材料和试剂

对氨基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5669）
d-Biotin（Sigma-Aldrich，目录号：B4501）
D-泛酸钙（Sigma-Aldrich，目录号：21210）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R4500）
盐酸吡哆醇（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
KCl
MgSO 4。 7H 2 O
KH ₂ PO ₄
lt; sub> 2 H< sub> 4< sub> 7< sub>
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O
FeO 4 P ^。 4H 2 O
MnSO 4 ^。 H O
Na 2 MoO 4 sub 。 2H O
ZnSO 4 。 7H O
NaOH
吐温80（Sigma-Aldrich，目录号：P1754）
放射性标记的底物
例如22.8Ci/mmol（Moravek Biochemicals，目录号：MT537）[vi] [8-] 3 H] - 黄嘌呤，
[2,8-三H] - 次黄嘌呤，27.7Ci/mmol（Moravek Biochemicals，目录号：MT700）
[5-顺-3 H] - 尿嘧啶，23Ci/mmol（Moravek Biochemicals，目录号：MT610）
非放射性标记的底物
例如黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：X7375）
次黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：H9377）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：U0750）
Toluol（AppliChem GmbH，目录号：A3393）
Triton X-100
2,5-二苯基恶唑（PPO）（Sigma-Aldrich，目录号：D4630）
1,4-双（5-苯基恶唑-2-基）苯（POPOP）（Sigma-Aldrich，目录号：P3754）
完成媒体（CM）（参见配方）
最小媒体（MM）（请参阅配方）
闪烁液（见配方）

设备

培养皿
Neubauer计数室幻灯片
小铲
轨道振荡培养箱
37℃的培养箱
尼龙网过滤器60μm（Merck KGaA，目录号：NY60）
50ml Falcon管
1.5 ml Centifuge管
离心机
涡流
闪烁瓶
闪烁计数器
热块
磁力搅拌器
磁力杆
pH计
巴斯德移液器

