材料和试剂

聚-L-赖氨酸预涂组织培养处理的96孔板（Corning，目录号：356516）
深96孔无菌聚丙烯板（Corning，Axygen ，目录号：391-04-062）
提示（0.2μl至1 ml）（VWR）
血清学移液器，单独包裹（从5ml到50ml）（Costar）
消火抛光巴斯德吸管用棉塞（内部制造）
组织培养处理10厘米盘（康宁，目录号：430167）
50ml锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352097）
15ml锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352098）
1.7ml微量离心管（Genesee Scientific，目录号：22-282）
1 ml无菌注射器（BD，目录号：309659）
粘合板密封（VWR，目录号：60941-126）
怀孕野生型小鼠（JACKSON LABORATORY）
胆固醇结合的hsiRNA（内部设计和生产）
冰冷块（Koolit ®制冷剂）（Cold Chain Technologies，目录号：305F）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，目录号：21-031-CV）
200型乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
DMEM细胞培养基（Mediatech，目录号：10-013-CV）
Hibernate E（BrainBits，目录号：HE）
DNase I（Worthington，目录号：54M15168）
木瓜蛋白酶（Worthington，目录号：54N15251）
台盼蓝染色溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15250061）
QuantiGene 2.0测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：QS0011）
QuantiGene 2.0探针组（按基因变化）
裂解混合物（Thermo Fisher Scientific，Affymetrix TM，目录号：13228）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Affymetrix TM，目录号：QS0103）
Neurobasal medium NbActiv4（BrainBits，catalog number：Nb4-500）
胎牛血清（FBS）（Mediatech，目录号：35-010-CV）
补充有GS21 补充剂（50x）（Sigma-Aldrich，目录号：G0800）的NeuralQ TM（Sigma-Aldrich，目录号：N3100），0.5mM二肽Ala -Gln（Sigma-Aldrich，目录号：A8185）
5'UTP（Sigma-Aldrich，目录号：U6625）
5'FdU（Sigma-Aldrich，目录号：F3503）
木瓜蛋白酶/ DNase溶液（参见食谱）
电镀介质（见配方）
饲养介质（见食谱）

设备

0.5微升至1毫升的微量移液器（Labnet International，型号：BioPette Plus）
10通道至300μl的多通道（8或12通道）微量移液管（Eppendorf，型号：Research ®）
组织培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell TM 150i）
连接真空的生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：1300系列II类，A2型）
本生灯
发芽子500（Braintree Scientific，型号：Germinator 500，目录号：GER 5287-120V）
37°C的水浴（Fisher Scientific，型号：2332型）
4°C冰箱
Microscissors（Fine Science Tools，目录号：14060-10和14002-12）
一套两个镊子（精细科学工具，目录号：11251-30）
解剖显微镜（Motic，型号：SMZ168系列）
吸管（Drummond Scientific，型号：Portable Pipet-Aid ® XP）
组织培养相差倒置显微镜（Motic，型号：AE2000）
血细胞计数器（0.1000-0.0025mm 2 ）（Neubauer）
μPlate载体（Beckman Coulter，型号：SX4750）
自动洗板机（BioTek Instruments，型号：ELx405）
冷藏式摆动转子台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
Allegra X-15R转子（Beckman Coulter，型号：SX4750）
读卡器分光光度计（Tecan Trading，型号：Infinite M1000 Pro）

软件

Microsoft Office Excel（Microsoft Office）
GraphPad Prism 7软件（GraphPad Software）

程序

组织培养的聚-L-赖氨酸包被96孔板
1. 为了涂覆平板，使用多通道微量移液管将100μl的0.01％聚-L-赖氨酸转移到每个孔中。
2. 在组织培养箱37℃孵育过夜。
3. 第二天，在解剖之前，使用真空连接的巴斯德吸管（或200μl多通道微量吸管）吸出涂层溶液，并用100μlPBS冲洗三次。
4. 取出最后的洗涤液，让板在生物安全柜中干燥。
  注意：也可以购买和使用制造商预涂的96孔板，以便在室温下储存。我们没有观察到在我们实验室或制造商预涂的96孔板中的细胞的数据之间的差异。
准备棉塞，火抛光巴斯德吸管
1. 使用本生灯，通过将毛细管定向在火焰中2-3毫米的移液管快速旋转，对棉塞堵塞的巴斯德吸管末端进行抛光。
2. 检查毛细管的开口，确保边缘圆形，孔不会太小。如果孔太小，丢弃移液管，因为它会在研磨过程中抛出神经突（图1）。
3. 使用前，将巴斯德吸液管高压灭菌。
  
