材料和试剂

表达TLR3-Flag（或稳定/瞬时表达Flag/Myc标记的蛋白的其他细胞）的Huh-7.5细胞（获自Apath，LLC）
DMEM（Life Technologies，目录号：11995065）
10％热灭活的FBS（Life Technologies，目录号：26140079）
青霉素 - 链霉素（Life Technologies，目录号：15140-148）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030-081）
非必需氨基酸（Life Technologies，目录号：11140050）
在细胞培养基中制备的HCV菌株HJ3-5原液（参见参考文献2 ）
DPBS（Life Technologies，目录号：14190-144）
RNase抑制剂（RNaseOUT）（Life Technologies，目录号：10777-019）
蛋白酶抑制剂（完全蛋白酶抑制剂混合物片）（Roche Diagnostics，目录号：1697498）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
抗Flag（M2）和抗Myc（9E10）单克隆抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804和M4439）和小鼠IgG对照（Life Technologies，目录号：02-6502）
蛋白G琼脂糖（General Electric Company，目录号：17-0618-01）
TRIzol（Life Technologies，目录号：15596-026）
分子生物学级水（Corning，目录号：46-000-CM）
琼脂糖（GenePure LE agarose）（BioExpress，GeneMate，目录号：E-3120-500）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
Platinum ^® Taq DNA Polymerase（Life Technologies）
培养基（见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

100mm板（Falcon ^TM，目录号：353003）
细胞刮刀（Falcon ^TM，目录号：353085）
电泳凝胶盒
Tube Rotator（Fisher Scientific，目录号：05-450-200）
离心机（Eppendorf，目录号：5415R）
Superscript III一步RT-PCR系统（Life Technologies，目录号：12574-018）

程序

HCV感染细胞的制备
1. 将稳定表达TLR3-Flag的Huh-7.5细胞（每皿1.5×10 6个）接种到10cm培养皿上并孵育过夜。
2. 以MOI为1（5ml HJ3-5原液，3×10 5 FFU/ml）接种6小时的HCV（菌株HJ3-5）6小时，除去接种物，然后用10 ml新鲜培养基
3. 在37℃下在5％CO 2中孵育细胞72小时
裂解物的制备
1. 吸出培养基，用DPBS洗涤细胞两次，并将细胞刮到50ml管中
2. 在4℃下以800×g离心3分钟，并除去上清液。
3. 重悬细胞沉淀在1毫升裂解缓冲液，并在4℃下旋转裂解物5-6小时。
4. 在4℃下以15,700xg离心裂解物20分钟。
5. 将上清液转移至1.5ml管中并置于冰上，并使用蛋白质测定试剂盒确定蛋白质含量
免疫沉淀
1. 将细胞裂解液（20μg总蛋白）转移到新的1.5 ml试管中
2. 向裂解物中加入1μg抗Flag抗体或小鼠IgG对照，并在4℃下旋转过夜
3. 加入20微升蛋白G琼脂糖凝胶裂解液，并在4℃下旋转2-3小时
4. 在4℃下以800xg离心3分钟。
5. 吸出上清液，用1ml裂解缓冲液洗涤珠子，并在4℃下旋转10分钟
6. 在4℃下以800xg离心3分钟。
7. 重复步骤C4-5两次。
8. 将琼脂糖悬浮在100μlDPBS中，使用一半用于RNA提取，剩余部分用于Western印迹以检测免疫沉淀的蛋白质。
RNA提取和RT-PCR
1. 通过在TRIzol试剂中涡旋15秒，然后按照制造商的说明书中所述的标准方案从琼脂糖珠提取RNA，并将RNA沉淀悬浮于50μl无核酸酶的水中（任选：在沉淀前加入1μl糖原的RNA与异丙醇）
2. 使用具有Platinum Taq DNA聚合酶的SuperScriptIII一步RT-PCR系统，使用HCV特异性引物对HCV84FP，5'-GCCATGGCGTTAGTATGAGTGT检测结合至TLR3- -3'; HCV 303RP，5'-CACCCTATCAGGCAGTACCACAA-3'，在55℃的退火温度下，随后在1.5％琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳。通常可以用35-40个PCR循环检测特异性条带（220bp）

食谱

培养基
DMEM
10％热灭活的FBS 青霉素 - 链霉素 L-谷氨酰胺非必需氨基酸
裂解缓冲液
1x DPBS
0.1％Triton X-100 1x蛋白酶抑制剂混合物
100 U/ml RNaseOUT

致谢

这项工作部分得到了国立卫生研究院（RO1-AI095690）和大学癌症研究基金的资助。该协议改编自Dansako等人之前的工作。（2013）。

参考文献

Dansako，H.，Yamane，D.，Welsch，C.，McGivern，D.R.，Hu，F.，Kato，N.and Lemon，S.M。 A类清道夫受体1（MSR1）通过介导toll样受体3识别来限制丙型肝炎病毒复制在邻近细胞中产生的病毒RNA。
9（5）：e1003345。
Yi，M.，Ma，Y.，Yates，J。和Lemon，S.M。（2007）。 E1，p7，NS2和NS3中的补偿性突变增强了细胞培养 - 感染性基因型间嵌合肝炎的产量C.病毒。 J Virol 81（2）：629-638。