材料与试剂

材料
1. GRIN 镜头和适配器，直径 0.5 毫米，长度 8.4 毫米（Inscopix，目录号：100-004155，包括适配器）
2. 底板（Inscopix，目录号：100-004096）
3. 底板盖（Inscopix，目录号：100-002388）
4. 5 位连接器（Mouser Electronics，目录号：437-8618300510001101）
5. 接骨螺钉（JI Morris，目录号：F000CE094）
6. 不锈钢线，绝缘，直径 0.003"（AM Systems，目录号：791100）
7. 银线，绝缘，直径 0.005"（ AM Systems，目录号：786000 ）
8. 柔性钢琴线，直径 0.004"（精密纤维产品，目录号：SMWL-004-01）
9. 不锈钢定制头柱

试剂

1. AAV1-syn-FLEX-GCaMP6f（Addgene，目录号：100833-AAV1）
2. 矿物油（Fisher Scientific，目录号：O121-1）
3. Contemporary Ortho-Jet TM BCA 粉末（Lang Dental Manufacturing，目录号：1530BLK）
4. Ortho-Jet TM液体（Lang Dental Manufacturing，目录号：1304CLR）
5. Kwik-Cast 硅酮密封胶（WPI，目录号：KWIK-CAST）
6. 3M TM Scotch-Weld 环氧粘合剂 DP100 透明（3M，型号：DP-100）
7. 疯狂胶水（Krazy Glue，目录号：KG94548R）
8. 眼药膏（Akorn，目录号：59399-0162-35）
9. 氯胺酮（Butler animal health holding，目录号：071069）
10. Xylazine（Butler animal health holding，目录号：061035）
11. 聚维酮碘（MedSupply Partners，目录号：D02-1202）

设备

1. 微量移液器拉拔器（Sutter Instrument，型号：P-1000）
2. 手术显微镜（徕卡，型号：M60）
3. 立体定位仪器（David Kopf Instruments，型号 900-U）
4. Nanoliter 2020 喷油器 (WPI, NANOLITER2020)
5. 直流温度控制器（FHC，40-90-8D）
6. 微钻（WPI，型号：OmniDrill35）
7. 显微操作器（Sutter Instrument，型号：MP-285A）
8. 微内窥钙成像系统（Inscopix，型号：nVista3）
9. 电生理记录系统（Neuralynx，型号：Digital Lynx 4S）
10. MDF 声音衰减隔间（Med Associates，型号：ENV-018MD）
11. 定制的头部固定平台（图 2，参见下面的组件）：
• 1" XYZ 平移台（Thorlabs，目录号：PT3）
• 小型双轴测角仪，到旋转点的距离为 1/2"（Thorlabs，目录号：GN2）
• C 型夹（Siskiyou，目录号：CC-2）
• 立柱，直径 1/2"，长度 8"（Thorlabs，目录号：TR8）
• 用于 Ø1/2" 柱、#8 沉孔和 3/16" 六角的平行夹具（Thorlabs，目录号：RA360）
• 用于 Ø1/2" 立柱的直角夹具，3/16" 六角（Thorlabs，目录号：RA90-P5）
• 铝制面包板，6" × 12" × 1/2", 1/4"-20 tap（Thorlabs，目录号：MB612F）
• 迷你系列铝制面包板，3" × 4" × 3/8*、8-32 和 1/4"-20 高密度抽头（Thorlabs，目录号：MSB34）
• 用于头杆的定制金属适配器
• 用于头杆的 M2.5 内六角螺钉

图 2. 头部固定平台。平台的不同看法。
软件

1. 猎豹（Neuralynx，v5.7.4）
2. MATLAB（MathWorks，2021 版）
3. IDSP 软件（Inscopix，IDSP 1.80）

程序

A. GRIN 透镜和 EEG 电极的制备

1. 将钢琴线切割成 ±5 mm 长度（图 3A和3B）。
2. 借助一小块透明胶带 (3 × 5 毫米）在显微镜下。电线应与镜头平行，尖端从 GRIN 镜头延伸 200–300 μm（图 3C）。
3. 在电线上添加 1–3 μL 的 Krazy 胶水。
4. 等到 Krazy 胶干了。
5. 小心取下透明胶带。
6. 将完成的 GRIN 镜头（图 3D）保存在容器中以供手术使用。
7. 将不锈钢线和银线切成约 2 厘米长。
8. 将三根不锈钢线和两根银线焊接到一个 5 位连接器上。不锈钢线将用作 EEG 电极，而银线将用作 EMG 电极（图 3E）。
9. 在焊接区域周围涂上环氧树脂，以将所有电线固定到连接器上。
10. 将完成的 EEG 电极（图 3E）保存在容器中以供手术使用。