  图1.消防抛光移液器。 A.棉花塞，火抛光移液器; B.从左到右：未抛光的尖端（边缘太尖锐，白色箭头），正确抛光的尖端（边缘光滑，绿色箭头），过度抛光的尖端（开口太小，红色箭头） ; C.与B相同
分离小鼠原代皮质神经元（图2）
注意：为避免污染，请在准备过程中对仪器进行灭菌。在每个步骤之间，工具可以保存在70％乙醇中，或者在发芽机中通过加热消毒。
原代皮质神经元从怀孕小鼠的E15.5小鼠胚胎中分离。在开始之前，准备在手术过程中所需的电镀介质，并在37℃下通过在水浴中温育预热。

图2.初级皮质神经元分离示意图
1. 对具有CO 2的怀孕小鼠进行安乐死，然后颈部脱位。
  注意：这是正确程序的一个例子，每个研究者应该遵循他或她批准的IACUC协议。
2. 将鼠标放在她的背上，用70％乙醇清洁腹部表面以对该区域进行消毒。
3. 使用微型剪刀，在腹部肌肉中进行垂直切口，打开小鼠腹腔。使用镊子，仔细取出胚囊并在细胞培养基（DMEM，冰冷，无添加剂）中冲洗。
4. 将胚胎囊置于含有10毫升冰冷DMEM的10厘米盘中
5. 使用微型剪刀和镊子仔细打开胚胎囊，取出胚胎并转移到含有10毫升冰冷DMEM的10厘米盘中。
注意：步骤C6至C10是一个接一个的胚胎执行的。
1. 将镊子放置在胚胎头骨后面，向鼻前方向前推。
2. 将镊子放在头部的两侧，大脑下方，并小心地将脑部从头骨中抬出（视频1）。
  
  Video 1. Removal of the brain from the skull
3. 将大脑转移到含有10毫升冰冷的冬眠E的10厘米盘中
4. 在解剖显微镜下，将大脑转移到10厘米盘中的Hybernate E的单液滴，以便于进入。
5. 在解剖显微镜下，使用镊子仔细地从每个脑半球的上表面剥离脑膜。去除脑膜后，皮质会脱离大脑（图3B）
6. 使用镊子，仔细分离皮质与大脑。
  
  图3.去除脑膜以释放皮质。 A.从头骨中移除个体大脑;去除脑膜后，从一个半球的皮层; C.一个半球的皮质（虚线）。皮质区转移到木瓜蛋白酶/ DNA酶（实线）
7. 将皮质的上部，外部部分（图3C）转移到含有1ml预温热木瓜蛋白酶/ DNA酶溶液的1.5ml微量离心管中，并收集其余皮质，同时尽可能多地吸收污染物。
8. 孵育管开放，在无菌10厘米的培养皿中37分钟，以溶解组织。这使得组织在保持无菌环境的同时呼吸。
注意：在生物安全柜中执行以下所有步骤，以避免任何污染。
1. 将管子立起放置几分钟，以使皮质在管底部沉淀。
2. 在不干扰皮质的情况下，使用1 ml微量移液缓慢小心地去除木瓜蛋白酶/ DNA酶溶液（确保尽可能多地除去木瓜蛋白酶/ DNA酶溶液），并加入1ml电镀培养基。
3. 使用调节至最低速度的移液器，通过棉花塞，火焰抛光的巴斯德移液管，以平缓和一致的移动方式上下移动细胞来分离细胞。避免气泡的形成是很重要的。研磨组织直至培养基稍微浑浊，并且没有剩余的组织块可见（视频2）。
  
  Video 2. Trituration of cortices
4. 将细胞转移到15ml锥形管中并加入4ml电镀培养基。为了确保细小的细胞块被破碎，通过使用调节至最低速度的移液器，通过棉花塞，火焰抛光的巴斯德移液管，轻轻地和一贯地上下移动多次，进行额外的研磨。
5. 让溶液静置2分钟，使任何碎屑沉淀到15 ml管的底部
6. 将含有单细胞神经元悬浮液的上清液转移到新的15 ml管中。
7. 将小滴细胞转移到组织培养处理的培养皿中，并使用组织培养显微镜（10倍放大）观察是否存在单细胞悬浮液（图4）。如果没有，如前所述，使用棉花塞，火抛光的巴斯德吸管进行另一次研磨。
  
