。如果将 5 mL 的胰蛋白酶添加到细胞中，则将 5 mL 的 FBS 添加到锥形中。
在没有任何溶液的情况下，将烧瓶放回培养箱中再放置一分钟。
在孵育结束时，轻轻敲击烧瓶以分离细胞。在显微镜下检查以确保细胞全部分离。
将 5 mL 的 FBS 添加到烧瓶中，并将内容物转移到 50 mL 锥形瓶中。
在显微镜下检查烧瓶，确保烧瓶中的细胞少于 5%。
可以使用 5 mL 的 DPBS 对烧瓶进行额外的清洗，以收集任何剩余的细胞。
以 123× g离心5 分钟。
同时，将 15 mL 的完整 MSC 介质添加到准备好的纤连蛋白涂层烧瓶中。请参阅步骤 A1。
离心后，从 50 mL 锥形管中吸出上清液。小心不要打扰细胞沉淀。
将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的完整 MSC 介质中，并上下移液器以确保细胞悬浮均匀。
使用台盼蓝和细胞计数器或血细胞计数器对细胞进行计数（如果您不接种细胞，请参阅步骤 A5 了解冷冻方案）。
2的密度铺板细胞。公式 1 可用于计算每口井（或烧瓶）所需的细胞悬浮液量。 T75 烧瓶的示例计算如下所示。请参阅注释 6。

mL per well: ((seeding density (cells/(cm^2 )) × surface area (cm^2 )))/(live cells (cells/mL) )=X mL×1,000=µL per well 公式 1

mL per flask: ((6,000 (cells/(cm^2 )) × 75 (cm^2 )))/10,000,000(cells/mL) =0.045 mL×1,000=45 μL per flask 样本计算

将计算出的细胞悬浮液数量添加到含有 15 mL 介质的烧瓶中。使用 1 mL 移液器将细胞添加到烧瓶的中间，然后来回移动，然后左右移动，以均匀分布细胞。请参阅注 1。
在显微镜下检查细胞以确保均匀分布。
将烧瓶放入 37°C 和 5% CO 2的培养箱中。
至少 16 小时内不要打扰烧瓶。
第二天和之后每 48 小时更改一次媒体，直到文化大约 50% 汇合。
文化融合 50% 后，执行每日媒体更改。
当培养物达到大约 90% 的汇合度时，您可以传代到新的平板中或冷冻细胞。
冷冻细胞
从步骤 A4r 开始，在执行细胞计数后，将大约 5–10 mL 的完整 MSC 介质添加到剩余的细胞悬浮液中。
以 123× g离心5 分钟。
同时，用细胞类型、传代数、细胞数、日期和您的姓名缩写标记所需数量的冷冻管。每个冷冻管的细胞数应为每 1 mL 10 % DMSO 冷冻培养基溶液100 万个。
在新的锥形中，将 10% 的 DMSO 溶液混合在完整的 MSC 介质中。请参阅食谱 14。
离心后，吸出上清液。小心不要打扰细胞沉淀。
将每 100 万个细胞在完整的 MSC 介质中稀释的 1 mL 10% DMSO 添加到包含细胞颗粒的锥形中。轻轻上下移液以重悬细胞。此步骤必须快速完成，因为细胞可能在 RT 的 DMSO 中受到不利影响。
在每个冷冻管中加入 1 mL 重新悬浮的细胞。
将冷冻管转移到 Corning ® CoolCell ®容器并置于 -80 °C 冰箱中 24 小时。
24 小时后，将冷冻管放入液氮杜瓦瓶中。

在 2D 细胞培养板上将 MSCs 分化为多巴胺能神经元

在进行任何生物打印实验之前，重要的是进行 2D 细胞培养实验以确定 MSC 是否会成功分化为多巴胺能神经元并优化细胞密度以进行分化。请注意，此协议已从Trzaska和 Rameshwar ( Trzaska and Rameshwar, 2011).

用聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂覆 12 孔板
μg / mL的最终浓度。参考食谱 4。
在 12 孔细胞培养板中每孔加入 0.5 mL 的 PLO/PBS。
轻轻前后左右移动板，以均匀地覆盖板的底部，确保孔中没有干点。
用封口膜包裹并在室温下孵育 2 小时。每 30 分钟检查一次板以确保它不会蒸发。或者，将板在 2–8 °C下孵育过夜。
2 小时或第二天后，使用 10 mL 血清移液器吸出 PLO。
用 1 mL/孔的 PBS 冲洗每个孔。
用 0.5–1 mL/孔的冰冷 DMEM 冲洗两次。请参阅注释 2。
在漂洗中间，用 DMEM 稀释层粘连蛋白溶液以达到 10 的最终浓度微克/毫升。请参阅注释 3 和 4。请参阅配方 5。
每口井加入 0.5 mL 的稀释层粘连蛋白溶液。
2的培养箱中放置 2 小时。如果不立即使用盘子，请将其放入 4 °C 的冰箱中长达一周。
准备好使用时，吸出层粘连蛋白并播种细胞。
用于多巴胺能分化的种子细胞
当 MSC 达到 90% 汇合时，按照步骤 A4 将它们传代。
执行细胞计数后，将细胞播种到板上。应进行细胞滴定实验，以不同密度接种细胞以确定细胞系的最佳接种密度。建议：1,200–25,000 个细胞/cm 2 。请参阅注释 1、6 和 7。
从第-1天到第12天培养
在第 -1 天（播种细胞的那一天），向每个孔中添加 1 mL 的完整 MSC 介质，以使细胞粘附。对控制组和实验组执行此操作。添加了一个对照组，以便很明显分化方案有效。参见注释 7。
2的培养箱中放置过夜。
在第 0 天，删除完整的 MSC 媒体并将相应的媒体添加到对照组和实验组。请参阅食谱 1 和 2。
将盘子放回培养箱中 9 天，无需任何媒体更改。可以在显微镜下检查细胞以监测它们的进展。
在第 9 天，将 50 ng/mL 的 BDNF 直接添加到实验组中，而不进行任何媒体更改。不要将 BDNF 添加到对照组。
将盘子放回培养箱中，再孵育三天。
12 天后，可以使用免疫细胞化学、活/死测定、电生理学和 ELISA 对细胞进行分析。细胞培养期示意图见图1。

图 1. (A) 对照组和 (B) 2D 和 3D 培养实验组的细胞培养期示意图

准备生物墨水

为 Aspect Biosystem 生物打印机准备TissuePrint - 低粘度 (LV) 和高粘度 (HV) 生物墨水
在使用前最多一天在 4°C 下解冻组分 1（藻酸盐）和组分 3（纤维蛋白），并确保它们在使用前均质。
在混合生物墨水之前，按照步骤 A4 通过 MSC。
一旦 MSC 被计数，将细胞以 123 x g离心5 分钟。请参阅附注 8。
离心完成后，在不干扰细胞颗粒的情况下，将含有 MSCs 的锥形放置在锥形架中，并在混合生物墨水成分时放入培养箱中。不要去除上清液。
在加入其余生物墨水之前，立即在 RT解冻组分 2（京尼平）。
在无菌 BSC 中工作，在 RT 将组件 2 添加到组件 1。如果组分 2 开始结块，请使用大口径移液器缓慢上下移液以分散团块。
从培养箱中取出含有 MSC 的锥形，用 70% 乙醇对锥形进行消毒，然后放入 BSC 中。
小心去除上清液，不要干扰细胞沉淀。
将 1 mL 的组件 3（在 RT）添加到细胞中，并通过非常轻轻地上下移液来重新悬浮。剧烈的移液可能会导致细胞死亡。将组件 3 的其余部分添加到细胞中，并轻轻上下移液。每毫升生物墨水的细胞密度取决于所使用的特定细胞系。需要进行细胞密度滴定实验以发现哪种密度最适合每个细胞系。通常，使用的细胞密度为每毫升生物墨水 2 到 1000 万个细胞。请参阅附注 8。
使用 1 mL 移液器尖端将组件 3 和 MSC 混合物缓慢添加到组件 1 和组件 2 的混合物中。轻轻上下移液，慢慢混合完整的生物墨水溶液。避免产生气泡。参见附注 9。
准备交联剂
在 4°C 下解冻组分 A 和组分 B。
使用血清移液器将组分 B 添加到组分 A 中，并上下移液以混合。