图 3.组装的梯度折射率 (GRIN) 透镜和 EEG 电极。 A. GRIN 透镜制备的工具和材料。 B. GRIN 透镜和锚定线。 C. 将锚线连接到 GRIN 透镜。 D. 组装的 GRIN 透镜。 E. 组装的 EEG/EMG 电极，插图：通道配置图。中间的电线用作脑电图的参考 (ref)。

B. 病毒注射

1. 使用 Sutter P-1000 将玻璃毛细管拉成针形，并将 AAV1-FLEX-GCaMP6f 病毒的 ±500 nL 加载到纳米注射器的玻璃移液器中。
2. 首先称重，然后通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪（100 和 10 毫克/千克）的混合物来麻醉小鼠。
3. 一旦鼠标被麻醉，用眼药膏润滑他们的眼睛。
4. 将动物安装到立体定位框架上（图 4A），并将头发夹在环绕手术部位的1 x 2 厘米区域。通过反馈控制的恒温加热垫保持体温正常。
5. 用聚维酮碘与 70% 的酒精交替擦拭 3 次，然后最后应用聚维酮碘，对皮肤进行消毒。然后，去除头部背面的皮肤。
6. 将头骨的前后 (AP) 和左右 (LR) 轴水平。
7. 在目标坐标上方的头骨中钻一个直径为 1 毫米的孔（VLM，前囟门 -6.9 毫米，横向 1.1 毫米，腹侧 5.6 毫米，腹侧坐标相对于软膜表面）。
8. 将纳米喷油器定位到目标坐标（图 4B）并缓慢降低喷油器，直到其尖端到达大脑背表面下方 5.6 毫米的深度（图 4C）。使用低速以尽量减少对周围脑组织的损伤。

图 4。立体定向病毒注射。 A. 病毒注射设备。 B. 将纳米注射器定位到目标大脑区域。 C. 将玻璃毛细管插入钻孔的大脑区域。

9. 以 50 nL/分钟的速度注入 200 nL 病毒。
10. 等待 5 分钟，让病毒传播。
11. 慢慢抬起喷油器，直到尖端离开大脑。

C. GRIN 透镜植入

1. 我们使用定制的不锈钢金属针（直径 400 μm，长 20 mm，尖端抛光成锋利边缘）通过将金属针插入 400 μm 以上的位置来创建促进 GRIN 透镜植入的路径注射部位并在插入后 2 分钟将其缩回（图 5A）。
2. 通过提供的适配器将 GRIN 镜头连接到 Inscopix 支架（图 5B）。将支架连接到微操作器上。
3. 以 10 μm/s 的速度将 GRIN 透镜缓慢插入金属针创建的大脑路径中，直到它达到目标坐标上方 200 μm（图 5C）。
4. 使用镜头周围的牙科水泥将 GRIN 镜头固定到头骨上（图 5D）。请注意，只应使用必要量的牙科粘固剂，以确保大部分头骨仍暴露在后续手术中。建议至少等待 20 分钟，以确保牙科粘固剂完全干燥，以实现牢固的安装稳定性。

图 5. 梯度折射率 (GRIN) 透镜的植入。 A. 插入一根金属针，为 GRIN 透镜创建路径。 B. 插入 GRIN 透镜。 C. 用黑色牙科水泥固定 GRIN 透镜。

D. EEG/EMG电极植入

1. 如果需要，修剪不锈钢和银线。去除电线末端的塑料绝缘层，长度约为 0.3 毫米。
2. 在头骨上钻三个孔（钻孔尺寸：直径 0.5 毫米）：两个孔用于在皮质顶部记录脑电图（脑电图 1：距中线 1 毫米，前囟前 1.5 毫米；脑电图 2：距中线 1 毫米，后 1.5 毫米到前囟门）。第三个孔，作为参考，应该在小脑的顶部。
3. 使用支架将电极放在大脑顶部。
4. 将 EEG 不锈钢线插入孔中，然后用骨螺钉固定。使用螺丝刀在皮质上进行 2.5–3 圈硬膜外定位（图 6A）。
5. 将两个 EMG 电极双边插入颈部肌肉组织（图 6A）。
6. 用黑色牙科水泥覆盖头骨和植入的 GRIN 透镜和 EEG/EMG 电极。
7. 用牙科水泥连接金属头柱。
8. 用硅粘合剂覆盖唯冠 GRIN 镜头的顶部（图 6B 和 6C）。
9. 将鼠标放在热垫上，直到恢复。

图 6. 脑电图电极和梯度折射率 (GRIN) 透镜的植入。 A. 在头骨上植入 EEG 线，在肌肉组织中植入 EMG 线。 B. 用硅粘合剂（绿色）覆盖 GRIN 透镜。 C. 用黑色水泥固定的植入物和头柱。

