材料和试剂

对照和实验细胞（HEK293T和HEK293T-sr39TK）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life technologies，目录号：11965-084）
（Moravek Biochemicals，La Brea，CA，USA）的3 H - 比昔洛韦（比活性14.9 ci mmol ^-1）。
氢氧化钠（NaOH）（0.1N）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（Life technologies，目录号：10010-056）
玻璃闪烁瓶
Cytoscint闪烁液（Acros Organics，Geel，Belgium）
细胞培养板（Greiner Bio-One，USA）
Bradford蛋白测定试剂（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
洗涤溶液（冰冷PBS）（pH 7.4）

设备

37℃5％CO 2细胞培养箱（Themo Fisher Scientific，型号：Napco 8000）
闪烁计数器（Beckman Coulter，Brea，CA）
Shaker（Boekel scientific，型号：260350）
放射性化学罩（Hamilton，Two Rivers，WI）
移液管（Gilson，Middleton，WI）
处置（根据环境和健康安全规定）
分光光度计（Varian Inc，型号：Varian Cary 50）

程序

哺乳动物 HEK293T和HEK293T细胞稳定表达sr39-HSV1-TK （HEK293T-sr39TK）应在60- 80％的汇合度在12孔中接种培养板（150,000个细胞/孔，在1ml DMEM中）。 37℃孵育 5％CO 2小时，持续24小时
在初始铺板后24小时，除去培养基，并加入0.5μl的3 H - 喷昔洛韦/孔（0.5mCi/ml的8-羟色胺 - 比昔洛韦;比活性 14.9 ci mmol ^-1）
在37℃孵育3小时。保持样品之间的孵育时间一致。
保持相同数量的相同细胞（HEK293T）不表达HSV1-TK作为对照
后 3小时的孵育小心地移除培养基而不打扰细胞，并用0.5ml冰冷的PBS洗涤板两次。游泳池将来自相应孔的介质和洗涤溶液测量剩余总活动
向每个孔中加入0.5ml的0.1N NaOH，并在室温下在振荡器中保持10分钟以裂解细胞。
转让 20μl均质细胞裂解液，测量总蛋白浓度通过使用Bradford蛋白测定试剂。简而言之，对每20微升细胞裂解物加入1ml 1x Bradford蛋白测定试剂并读取在室温下孵育5分钟后在595nm（A <595）的吸光度在分光光度计中。使用标准准备的标准图（BSA）稀释在0.1N NaOH中，计算存在的总蛋白 0.5ml细胞裂解物。
转移剩余的细胞裂解液（480μl）至闪烁瓶和5ml可生物降解的闪烁流体（Cytoscint流体）。缺乏暴露于^{3的H-Penciclovir的HSV1-TK表达的细胞作为阴性对照。}
总数每个样品的剩余活性应使用480μl测量来自合并的培养基和洗涤溶液的溶液，以及从稀释在480μl培养基中的0.5μl的3 H-泛昔洛韦测量。
测量闪烁计数器中不同样品的放射性取平均读数/min读5分钟。归一化结果与蛋白质浓度和与总活动有关
结果应表示为每毫克蛋白质/总计数的 H-PCV的转化百分比，或者表示为 H -PCV，以每毫克蛋白质的摩尔数/总活性（放射性在细胞内/[放射性保持在培养基+放射性单元格]）。

致谢

我们感谢斯坦福大学放射学系主任Sanjiv Sam Gambhir博士为进行这项研究提供有用的支持和便利。我们感谢斯坦福大学放射科的资金支持（R. Paulmurguan），并感谢斯坦福的加那利中心提供的设施。我们还感谢NIH-NCI RO1CA161091（R. Paulmurugan）的部分资助支持。

参考文献

Sekar，T.V.，Foygel，K.，Willmann，J.K.and Paulmurugan，R。（2013）。双重治疗性报告基因融合用于增强癌症基因治疗和成像。 Gene Ther 20（5）：529-537。