材料与试剂

1. 盖玻片底迷你培养皿（ MatTek ，目录号：p35G-1.0-14-c）
2. 培养皿（Greiner Bio-One，目录号：G180535A/01889）
3. 塑料过滤器（ZM Systems，产品代码：teastrain15）
4. 塑料巴斯德移液器
5. 三卡因 (MS -222)（25 ×储备液）（ PharmQ ，英国）
6. 低熔点琼脂糖（1% M/V）（Sigma-Aldrich，目录号：A9414-100G）
7. 氯化钠（NaCl）（Merck KGaA ，目录号：1.06404.5000）
8. 氯化钾 ( KCl ) (Sigma-Aldrich, P9541-500G)
9. 二水氯化钙（CaCl 2 · 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306-250G）
10. 硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M5921 500G）
11. Trizma （Tris 碱基）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503-1KG）
12. HCl（Sigma-Aldrich，目录号：H1758-500ML）
13. 质粒 UAS：EGFP， SILL：mCherry ； mfap4:EGFP
14. 鱼线：Casper、 Tg [UAS:EGFP]、 Tg [ SILL:mCherry ]、 Tg [gSAGFF202A]、 Tg [mfap4:EGFP]
15. E3 胚胎培养基 (10 × ) （见食谱）
16. Tris-HCl (1 M pH 9.0)（参见配方）
17. 三卡因 (MS-222) (25 × ) （见食谱）
18. 低熔点琼脂糖 (1% w/v) （见食谱）

设备

1. 培养箱设置为 28.5 °C
2. 细镊子
3. 光学透明聚苯乙烯 90 毫米培养皿
4. 塑料移液器
5. 微波炉
6. 100毫升玻璃瓶
7. 手工1支睫毛刷
8. 显微注射系统
9. 显微镜：
配备荧光光源和 GFP 和 RFP/Cherry 滤光片组的正置立体显微镜（例如 ZEISS Stemi SV 11）。
iLasPulse激光系统 (Roper Scientific SAS) 和温度控制系统的转盘显微镜共聚焦显微镜 (ZEISS) 。

程序

A. 准备斑马鱼幼虫（ Tg [gSAGFF202A:UAS-EGFP; Tg [SILL- mCherry ]线用于成像雪旺细胞和传入神经元，或Tg [mfap4:EGFP; Tg [ SILL:mCherry ]线用于成像巨噬细胞和传入神经元）

1. 收集胚胎并将它们保存在 28.5 °C 的培养箱中，以便标准发育到受精后 5-6 天 ( dpf ) 幼虫阶段。胚胎应保存在 90 毫米培养皿中。为了获得最佳存活率，每道菜应保留约 50 个胚胎。
2. 在 4 dpf时，使用荧光立体显微镜（图 1 和 2）筛选标本。
在雪旺细胞或巨噬细胞中表达外侧神经元中的mCherry （红色）和 EGFP（绿色）的阳性幼虫。
注意：一次性使用的塑料材料可以清洗并重复使用。这包括培养皿和移液器。

图 1.协议的主要工具。 A.照片举例说明将装有鸡蛋的塑料培养皿放入培养箱中。 B.标准培养皿、尖端附有毛圈的玻璃吸管、镊子和塑料移液管的照片。 C.带有典型显微注射装置的立体显微镜示例。 D.用于长期成像的倒置旋转圆盘显微镜的照片。

图 2. 收集鸡蛋和饲养标本的程序。 A.繁殖缸的照片，底部有一个网格，可以让鱼卵落到成年鱼（否则它们可能会吃掉它们）够不到的地方，还有一个培养皿和一个鱼卵收集过滤器。 B.取出装有繁殖成虫的内容器后，将养殖缸中装有卵的水通过滤网轻轻倒出以收集卵。 C.鸡蛋用设施系统中的清水轻轻而短暂地清洗。 D.然后将过滤器从内向下放置到培养皿的内部（底部）部分，并使用塑料瓶轻轻地用水将鸡蛋冲洗到该培养皿中。 E. 鸡蛋现在可以在盘子里看到了。 F.然后可以将装有鸡蛋的盘子移至荧光立体显微镜进行筛选和清洁。

B. 马赛克标记，一种稳定的转基因品系的替代品，用于标记选定的神经元和雪旺细胞或巨噬细胞群

1. Tg [gSAGFF202A]驱动线为雪旺细胞准备 Casper 斑马鱼卵。
2. 准备用于注射的质粒。在装入毛细管进行注射之前，将UAS：EGFP 和SILL ：mCherry质粒混合 20 ng/ μL 。
3. 巨噬细胞和神经元，混合 mfap4：EGFP 和SILL：mCherry构造用于注射（每个质粒10 ng/ μL ）。
4. 将大约 1–2 nL质粒注入单细胞阶段胚胎。
5. dpf筛选已发育为形态正常幼虫的注射卵，并在荧光立体显微镜下挑选 EGFP 和mCherry双阳性。然后，将阳性幼虫转移到新的板中，以生长到所需阶段（图 2）。

