材料和试剂

赫拉细胞
XL-10 Gold Ultracompetent Cells（Agilent Technologies，Stratagene，目录号：200315）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（粉末，高葡萄糖）（Life Technologies，目录号：52100-039）
MQ-水（来自ELGA系统的纯水）
胎牛血清（FCS）（BioConcept，Amimed，目录号：2-01F30-I）
青霉素 - 链霉素溶液（P/S）（1单位/ml）（BioConcept，Amimed，目录号：4-01F00-H）
胰蛋白酶-EDTA（T/E）（BioConcept，Amimed，目录号：5-51F00-H）
DreamFect ^TM（OZ Biosciences，目录号：DF45000）
KpnI（New England Biolabs，目录号：R0142S）
SL Oligo 1（Microsynth AG）
寡核苷酸序列： 5'-CGGGTTCCGTCCAAGCACTGTTGAAGCAGGAAACCCGGGTTGCTAGTCGATCGACTAG-CAACCCGGGTTTCCTGCTTCAACAGTGCTTGGACGGAACCCCGATCGTAC-3'
SL Oligo 2（Microsynth AG）
寡核苷酸序列：
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201L）
碱性磷酸酶小牛肠（CIAP）（Promega Corporation，目录号：M182A）
100x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：1861279）
RiboLock RI RNA酶抑制剂（40U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0381）
RNA酶I（克隆的，100U /μl）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM2294）
Turbo DNase（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM2238）
分子生物学糖原（Roche Diagnostics，目录号：10 901 393 001）
预染色的蛋白质梯（宽范围）（New England Biolabs，目录号：P7710S）
山羊抗UPF1抗体（G-α-RENT1）（Bethyl Laboratories，目录号：A300-038A）
山羊抗兔IgG（多克隆）（Bio-Rad Laboratories，目录号：172-1053）
兔抗肌动蛋白（多克隆）（Sigma-Aldrich，目录号：A5050）
AffiniPure山羊抗小鼠IgM（μ链特异性）（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：115-005-020）
IRDye 800CW驴抗兔（LI-COR，目录号：926-32213）
IRDye 800CW驴抗山羊（LI-COR，目录号：926-32214）
Dynabeads Protein G（Life Technologies，目录号：10004D）
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega Corporation，目录号：A9282）
Affinity Script Multi-Temp Reverse Transcriptase（Agilent，目录号：600105）
随机六聚体引物（Microsynth AG）
Brilliant III超快速qPCR主混合物（Agilent，目录号：600880）
氯仿
异丙醇
DMEM -/- （见配方）
DMEM +/+（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（见Recipes）
低渗温和裂解缓冲液（pH 7.5）（无RNase）（见配方）
洗涤缓冲液（pH 7.5）（无RNase）（见配方）
Net-2缓冲液（pH 7.5）（无RNase）（见配方）
杂交缓冲液（pH 7.5）（参见配方）
2x SDS上样缓冲液（pH 6.8）（参见配方）
TRI试剂（参见配方）
Tris缓冲盐水（pH 7.6）（TBS）（参见Recipes）
TBS-Tween牛奶（见配方）
Bjerrum传输缓冲区（请参阅配方）
DEPC处理的水/缓冲液（见配方）
Turbo DNase mix（参见配方）