  图4.原代皮层神经元形态学小鼠原代皮层神经元的相位图像（4x物镜）显示随时间的神经元形态学获取。
8. 使用台盼蓝染色液和血细胞计数器，计数存在于细胞悬浮液中的活细胞。加入10μl细胞至90μl台盼蓝染色液中，并通过移液轻轻混匀。将10μl等分试样转移到血细胞计数器，并计数血细胞计数器所有四个象限的活细胞。平均四个数字乘以1 x 10 5 。该数目对应于每ml培养基的细胞数。平均而言，每只小狗将产生〜5-10×10 6个细胞。
9. 将细胞转移到50ml锥形管中，并用预热的培养基将活细胞的密度调节至1×10 6细胞/ ml。例如，如果细胞浓度在5ml中为5×10 6细胞/ ml，则加入20ml的电镀培养基以获得最终细胞浓度为1×10 6细胞/细胞/ ml，最终体积为25 ml
10. 关闭并倒置管子以确保细胞悬液的充分混合。将细胞转移到50ml试剂储存器。
11. 使用200μl多通道微量移液管，将100μl细胞（1×10 5个细胞）转移到聚-L-赖氨酸预包被的96孔板的每个孔中。为了在每个孔中种下相同数量的细胞，在每次转移到96孔板中之前通过上下移液来混合储存器中的细胞。
12. 在组织培养箱中37℃，5％CO 2孵育板过夜。
13. 第二天，使用多通道微量移液管，每孔缓慢加入100μl饲养培养基（含有抗精神病药），以防止非神经元细胞的生长。小心不要打扰细胞。
14. 每3-4天，用新鲜准备的饲养介质取代一半体积的培养基。使用多通道微量移液管，从每个孔中缓慢移除100μl培养基，而不要接触孔的底部，以免扰乱细胞。非常轻轻地添加100μl新鲜制备和预热的饲养培养基，而不会干扰细胞。
15. 储存在组织培养箱37℃。必要时重复进料步骤。
用寡核苷酸治疗治疗原发性神经元
注意：寡核苷酸储存在-20°C。在任何实验之前，在冰上解冻化合物。该程序在生物安全柜内进行。
在饲养培养基中制备寡核苷酸稀释液。仔细设计您的平板图以包括感兴趣的寡核苷酸（hsiRNA Target ），非靶向控件（hsiRNA NTC sup>）和未处理的细胞。化合物以最终浓度的两倍制备，以便可将50μl化合物溶液加入到50μl条件培养基中。确保准备足够的化合物以处理所需重复次数的细胞。为了本协议的目的，我们描述了每种化合物的三个重复孔的制备和1.5μMhsiRNA的最终浓度。
1. 在深96孔板中，通过将含有抗神经系统的新鲜饲养培养基中的库存hsiRNA稀释至最终浓度为3μM（最终浓度为1.5μM）的2×hsiRNA主混合物，最终体积为200μl微升。
2. 用微量移液器轻轻上下混合。
3. 使用微量移液管，轻轻地从神经元中移除整个条件培养基，并立即将50μl条件培养基加入每个孔中（您可以将条件培养基合并到无菌试剂容器中，以便将其吸入板中）。一次只能从一排或两行中取出培养基，以防止细胞干燥。为了避免干扰细胞，用尖端接触孔的边缘缓慢移液介质。该步骤旨在控制在37℃孵育期间可能发生的任何蒸发，并确保所有细胞用相同浓度的hsiRNA处理。
4. 使用多通道微量移液管和每一行的清洁尖端，将50μl的2x hsiRNA主混合物从深96孔板转移到细胞培养板的每个重复孔中，最后的体积为每孔100μl。
5. 将培养板在组织培养箱中37℃孵育。在一周的温育中，用100μl新鲜制备的饲养培养基（处理3-4天）喂养细胞一次。然后在治疗一周后溶细胞。该步骤确保在实验期间不会从孔中除去hsiRNA。对于长期实验，细胞需要不止一次进食，从细胞培养板200μl中取出100μl条件培养基，加入100μl新鲜培养基。继续这种3-4天的喂养模式。
mRNA定量
使用QuantiGene 2.0bDNA测定（Affymetrix）定量mRNA。以下步骤中使用的所有体积均为一块。使用干净的血清移液管，在干净的50ml锥形管中准备用于此程序的所有溶液。
1. 在50ml锥形管中，制备补充有100μl的溶液的稀释的裂解混合物（DLM; 1:2v / v，裂解混合物/水，例如，10ml裂解混合物：20ml水） 50μg/μl蛋白酶K（随试剂盒提供），倒入50ml容器中。稀释的裂解混合物应为每个实验新鲜准备。将稀释的溶解混合物储存在冰箱中将导致沉淀物形成
2. 从板中取出所有生长培养基。
3. 使用300μl多通道移液管，在96孔培养板的每个孔中加入250μl稀释的裂解混合物。有足够的裂解液来进行目标和对照mRNA的定量。
4. 要细胞裂解，轻轻移动上下，避免形成气泡。每行之间使用干净的提示。
5. 在强制通风烘箱中，在55℃下孵育30分钟。
6. 使用300μl多通道移液器设置在150μl，通过轻轻地上下移动来彻底混合细胞裂解物，避免形成气泡。
7. 加入20μl探针组，根据试剂盒方案稀释到捕获板的每个孔（随试剂盒提供）。
8. 使用100μl多通道移液器，将适量的每个裂解液转移到捕获板。避免接触涂层板的底部。对于背景井，只需添加DLM（无蛋白酶K），而不是细胞裂解液。在使用QuantiGene 2.0试剂盒测试新基因之前，您将需要验证裂解物的体积，以获得适当程度的发光信号（至少5倍的信噪比，并且在线性检测范围内你正在使用的读卡器）。可以通过测量来自不同量的裂解物（5至80μl）的信号并绘制相应的发光值来测试。在同一个实验中，家务和目标基因可能需要不同体积的裂解物
9. 用DLM（无蛋白酶K）将每个孔上清至100μl。
10. 用铝板密封（随套件提供）非常紧密地密封板，并在室温下以240×g离心1分钟。
11. 在强制空气烘箱中在55°C下孵育过夜。
12. 第二天执行Affymetrix推荐的信号放大。
13. 使用酶标仪阅读器读取每个孔的读数时间为200-500毫秒。
14. 分析数据。