CAD设计

为 Aspect Biosystems RX1 生物打印机选择设计
选择“New STL”并为结构输入参数。
选择“保存 STL”并命名您的 STL 文件。
选择“Infill Editor”并在 Material 1 下选择直线填充图案，填充率为 40%，周长为 0，纤维直径为 0.1 mm。
选择“构建设计”将 STL 文件转换为设计文件并命名您的文件。
为 CELLINK BIO X 生物打印机选择设计
在 BIO X 触摸屏上选择“ Bioprint ”。
选择“3D 模型”选项卡并选择尺寸为 10 × 3 毫米的圆顶模型。
选择“表面”选项卡并选择 12 孔板及其供应商。
选择“打印机”选项卡并选择“工具 1”和工具类型，它应该是 3 mL 气动注射器。
选择“图层”选项卡；对于“网格”选择直线，对于“填充密度”选择 20%–25%。根据您的打印机，这些参数可能需要在打印过程中进行调整。

生物打印

使用 Aspect Biosystems RX1 生物打印机进行生物打印
在打印日的前一天，对图 2 中的所有设备进行高压灭菌。确保您拥有生物打印所需的设备，包括 LOP 打印头、RX1 管和网片。
有关如何使用该系统打印的详细说明，请参阅视频 1：使用 RX1 Aspect Biosystem Bioprinter 进行生物打印。
一旦结构被生物打印，使用无菌刮刀从打印阶段拿起结构，并使用另一个刮刀小心地将结构从第一个刮刀上滑到板上。该板应该是一个 PLO/Laminin 涂层的 12 孔板，其中包含适当的介质（每孔一个构造）。请参阅附注 10。

图 2. 用于 3D 生物打印的高压灭菌材料。 A)锥形支架 (2 × ); B) 125 mL Nalgene 瓶 (2 × )； C) 125 mL Nalgene 瓶盖和管紧固件 (2 × )； D) 15 mL bioink锥形印刷盖和管紧固件； E) 500 mL 喷射瓶； F) 漏斗； G) 200 mL 烧杯 (2 × )； H) 50 毫升烧杯； I) 20 mL 烧杯； J) Nalgene 容器； K) 印刷阶段； L) 塑料镊子； M) 金属镊子； N) 抹刀 (2 × )。

视频 1. 使用 RX1 Aspect 生物系统进行生物打印

CELLINK 的B IO X 进行生物打印
打印日的前一天，对图 3 中的所有设备进行高压灭菌。
有关如何使用该系统进行打印的详细说明，请参阅视频 2：使用 CELLINK RX1 生物打印机进行生物打印。请注意，出于可视化目的，生物墨水已使用绿色食用染料着色。
一旦结构被生物打印，将 1 mL 的交联溶液添加到井中。让它静置 2-3分钟，然后使用无菌抹刀，小心地将 3D生物打印结构转移到包含适当介质（每孔一个结构）的 PLO/层粘连蛋白涂层 12 孔板中。请参阅附注 10。

BioX进行 3D 生物打印所需的材料。 A) 12孔细胞培养板； B) 抹刀； C) 5 cc luer lock 注射器 w/o 针头； D) 3 毫升墨盒； E) 22G，生物打印喷嘴和塞子； F) 母/母鲁尔锁适配器。