设备

纯水系统：PURELAB Priama（Prima 7）和PURELAB ULTRA （Ultra Genetic）（ELGA LabWater）
CO 2培养箱（BINDER GmbH，型号：9140-0047）
Clear-view TM Snap-Cap微管（1.5ml，天然，低保留）（Sigma-Aldrich，目录号：T4816-250EA）
乘以 -Pro 0.2Ml Biosphere （Sarstedt AG，目录号：72.727）
过滤嘴（10μl，20μl和200μl）（Axon Lab AG，目录号：AL60X10，AL60X20，AL60X200）
过滤嘴（1,250μl）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：7.750.261）
Countess ^TM自动化细胞计数器（Life Technologies，型号：C10227）
（Life Technologies，目录号：C10283）
15cm组织培养皿（TPP Techno Plastic Products，目录号：93150）
GP Millipore express（0.22μm）（500ml漏斗，45mm颈部尺寸）（EMD Millipore，目录号：SCGPT05RE）
NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）
热块，Thermomixer ^® compact（Eppendorf）
DynaMag ^TM -2磁体（Life Technologies，目录号：12321D）
带有转子F45-24-11的Eppendorf离心机5415R（Eppendorf，目录号：022621459和022636502）
Lab循环仪梯度，配备有Thermoblock 96（SensoQuest GmbH，型号：011-101和012-103）
印花纸（ALBET Lab Science，目录号：BP 002 46579）
Corbett Rotor-Gene ^® 6000（QIAGEN）
Corbett CAS-1200（QIAGEN）
SE260 Mighty Small II豪华迷你垂直电泳装置（Hoefer，型号：SE260-10A-1.5）
带有转子F45-24-11的Eppendorf离心机5415R（Eppendorf，目录号：022621459和022636502）
Lab循环仪梯度，配备有Thermoblock 96（SensoQuest GmbH，型号：011-101和012-103）
印花纸（ALBET Lab Science，目录号：BP 002 46579）
Corbett Rotor-Gene ^® 6000（QIAGEN）
Corbett CAS-1200（QIAGEN）
SE260 Mighty Small II豪华迷你垂直电泳装置（Hoefer，型号：SE260-10A-1.5）

按照制造商的方案，在37℃下，将总量为40μl的Digest4.2μgp-β微型μWT uA1质粒与36U Kpn I在37℃下孵育1小时。
加入5μl10x CIP缓冲液和5μlCIP（1 U /μl），并在37°C孵育30分钟，以去磷酸化开放的载体。
在1％琼脂糖凝胶上运行消化的载体，切除DNA条带，并使用Wizard SV凝胶PCR清理系统分离载体。

Anneal SL Oligo 1和SL Oligo 2
1. 混合1μlSL oligo 1（100μM），1μlSL oligo 2（100μM）和48μl杂交缓冲液。
2. 将杂交混合物加热至90℃，并缓慢冷却至40℃（在加热块中）
3. 为了磷酸化双链寡核苷酸，将2μl杂交混合物，24μlMQ-水，3μl10×T4 DNA连接酶缓冲液，1μlT4 PNK并在37℃孵育30分钟。
4. 在70°C灭活激酶15分钟
用1μlT4 DNA连接酶（400U /μl）在1×T4 DNA连接酶缓冲液中的50μl的开放p-β微型μWT uA1载体与2μl双链寡核苷酸在总体积15μl中室温下2.5小时
将5μl连接混合物转化到100μlXL10-Gold超活性细胞中
通过测序验证编码微型μ开放读框之前的茎环的序列的存在

用p-βSL miniμWT uA1或p-βminiμWT uA1质粒转染hela细胞

Hela细胞在补充有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10％FCS（DMEM +/+：具有抗生素和FCS的DMEM）的DMEM中培养。
（第1天）将3×10 6个hela细胞种入两个15cm直径的皿中的每一个中，第二天使60％汇合的细胞生长。
（第2天）使用40μlDreamFect TM根据制造商的方案用5μgp-β微型μWT uA1或5μgp-βSL微型μWT uA1质粒转染细胞。
（第3天）将细胞从一块板分成两个15cm直径的皿
（第4天）收获细胞。
1. 用25 ml PBS洗涤细胞
2. 为了分离细胞，将它们与4ml胰蛋白酶-EDTA（T/E）在37℃温育10分钟。
3. 加入9ml DMEM +/+并重悬细胞
4. 使用Countess™自动细胞计数器根据制造商的协议计数细胞

裂解细胞

将1.2×10 7个细胞在冰上在补充有40U/ml RiboLock RI RNA酶抑制剂的1.2ml低渗温和裂解缓冲液中裂解20分钟。
通过在微量离心机（16,000×g，4℃，15分钟）中离心来清除裂解物。