E. 用于微内窥镜钙成像的安装底板

1. 3-4 周后，将清醒的鼠标固定在定制的头部固定平台上。
2. 将底板连接到 Inscopix 微型显微内窥镜的底部。
3. 取下 GRIN 透镜上的硅盖。
4. 将显微内窥镜定位在 GRIN 镜头上方（图 7A）。
5. 调整头部的角度，直到焦平面与 GRIN 透镜的表面平行（图 7B）。
6. 通过 a) 最大化视野中的细胞数量，和 b) 使用 DF/F 模式清晰地可视化实时活动，找到活动细胞的最佳焦平面（图 7B）。
7. 用牙科水泥将底板连接到鼠标头上（图 7C）。在牙科水泥完全干燥之前不要移动显微内窥镜。
8. 取下显微内窥镜并用底板盖盖住 GRIN 镜头（图 7D）。
9. 将鼠标返回其家笼休息。

图 7. 用于显微内窥镜成像的安装底板。 A. 将底板与梯度折射率 (GRIN) 透镜对齐。 B. 将底板和显微内窥镜安装在头部固定平台上。插图：实时焦平面的屏幕截图。 C. 用黑水泥将底板固定到 GRIN 透镜上。 D. 脑电图植入物、底板和底板盖用黑色水泥固定。

F. 同时显微内窥镜钙成像和脑电图记录

1. 在录制当天，将微内窥镜和 EEG 电缆连接到头部固定平台上的鼠标（图 8A）。
2. 让鼠标在行为领域至少 90 分钟。
3. 按如下方式开始 1-2 小时的成像采集和睡眠记录。
4. 使用 nVista 3.0 硬件和 IDPS 软件 (Inscopix) 以及 475 nm LED 照明（10 Hz，0.4–1.2 mW/mm 2 ）获取钙活性。记录 EEG 和 EMG，在 0.5–500 Hz 下进行带通滤波，并使用由定制 MATLAB 程序通过 Neuralynx API 控制的 Neuralynx Digital Lynx 4S 在 1,017 Hz 下进行数字化。
5. 从 Inscopix 系统传送到 Neuralynx 系统的 TTL 信号用于同步成像和 EEG/EMG 记录之间的时间（图 8B）。
6. 重复 2–3 次成像会话以捕获唤醒和睡眠状态。

图 8。并发显微钙成像和脑电图记录。 A. 左：连接头部固定平台上的电缆。右图：在录音室中自由移动带有连接电缆的鼠标。 B. 录音设置示意图。

7. 对小鼠进行组织学灌注，以在记录后检查病毒表达和 GRIN 透镜放置（图 9）。

图 9.梯度折射率 (GRIN) 透镜的放置和 GCaMP6f 在脑干中的表达。 A. 显示病变轨迹（GRIN 透镜）和 GCaMP6f 表达的脑冠状切片的荧光图像。比例尺，0.5 毫米。 B. GRIN 透镜下大脑区域的放大视图（A 中的红色框）。比例尺，50 微米。

数据分析

A. 钙成像分析

显微内窥镜成像过程中记录的 isxd 格式视频文件首先在 IDSP 软件（Inscopix，IDSP 1.80）中进行处理。我们在 IDSP 软件中使用默认参数，但本协议中特别提到的参数除外。然后，成像数据与 EEG 数据一起在 MATLAB 中进一步处理。
1. 预处理：Inscopix nVista3 中的最大分辨率为 1,280 × 800 像素。为了加快整个数据采集和分析过程，我们的钙成像主要以 320 × 240 像素的分辨率记录。
注意：如果使用最大分辨率，成像数据应在空间上采样到原始分辨率的 1/4。如果在图像采集过程中成像数据已经被 2 分箱，则使用 2 的下采样因子。帧速率应下采样到 10 Hz。
2. 空间滤波器：为了去除低频分量（背景）和高频分量（噪声），我们使用 IDSP 中的空间滤波器功能处理图像，默认带通滤波器截止（像素 -1 ）：低0.005 , 高 0.5。
3. 运动校正：在 IDSP 中运行运动校正功能，以最大限度地减少帧之间的运动伪影。将第 100 帧设置为参考帧。
4. ROI 分割：为了检测视野中的细胞，我们首先在 IDSP 中将图像转换为 DF/F，然后使用整个成像会话中 DF/F 图像的每个像素的最大强度计算活动图。视野中的细胞相对稀疏，因此我们手动定义 ROI 以包含所有细胞（图 10A）。
5. 将原始钙信号转换为 DF/F：将每个 ROI 中的钙信号转换为 IDSP 软件中的 DF/F。每个 ROI 的 DF/F 计算为每个 bin 的钙活性与整个记录时间的平均钙活性之间的差异，除以平均值（图 10B）。
6. 通过 MATLAB 中的OASIS 快速反卷积算法（Friedrich 等人，2017 年）对钙痕迹进行反卷积以提取钙事件（图 10C）。使用定制的 MATLAB 程序（EventReviewer，可从 DOI 获得：10.5281/zenodo.6870710）排除运动引起的工件事件。