视频 2. 使用 CELLINK RX1 生物打印机进行生物打印

3D 生物打印后培养 MSC

聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被板
请参阅注释 1、2、3、4 和 11。
有关如何用 PLO/Laminin 涂覆板的步骤，请参阅协议部分 B1。
培养 3D生物打印结构
生物打印的那一天），向每个孔中添加 1 mL 的完整 MSC 介质，以使细胞适应新环境。
2的培养箱中放置过夜。
在第 0 天，取出完整的 MSC 介质，并将相应介质的 2 mL（用于 12 孔板）添加到对照组和实验组。请参阅配方 1 和 2。确保构建体完全被媒体覆盖——如果构建体的一部分伸出，请根据需要添加更多媒体。
将盘子放回培养箱中 9 天，无需任何媒体更改。可以在显微镜下监测细胞以检查它们的进展。
在第 9 天，将 50 ng/mL 的 BDNF 直接添加到实验组中，而不进行任何媒体更改。不要将 BDNF 添加到对照组。
将盘子放回培养箱中，再孵育三天。
12 天后，可以对细胞进行分析。细胞培养期示意图见图1。

细胞活力

在第 9 天（添加 BDNF 之前）和第 12 天使用 LIVE/DEAD TM Viability/Cytotoxicity 试剂盒进行活力测定。
从培养箱中取出细胞并在显微镜下检查它们的形态。
从每个细胞培养井中吸出培养基。
钙黄绿素AM（组分 A）和 0.2% 乙锭 homodimer-1（组分 B）制备溶液。参考配方 6。根据您需要研究的孔数预先确定您需要多少完整的解决方案。通常，每孔添加 1 mL 的完整溶液。如果您有 12 个孔，则配制总体积为 12 mL 的溶液。确保 3D 构造完全被解决方案覆盖。
用 1–2 mL 的 DPBS 清洗一次。
钙黄绿素/乙锭溶液添加到井中，以完全淹没 3D 的结构或 2D 的细胞。
将细胞在 37 °C 和 5% CO 2下孵育3D 30分钟或二维15分钟。
Qcapture软件 2.9.12使用带有 X-Cite 系列 120Q 荧光光源的 Leica DMI3000B 显微镜对结构进行成像。
通过对构建体上的一个点进行成像并在等距 Z 平面中拍摄 15 张图像来量化生存能力。在每个 Z 平面上，使用 488 nm 激光拍摄一张图像以可视化活细胞，并使用 543 nm 激光拍摄一张图像以可视化死细胞。确保在保存这些图像时注意它是活图像还是死图像。
使用 ImageJ V1.52a 软件创建 Z 投影。
使用 ImageJ 软件计算活细胞和死细胞的数量，以确定整个构造的可行性。使用 LIVE/DEAD TM活力/细胞毒性试剂盒，活细胞和死细胞分别被荧光标记为绿色和红色。请参阅数据分析部分 A 部分。

免疫细胞化学

免疫细胞化学可以在第 12 天对 3D 和 2D 培养物进行，以可视化早期神经元标记 TUJ1 和多巴胺特异性标记酪氨酸羟化酶 (TH)。请参阅附注 14。

从细胞培养板孔中吸出培养基。
用 PBS 清洗细胞两次。
用 10% 福尔马林溶液固定细胞，并在 RT 孵育 20 分钟进行 3D 培养或 10 分钟进行 2D 培养。
吸入福尔马林。
用 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤之间在室温下孵育 2 分钟。
用 0.1% Triton-X 渗透细胞，并在 RT 孵育 45 分钟进行 3D 培养或 10 分钟进行 2D 培养。参考食谱 7。
吸出 Triton-X 溶液。
在 PBS 中用 5% NGS 阻断细胞，并在 RT 孵育 1–2 小时。参考食谱 8。
添加两种主要抗体： 1:500 的抗 TH和 1:100 稀释的抗 TUJ1。参考食谱 9。
在 4°C 下孵育过夜，以 100 rpm 的速度摇动。
孵育后用 PBS 洗涤 3 次。
添加二级抗体（山羊抗小鼠 Alexa Fluor ® 488 和山羊抗兔 Alexa Fluor ® 568）以 1:200 稀释于 5% NGS 的 PBS 溶液中。请参阅配方 10。
在 RT 孵育 2 小时，以 100 rpm 的速度摇动。
用 PBS 清洗细胞两次。
nM DAPI染色细胞。请参阅食谱 11。
孵育 5分钟。
用 PBS 洗涤细胞两次。
使用 FIPS-Zeiss 共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像。
在此之后，使用 ImageJ V1.52a 软件计算 DAPI 阳性、TUJ1 阳性和 TH 阳性细胞的数量。请参阅数据分析部分 B 部分。