取蛋白和RNA输入样品

蛋白质输入样品通过将50μl裂解物与50μlSDS上样缓冲液混合，在90℃下烹饪5分钟并储存在-20℃下制备。
在提取输入RNA之前，将100μl细胞裂解物用2.5μlRiboLock RI RNA酶抑制剂补充并用20U/ml TURBO DNase在37℃处理5分钟。随后，根据以下TrIzol方案用TRI试剂提取RNA。
1. 混合100微升TURBO DNase处理的细胞裂解物与900微升TRI试剂，涡旋
2. 在室温下孵育5分钟
3. 向每个样品中加入180ml氯仿并涡旋15秒
4. 在室温下孵育5分钟。
5. 离心样品（12,000×g，4℃，15分钟），提起350μl水相，并转移到新鲜试管中。
6. 加入2μl糖原，450μl异丙醇，涡旋并在-20℃下孵育30分钟
7. 通过离心（12,000×g，4℃，10分钟）沉淀RNA。
8. 弃去上清液并用1ml 70％EtOH洗涤沉淀
9. 旋转样品（12,000×g，4℃，10分钟），弃去上清液并将沉淀物风干。
10. 在60μlMQ-水中溶解RNA
11. 测量NanoDrop 2000上的RNA浓度。OD 260与OD 230之比为： 2表示苯酚污染和需要额外的EtOH沉淀样品

UPF1 RNA免疫纯化（RIP）

通过向剩余的1,050μl表达miniμ或SL miniμ构建体的细胞裂解物中加入52.5μl3MNaCl使NaCl浓度适应150mM。
使用3.7μg山羊抗RENT1和山羊抗兔IgG抗体（对于RIP温育程序，参见表1），将500μl每种裂解物在4℃下头尾孵育90分钟。
制备Dynabeads 蛋白G珠。
1. 用1ml洗涤缓冲液洗涤128μlDynabeads 蛋白G珠子
2. 珠子用1ml低渗温和裂解缓冲液洗涤
3. 珠子在补充有1％（w/v）BSA和0.1％酵母tRNA的低渗温和裂解缓冲液中在4℃下平衡1小时（以最小化非特异性结合）。
4. 用1ml低渗温和裂解缓冲液洗涤珠子两次
Dynabeads 均匀地分布在4个RIP样品上，并在4℃下尾部孵育90分钟（表1）。

表1. UPF1 RIP孵化模式
沉淀物用1ml Net-2缓冲液洗涤6次
在最后的洗涤步骤中，分离珠子。
1. 将三分之一的珠子与40μl2x SDS上样缓冲液在90℃温育5分钟，以洗脱蛋白质，用于随后的蛋白质印迹分析。
2. 将三分之二的珠溶解在50μlTurbo DNA酶混合物中，并且DNA酶在37℃处理10分钟。为了分离RNA，将900μlTRI试剂加入样品中并根据Trizol方案处理（参见4b）。将RNA溶解在34.5μlMQ-水中，反转录并通过RT-qPCR分析

定量实时逆转录PCR

在含有1×StrataScript RT缓冲液，0.1mM DTT，0.4mM dNTP，300ng随机六聚体引物的总体积50μl中反转录全部回收的UPF1 RIP的RNA或1μg输入RNA样品，并将1μl StrataScript Multi-Temp逆转录酶。
使用Corbett Rotor-Gene 6000中的Brilliant III Ultra-Fast qPCR Master混合物扩增12微升的逆转录反应（使用Corbett CAS-1200机器人完成移液）。用于测量SMG5和微小mRNA水平的引物和TaqMan探针在别处描述（Yepiskoposyan等人，2011）（也见表2）。测量与UPF1有效结合的SMG5 mRNA的水平（Yepiskoposyan等人，2011），以对不同样品中的可变RIP效率进行归一化。