数据分析

注意：使用Microsoft Office Excel处理数据，并使用GraphPad Prism 7软件进行分析。

对于每个板和每个单独的探针组，平均在DLM（空白）孔中获得的值，并从所有样品孔中减去值。
为了使目标基因表达正常化，将目标基因发光值除以管家基因发光值
平均归一化未处理的细胞值。
为了计算相对于未处理细胞的靶基因表达的百分比，将每个单独的标准化均匀化除以未处理孔的平均值，并乘以100.
如果化合物在复制中进行测试，则平均复制并计算标准偏差
对于剂量反应分析，使用非线性回归曲线拟合，log（抑制剂）对响应变量斜率（四个参数）的图表浓度依赖性IC 50曲线。如果需要，将曲线的下限设置为零，曲线上限为100.
比较目标序列与非靶向对照（NTC）的功效以确定统计学显着性。与NTC组相比，所有比较的差异被认为在P - 值小于0.05的显着性。

笔记

解离后，如果研磨温和，细胞看起来会圆润。
细胞应在电镀后2小时内显示发生神经突的迹象。如果第二天仍然没有神经突，他们将不会长大。
细胞应作为单细胞悬浮液进行电镀。如果细胞是双峰或三胞胎，则它们倾向于以块状生长，这将影响实验的数据以及细胞生长。
注意神经元介质很多。批次变化可能会影响细胞的结块，生长和活力。
应特别注意hsiRNA修饰模式。功能高效的hsiRNA需要广泛的化学稳定性。用2'-O-甲基和2'-氟进行核糖的化学修饰导致hsiRNA对核酸酶降解的抗性的显着增加，在体内提供更高的稳定性和体内< （Byrne等人，2013; Alterman等人，2015）。未修饰或部分修饰的hsiRNA将经历核酸酶降解，影响培养物的功效
我们已经观察到，在高浓度的hsiRNA（2μM及以上）诱导细胞团的形成。
如果在hsiRNA潜伏期后期，细胞会从井的边缘聚集或拉出（在孔的中心聚集），这是不健康的治疗或电镀条件的迹象。

食谱

注意：对于所有食谱，并且在本步骤的任何步骤中使用Milli-Q纯化水。

木瓜蛋白酶/ DNase溶液

将木瓜蛋白酶溶解在2ml Hibernate E和1ml PBS中，通过倒置小瓶2-3次轻轻混合（不要旋涡）
另外，将DNA酶悬浮在0.5ml Hibernate E中，轻轻倒置小瓶2-3次
最后的木瓜蛋白酶溶液含有0.25ml悬浮的DNase，混合在3ml木瓜蛋白酶溶液中

电镀介质
补充有2.5％FBS的NbActiv4
对于50ml电镀培养基，在48.75ml的NbActiv4
中加入1.25ml 100％FBS 或者，使用补充有GS21 TM补充剂（50x），0.5mM二肽Ala-Gln和2.5％FBS的NeuralQ TM 培养基
饲养培养基
补充有抗神经元的NbActiv4，0.484μl/ ml的5'UTP和0.2402μl/ ml的5'FdU
对于50ml的NbActiv4，加入24.2μl5'UTP和12μl5'FdU
或者，使用补充有GS21 TM补充剂（50x），0.5mM二肽Ala-Gln和抗 - mitotics的NeuralQ 培养基0.484μl/ ml 5'UTP和0.2402 μl/ ml的5'FdU

致谢

我们感谢Khvorova和Aronin实验室，NIH和CHDI基金会公司的所有成员进行有益的讨论。具体来说，我们要感谢Aronin实验室的Kathryn Chase，其中主要的神经元分离方案最初来自该实验室。这项工作部分由NIH UH2-TR000888和UH3-4UH3TR000888-03，NIH NS38194和CHDI基金会（研究协议A-6119）的资助部分支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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