C. 激光介导的神经横断和成像

1. 麻醉和安装幼虫
× MS-222 溶液（0.016% w/v）麻醉幼虫。 E3 胚胎培养基制备为储备溶液 (10 × )，从中新鲜制备工作溶液 (1 × )（参见配方 1）。将一大滴（约 100 μ L ）1% 低熔点琼脂糖（熔点不超过 37 °C）放在盖玻片底盘上。使用尽可能少的水的移液器将麻醉的幼虫移入琼脂糖滴中，以防止琼脂糖稀释过多。使用粘在玻璃吸管尖端的毛圈，轻轻地将幼虫推到盘子底部，使其接触玻璃。然后，根据需要定向和定位样本。通常，由此产生的 ~1% 低熔点琼脂糖将为该过程留出足够的时间（30-45 秒）。通过练习，几乎可以同时安装多达三条鱼。
在室温下 5 分钟后，用含有 MS-222 的 E3 胚胎培养基覆盖现在凝固的琼脂糖。
移动盘子时要格外小心，因为如果摇动，琼脂糖块可能会从玻璃上脱落，使准备工作无法使用。
注意：我们注意到当超过三条鱼被安装在同一个盘子上时，成像过程中的存活率显着下降。
2. 将装有鱼的盘子放在适合显微镜载物台的支架上。将加热系统置于 28.5 °C（或特定实验的理想温度）。使用 20 ×物镜通过观察红色或绿色荧光来调整盘子的位置。
3. 使用浸水 63 ×物镜用激光束横断轴突（见注释）。重要的是要避免油浸物镜，因为它们会阻止对安装在同一盘子上的多条鱼重复该过程，并且还会使以后使用较低放大倍率物镜的成像显着复杂化。
4. 对于横切，我们使用由 VISION 软件控制的iLas -Pulse 紫外激光系统。每个脉冲400 ps /2.5 μ J并调整到 27 mW功率的 350 nm 激光用于神经横断。
5. 使用 VISION 软件，绘制一条线或一个矩形来标记激光束瞄准的区域。这可以保存在系统中以供后续等效样本使用。要完全切断轴突，应反复施加激光脉冲，直到矩形区域出现明显间隙（见注释）。我们通常将脉冲设置为 0.05毫秒，每次鼠标点击点击 3 次。如果需要产生更大的损坏，请将线/矩形移动到下一个位置以进行新的横断面。我们通常在同一神经的多个横断面之间使用 40 µm 的距离（图 5）。
6. 设置活体成像参数
确保轴突完全切断后，选择 40 × （空气）或 63 × （水）目标进行实时成像。将感兴趣的区域放在视野的中心，并将焦点放在感兴趣的平面上。当 Z-stacks 的参数固定时，一个堆栈的间隔可以设置为 0.8–1.3 μ m 。成像间隔设置为 5-10 分钟。
7. 如果将执行长期成像（超过 1 小时），请将 63 ×水浸物镜替换为可以容忍不会蒸发的浸入介质的等效物镜。鉴于高级低熔点琼脂糖的折射率 (RI) 为 1.33（类似于水），而硼硅酸盐玻璃的 RI 为 1.47，因此使用 RI 为 1.47 的 100% 甘油是最佳选择。

D. 图像量化

1. 实时成像原始数据发送到斐济 ( https://imagej.net/software/fiji/ ) 进行分析。
2. 使用插件“跟踪”来分析神经修复的动力学和雪旺细胞或巨噬细胞的行为。打开插件 - 跟踪 - 手动跟踪。
3. 选择起点处感兴趣的单元格，以便在整个时间序列过程中进行跟踪。这可以从单个焦平面或整个或部分 Z 堆栈的最大投影来完成。
4. 根据我们从跟踪中获得的信息，我们可以得出关于有多少雪旺细胞被吸引到受损部位以及这些细胞停留了多长时间的结论（ Tian 等人，2020b；图 3-5 ，视频 1 和 2 ）。

视频显微镜示例。 A – F.来自斑马鱼幼体躯干中巨噬细胞（绿色）和外侧感觉神经（红色）的高分辨率延时记录的静止图像。在用激光切断神经后，可以看到单个巨噬细胞立即向神经迁移。下面是第二个巨噬细胞，它从不与神经接触。随着时间的推移，巨噬细胞沿着神经移动，监视损伤（这可以看作是面板左侧的神经中断（ C 和 D ）。每个面板下方的图（虚线）描述了视频显微成像过程中该单个巨噬细胞的二维形状变化。比例尺为 50 μ m 。