图 10. 钙数据处理。 A. 记录会话中的 ROI 分割。图像从左到右：图像会话中像素的最大强度、DF/F 指示的荧光变化的最大投影、叠加有 ROI 标签的 DF/F 图像。每个单元格的分段 ROI。 B. 运动相关后用 Z 评分 DF/F 呈现的钙迹线。 C. 使用 OASIS 算法解卷积的钙迹线（红色）。

7. 检测到的事件的综合曲线下面积 (AUC) 用于量化。
8. 处理后的数据保存为 MATLAB 数据文件。

B. 脑电数据分析

1. 使用快速傅立叶变换 (FFT) 在 5 秒的滑动窗口上进行频谱分析，在整个记录会话中按 2 秒的增量（箱）顺序移动。
2. (Peng, 2022)将大脑状态半自动分类为清醒、NREM 睡眠和 REM 睡眠状态 ADDIN EN.CITE Peng20221(Peng, 2022)

1

1

17

Yueqing PengEEG analysis tools (version 2022)

Zenodo

Zenodo

2022

10.5281/zenodo.6870666

。半自动分类由训练有素的实验者手动验证（图 11）。

图 11.EEG 数据处理。 NLXEEGgui软件截图。

3. 睡眠/清醒状态的标准是：
唤醒：脑电图去同步化和高肌电图活动；
NREM 睡眠：同步 EEG，具有高振幅、delta 频率（0.5-4 Hz）活动和低 EMG 活动；
REM 睡眠：θ 频率 (6–9 Hz) 下的高功率和低 EMG 活动。
4. 处理后的 EEG 和 EMG 数据保存为 MATLAB 数据文件。

C. 显微内窥镜成像和脑电图数据的对齐

1. 将保存的成像数据和 EEG 数据加载到 MATLAB 中。
2. 使用 EEG 数据中的 TTL 信号对齐成像数据和 EEG 数据的时间点（图 12A 和 12B）。

图 12。识别腹外侧髓质 (VLM) 中与睡眠相关的神经元活动。一个。将钙痕迹与 EEG 数据对齐。从上到下：大脑状态（灰色：清醒；橙色：NREM 睡眠；紫色：REM 睡眠）、EEG 频谱图（0-25 Hz）、EMG 振幅、代表性钙痕迹。 B. 放大的时间窗口显示 NREM 睡眠期（左）和清醒期（右）中的脑电图、肌电图和钙信号。解卷积算法检测到的钙事件以红色突出显示。

3. 为了比较不同大脑状态下的活动，我们使用了 AUC 并将其标准化为每个状态的持续时间（以分钟为单位），从而产生每分钟的相对活动。
4. 然后我们计算大脑状态之间的选择性指数为：

指数 = (AUC a - AUC b )/(AUC a + AUC b )

其中 AUC a和 AUC b分别指大脑状态 a（例如，NREM 睡眠）和 b（例如，清醒）中的 AUC 活动。指数范围从 -1 到 1，0 表示两种状态之间没有选择性。
5. 为了分析转换期间的钙活性，我们计算了 NREM 活性细胞在唤醒到 NREM 或 NREM 到唤醒转换之前和之后的 AUC 活性。每个大脑状态中的30 s窗口（例如，30 s 清醒，30 s NREM 用于唤醒到 NREM 转换）用于量化。在任一状态下少于 30 秒的过渡被排除在分析之外。总体而言，我们发现 57% 的 VLM 谷氨酸能细胞在清醒期间选择性活跃，27% 在 REM 睡眠期间和 16% 在 NREM 睡眠期间。进一步的分析表明，NREM 活跃的神经元在从清醒到 NREM 睡眠的过渡期间表现出增加的活动，而在 NREM 到清醒的过渡期间它们的活动几乎保持不变。详细结果请参考已发表的论文（Teng 等人，2022）。

致谢

我们感谢哥伦比亚大学的 Charles Zuker 分享 Inscopix 设备。我们感谢 Li Wang 在 GRIN 透镜植入手术和显微内窥镜成像数据分析方面的协助。这项工作得到了哥伦比亚大学启动基金和国家神经疾病和中风研究所 R01NS129997 资助的支持。该协议改编自以前的工作（Gong 等人，2020，Teng 等人，2022）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有程序均按照美国国立卫生研究院 (NIH) 实验室动物护理和使用指南进行，并经哥伦比亚大学动物护理和使用委员会批准。

参考

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