电生理学

关闭 BSC 中的灯（电压敏感染料对光敏感）。
吸出 1 mL 的介质并留下 1 mL 的介质。对于 3D 构造，请注意不要吸入构造的一部分。
将 1 mL 的 FLIPR 膜电位检测试剂盒蓝色添加到细胞和 3D 结构中，使培养基与 FLIPR 检测染料之间的比例为 1:1。
2的培养箱中放置 45 分钟。
使用 TECAN Infinite M200 Pro Plate Reader 读取板以读取 560 nm 的荧光发射，并从 5 × 5 网格中的每个孔中读取 25 个读数。
初始读数后，从井中取出 1.56 mL 的溶液，并在蒸馏水中添加浓度为 56 mM 的KCl 。请参阅食谱 13。
2条件下孵育 3D 结构或 2D 细胞培养物 30 分钟。
孵化后，使用 TECAN Infinite M200 Pro Plate Reader 读取板，读取 560 nm 处的荧光发射，并从 5 × 5 网格中的每个孔中读取 25 个读数。
请参阅注释 12 和数据分析部分 C 部分。

多巴胺酶联免疫吸附试验 (ELISA)

在第 12 天从控制组和实验组的 3D 或 2D 培养物中收集培养基。从三种不同的结构中收集培养基，这样你就有了三个重复。
按照制造商的说明，使用多巴胺特异性 ELISA 试剂盒分析释放的多巴胺浓度。请参阅附注 13。
使用设置为 450 nm 和 635 nm 参考波长的 TECAN Infinite M200 Pro Plate Reader 读取输出吸光度，或按照您选择的多巴胺 ELISA 试剂盒中的描述进行读取。
请参阅数据分析部分 D 部分。

数据分析

可行性

打开 ImageJ 上的活图像和死图像，并在构造的一个位置创建一个 Z 项目。确保在进行 Z 投影时单元格不会隐藏在其他单元格后面。如果发生这种情况，请在不执行 Z 堆栈的情况下对每个图像执行以下步骤。
按照以下步骤分别计算活细胞和死细胞：
Process > Subtract background > 12 pixels > Ok > Image > Adjust > Threshold > B&W > Adjust slider so only the cells are dark and background is white > 应用 > Process > Binary > Fill Holes > Process > Binary > Convert to Mask > 处理 > Binary > Watershed > Analyze > Analyze Particles > 120-infinity（相应调整）> Show > Outlines > Exclude on Edges > Ok.
使用公式 2 计算构造每个部分的细胞活力。
对三种不同的构造执行这些计算。

Cell viability (%)= ((number of live cells))/((number of live cells+number of dead cells) )×100% 公式 2

免疫细胞化学

打开 ImageJ 上的图像并为每个抗体应用不同的颜色。
创建 Z 堆栈并保存这些文件。
为可视化目的创建合成图像。
使用 ImageJ 计算 DAPI 阳性、TUJ1 阳性和 TH 阳性细胞的数量。
执行双尾学生t检验，置信度为 95%（p < 0.05）。执行此操作以确定表达神经细胞标记的细胞数量与对照组和实验组之间的有核细胞数量之间是否存在统计学上的显着差异。在 Prism 5 (GraphPad) 统计软件上执行此测试。

电生理学

要计算膜电位，请使用下面的等式 3，其中R是气体常数 (8.314 J/ Kmol )， T是以开尔文为单位的温度， F是以 As/mol 为单位的法拉第常数， z是外部染料的表观电荷 (本实验假设为 -0.64，但可以通过实验确定）， ΔF = F – F o是酶标仪的读数，其中F是构建体和细胞的读数， F o是背景荧光读数只是构造(Robinson et al., 2019).建议在 Excel 上执行这些计算。

