材料和试剂

P0和P3 C57BL/6垫料（C57BL/6）（JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
ICR养殖水坝[Crl：CD-1（ICR），Charles River，菌株编号：022]

设备

鼠标小狗WBP（数据科学国际，Buxco系统;图1）与：

Max II放大器（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，Buxco，型号：MAX2275）
记录室（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，Buxco，型号：PLY4241），〜30±1°C，内置加热垫，

图1. Buxco鼠标全身体积描记器的修改设置
流量传感器（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，Buxco，型号：TRD5700）
小型啮齿动物偏流供应（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，Buxco，型号：B04-BFL0100，用于小狗）
延长管（长度：14厘米;内/外径：2.6/3毫米）
金属过滤器（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，Buxco，型号：HDW1514）

杂交炉（GE Healthcare，型号：RPN2511E）

软件

FinePointe软件（Buxco系统，DSI）

程序

注意：

为了提高检测灵敏度，我们拆卸了Halcyon气垫车，并将金属过滤器的数量从4个增加到7个，这两个通道分别连接到动物和参考室（图2A和2B）。通过这样做，我们增加了由微妙的新生儿呼吸引起的压力差异变化。然而，这种修改也改变了一些呼吸参数的值（图6）。尽管我们在解决灵敏度问题之前和之后联系了Buxco技术服务，但我们无法获得任何帮助，以正确调整仪器设置以维持原始值。
上述改变提高了检测灵敏度，也增加了通常用于体积描记器的Buxco偏流泵的背景信号，因此必须去除偏流装置，以减少空气源的噪音。 >
我们将弯曲的延长管连接到Halcyon pneumotach，以避免任何来自上层环境的干扰气流（如用户呼吸）（图2C）。

图2. Halcyon气冲击和记录室的修改.A。两个气动通道中的金属过滤器数量增加到7. B.在Halcyon气动装置中装载金属过滤器; C.组装到记录室上的改进型气动马达与面向下的延长管（箭头）连接，以避免任何气流扰动。

将P0 C57BL/6垃圾转移到ICR养殖大坝，直到记录。
将一杯水在烘箱中在34±1℃下孵育，以加湿。检索所有P1幼仔，并保持他们在加湿的烤箱中保持温暖至少20分钟，然后进行体积描记录。
按照FinePointe向导中的说明来校准设备（图3）。

单击校准图标（图3A）。

图3.室的校准。 A-H。按照FinePointe向导中的说明进行操作，包括调零放大器，平衡传感器并将空气注入到室内。

单击扳手图标以校准每个室（图3B）。

将增益级别设置为3.5（图3C）。

将放大器切换到直流位置（DC）。

转动平衡螺丝，直到图表读取0伏（图3D和3E）。

在室内注入200μl空气（图3F）。

确保注入的气流完全包含在突出显示的紫色区域，红色光标处于0（图3G）。

将放大器切换到交流电源位置，然后按下"下一个"按钮进行重新调零。

点击"完成"按钮完成校准（图3H）。
轻轻地将P1小狗放在动物室内。
关闭房间，让小狗习惯1分钟。
开始测量记录每只小狗三个三分钟的会话。为避免在不存在偏流气源的情况下CO 2 2和湿度的积累，在每个会话结束时打开腔室1分钟。
从动物室中取出小狗。
保存记录轨迹（图4）并进行数据分析（图5）

图4.来自P0，P1和P3新生小鼠的代表性呼吸痕迹.A和B.使用原始和改良记录室的P3小鼠呼吸流量。 C和D.使用原始和改进的记录室的P0小鼠的呼吸流量。箭头表示峰值流量的吸气峰值> 0.01毫升/秒。 E.使用改良记录室对P1 CPEB2敲除小鼠进行呼吸流量测定。括号表示呼吸暂停。

数据分析

因为呼吸运动在非麻醉的小狗中非侵入性地测量，所以仅分析从休息状态下从小狗记录的信号。然而，FinePointe软件（Buxco系统，DSI）计算所有节律信号，包括在运动过程中由身体运动或呼吸产生的信号。因此，为了分析来自静息呼吸的实际信号，我们从表中选择了所有呼吸参数的原始数据（图5，箭头），并将其复制并粘贴到Excel电子表格中。我们还仔细观察并标记了在体积描记录期间小狗不休息的时间，以手动排除由于身体运动引起的这些有问题的数据点。平均静息呼吸活动数据得出呼吸频率，潮气量，吸气时间，呼气时间，吸气峰值峰值和呼气峰值流量。通过对峰值流量吸气峰数进行计数手动分析P0小鼠的呼吸频率。 0.01ml/sec（图4D，箭头）。当呼吸暂停比前一次呼吸持续时间长两倍时，定义呼吸暂停发作（图4E），手动分时针对每分钟和持续时间发生的次数进行评分。

图5.从趋势数据表中提取所有呼吸参数的原始数据。将所选数据点复制并粘贴到Excel电子表格中。

笔记

如果遗传修饰的小鼠在出生后不立即死亡，我们建议将小狗转移到ICR大坝18-24小时，直到测量为止，因为C57BL/6水坝具有差的母体本能，并且不能具有呼吸缺陷的后排小狗。在我们修改的WBP中，P1小鼠比P0小鼠显示出更多的节奏和更强的呼吸运动，因此从其记录轨迹分析呼吸参数更可靠。
由于P0小鼠的微妙呼吸信号，我们仅通过手动计数吸气峰数量来分析呼吸频率> 0.01毫升/秒（图4D，箭头）
通过使用改良的WBP扩增潮气量，峰值吸气流量（PIF）和呼气峰值流量（PEF）的值，因此在对照组和实验组之间进行比较。相比之下，呼吸频率，吸气时间（Ti）和呼气时间（Te）的值不受影响（图6）。

图6.使用原始和修改的记录室在P3记录的小鼠中呼吸参数的比较。 Ti，吸气时间; Te，呼气时间PIF，吸气峰值流量; PEF，呼气峰值流量。数据为平均值±SEM（n = 3）。 * 0.05，** P < 0.01，Student's t -test。
灯在我们的鼠标室上午8点到晚上8点。我们通常在10 AM到5 PM之间进行呼吸记录。根据我们的经验，新生儿小鼠在下午5点之后进行记录时可能会更加活跃，这可能是由于昼夜节律。

致谢

这项工作得到了台湾科技部（105-2321-B-001-044）的支持。

参考

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Lai，YT，Su，CK，Jiang，ST，Chang，YJ，Lai，AC and Huang，YS（2016）。迷走神经背侧运动细胞核中CPEB2限制性胆碱乙酰转移酶表达缺乏导致过度活化的副交感神经信号相关性支气管收缩。 Neurosci 36（50）：12661-12676。
Nsegbe，E.，Wallen-Mackenzie，A.，Dauger，S.，Roux，JC，Shvarev，Y.，Lagercrantz，H.，Perlmann，T.and Herlenius，E。（2004）。 Nurr1突变小鼠先天性通气不足和缺氧缺氧反应。 J Physiol 556（Pt 1）：43-59。
Turgeon，B.和Meloche，S。（2009）。解释小鼠突变体中的新生儿致死表型：对基因功能和人类疾病的了解生物化学版89（1）：1-26。