图4.轴突和雪旺细胞的整体视频显微镜示例。 A – C.横断后雪旺细胞运动（绿色）和外侧传入神经（红色）再生的高分辨率延时记录的荧光图像。 A显示了两个荧光通道的合并，标记了感觉神经（红色）和雪旺细胞（绿色）。各自的通道显示在B和C中。 D显示了移动的雪旺细胞的轨迹。 t1、t2、t3、t4、t5、t6 表示从延时中提取的不同时间点。 Dt6 。它是 t6 时雪旺细胞整个轨迹的放大图。

图 5. 激光介导的神经横断示例。 A-1 和 A-2 。横断面的屏幕截图，分别是激光介导伤害之前和之后。图像显示在此过程中使用的 VISION 软件设置，以及神经轴突内的目标区域（黄色矩形）。 A-1.1和A2.1 。旋转圆盘图像呈现横断前后的豆激光（黄色矩形）靶向的神经轴突。

视频 1.神经元和巨噬细胞的活体视频显微镜

视频 2.神经元和雪旺细胞的活体视频显微镜

笔记

1. 在注射前一天准备新鲜质粒并检查 DNA 的质量。首先需要使用生物工具软件（例如， snapgene ， https://www.snapgene.com/ ）分析其正确的核苷酸序列数据来检查质粒 DNA 的质量。从新鲜的过夜培养的转化的 DH5alpha 中提取质粒。应使用 Nanodrop 确认质粒的质量。 260/280 的范围是 1.8–2.0。如果未发现降解迹象，冷藏保存的相同质粒制剂可连续使用 1-2 天。
2. 将低熔点琼脂糖保存在小玻璃 Erlenmeyer 中，部分浸没在 40–42 °C 的水浴中。
3. 将激光束对准轴突。在暴露于激光后 10 至 30 分钟之间，通过查看沿轴突的间隙和外周轴突降解（珍珠化）的明显迹象，确保完全横断。
4. 对于长期实时成像，激光功率必须调整到 10 mW左右。更高的功率或更频繁的成像间隔会导致组织损伤并降低鱼类的存活率。
5. 成像后，检查鱼的状况。仅应使用没有身体受伤迹象且从琼脂糖中释放后可以游泳的健康鱼的数据。当然，如果实验本身必须导致行为功能障碍，例如横断脊髓，则这不适用。
6. 如果图像在成像平面内移动，请使用斐济的模板匹配插件重新对齐图像。

食谱

1. E3胚胎培养基（10 × ）
50 毫米氯化钠
1.7 毫米氯化钾
3.3 毫米氯化钙2 · 2H 2 O
3.3 mM MgSO 4 ，溶于 1 L 去离子水

2. Tris-HCl (1 M pH 9.0)
12.1 g Tris 碱溶解在 80 mL 去离子水中。用 HCl 将 pH 值调整为 7.0，然后将最终体积调整为 100 mL。

3. 三卡因 (MS-222) (25 × )
480 mL 去离子水中的 2 g MS-222；使用 1 M Tris-HCl (pH 9.0) 将 pH 值调整至 7.0，然后将最终体积调整至 500 mL。储存在 4°C。

4. 低熔点琼脂糖 (1% w/v)
30 mg 低熔点琼脂糖通过微波炉加热溶解在 30 mL 1 × E3 培养基中。保持在 40 – 42 °C 的水浴中。

致谢

这项工作得到亥姆霍兹协会和 BMBF 赠款 01GQ1904 的支持。
该协议改编自我们实验室以前的工作（ Xiao 等人，2015a 和 2015b；Lozano-Ortega 等人，2018 年；Tian 和 Lopez- Schier ，2020 年；Tian 等人，2020 年；Tian 等人，2020 年； Asgharsharghi等人，2021 年）。

利益争夺

HL-S 是Sensorion （法国）的科学顾问和付费顾问。该公司在这项研究中没有任何作用。本工作中引用的任何供应商都不存在竞争利益。

伦理

程序是根据 Helmholtz Zentrum München 的动物实验伦理委员会、德国动物福利法案Tierschutzgesetz §11、Abs 进行的。 1，号码。 1， Haltungserlaubnis ，欧盟动物福利，协议编号 Gz.:55.2-1-54-2532-202-2014 和 Gz.:55.2-2532.Vet_02-17-187 来自德国“ Regierung von Oberbayern ” .

参考

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Asgharsharghi , A.、Tian, W.、 Haehnel -Taguchi, M. 和 López- Schier , H. (2021)。 Sarm1 对于斑马鱼的机械感觉-运动转换是可有可无的。 MicroPubl Biol 。 DOI：10.17912/micropub.biology.000369
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