∆E= RT/z'F ln⁡(1/(∆F/F_o +1)) 公式 3

使用 Prism 5 (GraphPad) 统计软件，使用 95% 的置信水平（p < 0.05）执行单向方差分析和 Tukey 事后分析。

多巴胺ELISA

通过绘制 y 轴（线性）上的平均吸光度读数与 x 轴上相应的标准浓度（对数）来获得标准曲线。
使用 Prism 5 统计软件获得样条曲线拟合，并为每个未配对的吸光度读数插入未知浓度值。
该测定是一种竞争性测定，因此随着吸光度值降低，浓度增加。

笔记

始终用您的全名或首字母缩写、日期（月/日/年）、平板包含的内容和细胞传代数标记平板。
PLO 对细胞有毒，因此漂洗步骤至关重要。
始终确保层粘连蛋白是冷的。不要让层粘连蛋白来 RT。避免冷冻/解冻循环——层粘连蛋白不应冷冻两次以上。
层粘连蛋白应在使用前等分。层粘连蛋白的体积和浓度因批次而异。分装前请务必参考批号。
不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的危害比培养物中残留的 DMSO 的影响更大。因此，将细胞直接添加到新细胞培养板中的培养基中，并在第二天更换培养基以在细胞附着后去除任何 DMSO。
活细胞的数量是您将用于计算将添加到孔中的细胞数量的数量。不要使用细胞总数。
接种足够多的孔，以便每个细胞密度和对照组可以有三个重复。
确保您有足够的 MSC 用于打印目的。接种密度可以从每毫升生物墨水 2 到 1000 万个细胞不等，具体取决于您的细胞系。这可能需要数周的 MSC 传代，以便您可以积累足够的细胞。
为获得最佳效果，请在一小时内使用。还建议制作小批量的生物墨水（一次大约 4 mL），这样如果生物打印遇到任何挫折，材料和细胞就不会浪费。
在生物打印前一天准备 PLO/Laminin 板非常重要，以便在生物打印过程中准备好板。
在打印前一两天执行此步骤，以便印版准备好打印当天。
我们使用这种方法是因为 3D 组织不能轻易地进行贴片钳制。这种分析是在控制组和实验组上进行的。它还在无细胞结构 (3D) 或空白孔 (2D) 上进行，它们是背景荧光的对照。
我们的实验室使用了Abnova多巴胺 ELISA 试剂盒（请参阅目录号的材料和试剂部分），因为它可以检测低浓度的多巴胺。
建议对一抗和二抗进行滴定，以确定每种抗体对您的细胞系的最佳浓度。
不建议将介质放在水浴中，因为这会导致某些组件降解。

食谱

对照组细胞培养基
神经基础媒体 (NBM)
2% B-27 补充剂
1% GlutaMAX TM
1% 青霉素-链霉素

实验细胞培养基
对照组细胞培养基
250 纳克/毫升purmorphamine
100 纳克/毫升的 FGF8
100 nM LDN-193189
10 µM 的 SB431542

完全间充质干细胞(MSC) 培养基
混合 MSC 媒体工具包的所有组件，其中包括：
500 毫升的 MSC 基础培养基
25毫升胎牛血清
5 mL 间充质干细胞生长补充剂
5 mL 青霉素/链霉素溶液

在 PBS 中稀释 PLO
根据您的 PLO 批号，从 Sigma-Aldrich 网站获取分析证书 (COA) 并确定购买的瓶子的浓度。
6 mL （足够用于 6或12孔板）所需的 PLO 量，其中 C 1是 PLO 的库存浓度。
将 (6 - V 1 ) mL 的 PBS 添加到无菌的 15 mL 锥形瓶中。
将 V 1 mL 的 PLO 添加到 15 mL 锥形中。