软件

GraphPad Prism软件（Amillis等人，2004）

程序

用感兴趣的菌株接种CM的培养皿，并使其在37℃达到完全生长96小时。
使用刮刀在含有2ml的0.01％v/v吐温80的水的50ml Falcon管中转移四分之一完全生长的菌落（〜4cm）。该量通常对应于10 8个分生孢子。可以使用Neubauer计数室载玻片或通过在标准连续稀释和在CM上铺板后测量活的分生孢子来估计分生孢子的准确量。
涡旋好的样品分离分生孢子。
接种含有补充有合适的碳（C）（例如葡萄糖1％w/v）和氮气（N）（例如，NaNO 3）的25ml MM的100ml烧瓶， 3×10mM）来源和必需的维生素（例如d-生物素0.02μg/ml），通过尼龙网过滤器60μM过滤分生孢子。（可在 www.fgsc.net 上找到 A.nidulans 菌株的所有必需的补充剂和浓度。）
孵育3-5小时，在37℃，以140 rpm摇动，发芽的分生孢子到达即将在胚芽管出现之前的阶段。孵育的时间和温度可以根据表达谱改变的感兴趣的转运蛋白和该菌株的营养缺陷需求。在我们实验室研究的所有转运蛋白（例如嘌呤/嘧啶转运蛋白UapA，UapC，AzgA，FcyB，FurD）在胚芽管出现前达到最大表达，由未知的发育控制驱动，与其存在或不存在无关底物或其他生理条件（Amillis等人，2004; Vlanti和Diallinas，2008; Amillis等人，2007）。在菌丝体中，转运蛋白的表达非常依赖于生理条件（例如底物诱导或/和N或C分解代谢物抑制）。
当分生孢子萌发时，制备放射性标记的（通常为3 H或14 C）感兴趣的底物在水或MM中的储备溶液，使得对于每次测定，25μl的储备液使用。
通过将培养物在50ml Falcon管中在3,000xg，室温下离心5分钟收集分生孢子。
弃去上清液并将沉淀重悬在5ml标准MM中。
分配75微升等分试样在eppendorf管中的孢子，并使用所需的多。分生孢子悬浮液可以在4℃保持至少24小时，而不丧失转运活性。
在37℃下在加热块中孵育分生孢子等分试样5分钟，然后加入放射性标记的底物。
加入放射性标记的底物不同的时间。大多数转运蛋白显示线性增加的活动至少1分钟。为了测量确定 k m 和表观 max 值，必须通过时间过程实验为每个转运蛋白确定适当的孵育时间。对于稳态底物积累，使用5分钟的时间段。通常的时间点为10,20,30,60和120秒。对于每个时间点，一式三份进行测量。用于与放射性标记的底物孵育的温度取决于在每个实验中研究的转运蛋白并且保持实验，大多数实验的温度为37℃。通过加入与放射性标记的底物相关的等体积（100μl）100-1000倍过量浓度的冷的未标记底物，并在冰桶中直接转移测定/eppendorf管，停止转运反应。
在4℃下，将样品以11,000xg离心3分钟
通过使用巴斯德吸管在真空下抽吸去除上清液。重要的是清除所有的上清液，而不损失任何细胞
用1ml冰冷的MM洗涤细胞沉淀一次，并以11,000xg离心3分钟。如前所述除去上清液。
将沉淀重悬在1ml闪烁液中，将eppendorf管置于闪烁瓶中。使用闪烁计数器来测量细胞中的底物积累。
运输测量的分析使用GraphPad Prism软件进行。基于所用放射性底物的浓度和比活性，应将放射性计数转化为底物浓度/分钟/分生孢子。
对于转运体的测定，应该使用不同的底物浓度，固定的孵育时间，这通常是1分钟。使用的浓度范围首先根据经验确定。在最后的实验中，应当使用低于和高于表观上的值的至少三个浓度点。对于每个浓度点，测量一式三份
使用固定的放射性标记的底物和递增浓度的非放射性标记的底物的混合物制备储备溶液，使得对于每次测定将使用25μl的储备液。
终止运输检测并进行上述测量
对于转运器的 K _i确定，该方法与 K _{> m 测定，但是使用固定的放射性标记底物和递增浓度的非放射性标记的推定抑制剂的混合物制备储备溶液。对于每个浓度点，测量一式三份}
使用基于用于酶动力学的Michaelis-Menten方程的典型的Lineweaver-Burk图分析，来测定酶的动力学 = sub> [S] /（ K _m + [S]），其中反应速率）， m 是Michaelis-Menten常数，是最大反应速度，[S]是底物浓度。 Lineweaver-Burk图描绘了先前等式的线性表达式，其转换为以下形式：1/V =（ K _m/ sub> max 。通过该实验获得的数据对应于每种底物浓度的转运体的表观速度。通过使用公式估计IC 50值（用于获得50％抑制的抑制剂浓度）确定给定底物/抑制剂的Ki 测量值。 sub> i i = IC ₅₀/1 + [S]/其中[S]是使用的放射性标记底物的固定浓度。分析数据的另一种方式是通过使用GraphPad Prism软件通过非线性回归曲线拟合和S形剂量反应分析。 IC ₅₀值对应于运输商的 K _m/i。分析结果的质量因子是：R ²其应该> 0.99和Hill系数，对于具有一个结合位点的运输者，该系数应该约为-1
所描述的方法可以修改和适用于产生无性孢子的大多数丝状真菌，例如。烟曲霉。（Goudela et al。，2008）

食谱

完成媒体（1 L）
来自100x储备溶液的维生素溶液* 10ml
盐溶液从50x储备溶液** 20 ml
葡萄糖10克
蛋白胨2 g
酵母提取物1 g
Cas氨基酸1 g
琼脂10克
加水至1 L最终体积
用NaOH
调节pH至6.8 高压灭菌20分钟