V_1=(C_2 V_2)/C_1 =(15 μg/mL×6 mL)/C_1 方程式 4

在 DMEM 中稀释层粘连蛋白
根据层粘连蛋白的批号，从 Sigma-Aldrich 网站获取 COA 并确定购买的瓶子的浓度。
6 mL （足以用于 6或12孔板）所需的层粘连蛋白的量，其中 C 1是 PLO 的库存浓度。
将 (6 - V 1 ) mL 的 DMEM 添加到无菌的 15 mL 锥形瓶中。
将 V 1 mL 的 PLO 添加到 15 mL 锥形中。

V_1=(C_2 V_2)/C_1 =(10 μg/mL×6 mL)/C_1 等式 5

制作钙黄绿素AM 和 Ethidium Homodimer-1 溶液
要制作 12 mL 溶液，请将 11.97 mL 的 DPBS 添加到 15 mL 锥形中。
在同一个锥形中，添加 6 µL 的 Calcein AM 和 24 μL 的 ethidium homodimer-1。

制作 0.1% Triton-X 溶液
要制作 0.1% Triton-X 的 25 mL 溶液，请将 24.975 mL 的 PBS 添加到 50 mL 锥形中。
对于同一个锥形，添加 25 μL 的 100% Triton X-100。

制作 5% NGS 溶液
要制作 0.1% Triton-X 的 25 mL 溶液，请将 24.975 mL 的 PBS 添加到 50 mL 锥形中。
对于同一个锥形，添加 25 μL 的 100% Triton X-100。

制作一抗溶液
要制作 12 mL 溶液，请将上述 5% NGS 溶液的 11.856 mL 添加到 15 mL 锥形管中。
对于同一个锥形，添加 120 μL 的抗 TUJ1 和 24 μL 的抗 TH。
请参阅附注 14。

制备二抗溶液
要制作 12 mL 溶液，请将上述 5% NGS 溶液的 11.880 mL 添加到 15 mL 锥形管中。
向同一个锥形管中加入 60 µL Alexa Fluor ® 488 和 60 µL Alexa Fluor ® 568。
请参阅附注 14。

制作 300 nM DAPI 解决方案
将 2 mL 蒸馏水添加到 DAPI 小瓶的全部内容物中，制成 14.3 mM DAPI 库存溶液。
在 1 mL Eppendorf 管中，添加 100 μL 的 PBS 和 2.1 μL 的 14.3 mM DAPI 库存溶液，以制作 300 μM DAPI 溶液。
根据需要在 PBS 中稀释 300 μM DAPI 中间稀释 1：1，000，以制作 300 nM DAPI 染色溶液。

制作 70% 乙醇溶液
将 4 L 的 95% 乙醇添加到一个大容器中。
在同一容器中加入 1.43 L 蒸馏水。

制作氯化钾溶液
将 149.1 毫克KCl粉末加入 20 mL 蒸馏水中，制成 100 mM 溶液。
将 560 µL 的 100 mM KCl溶液混合到 440 µL 的介质中，制成 56 mM 的KCl溶液。

制作 10% DMSO 冷冻介质溶液
要制作 10% DMSO 的 10 mL 溶液，请将 9 mL 的完整 MSC 介质添加到 15 mL 锥形管中。
在同一个锥形管中，加入 1 mL 无菌 100% DMSO。

致谢

这项工作由自然科学与工程研究委员会 (NSERC) 发现资助计划、加拿大卫生研究院项目资助计划、创新 BC 的 Ignite 计划、加拿大研究主席、迈克尔史密斯健康研究基金会和太平洋帕金森病研究资助研究所的商业化创新补助金。该协议源自 Willerth 实验室的原始研究论文(Restan Perez et al., 2021)，分化协议修改自（ Trzaska和 Rameshwar，2011 年）。我们还要感谢 Victor Allison da Silva 在生物打印视频方面的帮助。

利益争夺

Stephanie Willerth 博士是 Axolotl Biosciences 的首席执行官和联合创始人，也是股东。她还被列为正在申请的专利“MORPHOGENIC COMPOUND-RELEASING MICROSPHERES AND USE IN BIOINK”的发明人。 Milena Restan Perez 目前受雇于 Axolotl Biosciences。

伦理

这项研究是在维多利亚大学的人类伦理学批准下完成的。

参考

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