*维生素储液
对氨基苯甲酸20mg
d生物素1mg
D-泛酸钙50mg
核黄素50 mg
吡哆醇50mg
加水至1 L最终体积

**盐储液
KCl 26 g
MgSO 4。 7H 2 O 26g

。

微量元素20x储备溶液*** 50 ml
加水至1 L最终体积

***微量元素储备液
Na 2 O 2 b 4 O 7 sub 10 H 2 O 40mg
> CuSO 4 ^。 5H O 400 mg

P 4H 2 714mg
lt; sub> 4< sup> H 728mg
800 mg
ZnSO 4 。 7H 2 O 8 mg
加水至1 L最终体积
最小媒体
盐溶液从50x储备溶液* 20ml
加水至1 L最终体积
用NaOH
调节pH至6.8 高压灭菌20分钟
闪烁液（1 L）
Toluol 666 ml
PPO 2.66克
POPOP 0.0066克
在RT下搅拌2小时
加入Triton-X 100 333 ml
过夜搅拌

致谢

该协议改编自以下出版物：Diallinas等人（1995）; Koukaki等人（2005）; Meintanis等人（2000）; Tazebay等人（1997）。英国在GD的实验室工作，由欧盟（欧洲社会基金ESF）和希腊国家基金通过国家战略参考框架（NSRF）的"教育和终身学习"运作计划 - 研究资助计划：Thales，通过欧洲社会基金投资知识社会。

参考文献

Amillis，S.，Cecchetto，G.，Sophianopoulou，V.，Koukaki，M.，Scazzocchio，C.and Diallinas，G。（2004）。嘌呤转运蛋白基因的转录在构巢曲霉的各向同性生长期期间被激活 conidia。 Mol Microbiol 52（1）：205-216。
Amillis，S.，Hamari，Z.，Roumelioti，K.，Scazzocchio，C。和Diallinas，G。（2007）。表达调节和尿嘧啶转运蛋白在构巢曲霉中的底物相互作用的动力学模拟 em> 。 Mol Membr Biol 24（3）：206-214
Diallinas，G.，Gorfinkiel，L.，Arst，H.N.，Jr.，Cecchetto，G。和Scazzocchio，C。（1995）。编码基因的基因的遗传和分子表征广泛的特异性嘌呤通透酶揭示了在原核生物和真核生物中保守的转运蛋白的新家族 270（15）：8610-8622。 br />
Goudela，S.，Reichard，U.，Amillis，S.and Diallinas，G。（2008）。烟曲霉中主要嘌呤转运蛋白的表征和动力学。真菌基因Biol 45（4）：459-472。
用于Windows的GraphPad Prism版本5.00，GraphPad Software，San Diego California USA。 www.graphpad.com 。
Koukaki，M.，Vlanti，A.，Goudela，S.，Pantazopoulou，A.，Gioule，H.，Tournaviti，S.and Diallinas，G。（2005）。 UapA中的核碱基 - 抗坏血酸转运蛋白（NAT）特征基序定义了嘌呤易位途径的功能。 J Mol Biol 350（3）：499-513
Meintanis，C.，Karagouni，A.D.and Diallinas，G。（2000）。氨基酸残基N450和Q449对于UapA的吸收能力和特异性至关重要，UapA是一种核碱基 - 抗坏血酸转运蛋白家族。 Mol Membr Biol 17（1）：47-57。
Tazebay，U.H.，Sophianopoulou，V.，Scazzocchio，C。和Diallinas，G。（1997）。编码曲霉菌的主要脯氨酸转运蛋白的基因构巢曲霉在分生孢子萌发期间和在脯氨酸诱导和氨基酸饥饿反应中上调。 Mol Microbiol 24（1）：105-117。
Vlanti，A。和Diallinas，G。（2008）。构巢曲霉 FcyB胞嘧啶 - 嘌呤清除剂在萌发期间高度表达，在生殖室中并通过内吞作用下调。 Mol Microbiol 68（4）：959-977。