表2. TaqMan探针

免疫印迹

对于蛋白质分析，使用Mighty Small II流动室SE260在10％SDS-PAGE上分离2×10 5个细胞和三分之一的RIP样品。将蛋白质转移至Optitran BA-S 85增强的硝酸纤维素膜使用半干印迹和Bjerrum转移缓冲液。
在TBS-Tween乳中封闭后，用1:3,000稀释的多克隆山羊抗RENT1抗体在封闭缓冲液中探测膜，以评估UPF1 RIP实验，1:500稀释的AffiniPure山羊抗小鼠IgM的特异性， μ链特异性抗体，以比较来自p-βSL miniμWT uA1或p-βminiμWT uA1质粒或1:5,000稀释的多克隆兔抗肌动蛋白抗体的微型μ表达水平以用作加载对照。
1. 用1：10,000稀释的驴抗兔IRDye 800CW或驴抗山羊IRDye 800CW抗体探测该膜。
2. 在Odyssey红外成像仪上扫描膜

图1.茎环诱导的转录物特异性翻译抑制。在KpnI位点（绿色回文序列）中引入的茎环结构的表示预制微型μ开放阅读框（红色盒式序列）的Ig-μ报道转录物微型。 b。迷你μ和SL迷你μ报告基因转录物的示意图。显示了SL miniμ的5'UTR中的翻译抑制稳定茎环。 CDS表示为侧翼为5'和3'UTR的白盒。灰色条，外显子 - 外显子连接;黑线，用于具有逆转录的实时qPCR（RT-qPCR）（改编自参考文献1）的TaqMan测定的位置

食谱

注意：RIP协议中使用的所有缓冲区都必须是无菌的，无RNase的。因此，所有缓冲液使用MQ-水制备，如果可能的话用DEPC处理。 Duran瓶，玻璃器皿和铲子在180℃烘烤2小时。将聚碳酸酯或聚苯乙烯材料（例如磁力搅拌器）在3％过氧化氢或2M NaOH中浸泡10分钟，并用DEPC处理的水充分冲洗。如果缓冲液不能被DEPC处理（例如Tris缓冲液），则在DEPC或MQ-水中制备缓冲液，并用0.22μm过滤器过滤。

DMEM -/- （每900ml） 12克DMEM/F12粉末
2.48g NaHCO 3水溶液用ddH 2 O·
补充至900ml 用32％HCl或10M NaOH将pH调节至7.2 用瓶顶过滤器（0.22μm）过滤灭菌
DMEM +/+（每500ml）供应450毫升DMEM -/- 与50毫升FCS和5毫升P/S
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl 10mM Na 2 HPO 4
2.7 mM KCl
2mM KH 2 PO 4 sub/
用HCl
调节pH至7.4
低渗温和裂解缓冲液（不含RNase）
10mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM NaCl 2mM EDTA 0.5％（v/v）Triton X-100 在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
洗涤缓冲液（无RNase）
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 0.05％（v/v）NP-40
在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
Net-2缓冲区（无RNase）
150mM NaCl 50mM Tris-HCl（pH7.5） 0.1％（v/v）Triton-X-100 在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
杂交缓冲区
0.5％（v/v）Triton X-100 在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
洗涤缓冲液（无RNase）
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 0.05％（v/v）NP-40
在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
Net-2缓冲区（无RNase）
150mM NaCl 50mM Tris-HCl（pH7.5） 0.1％（v/v）Triton-X-100 在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
杂交缓冲区
... 0.1% (w/v) 8-quinolinol (pH 5.0)
Tris buffered saline (TBS)
137 mM NaCl
20 mM Tris-HCl (pH 7.6)
TBS-Tween milk
5% (w/v) milk powder, fat-free
0.1% (v/v) Tween-20
Make up to 250 ml using TBST
Bjerrum transfer buffer
48 mM Tris base
39 mM glycin
0.1% (w/v) SDS
20 (v/v) MeOH
DEPC treated water/buffer
0.1% (v/v) DEPC
Stir over night at 4 °C
Autoclave twice in order to inactivate DEPC
Turbo DNase mix
1x Turbo DNase buffer
0.1 U/µl Turbo DNase
1 U/µl RiboLock RNase inhibitor

Acknowledgments

We thank L. Maquat (University of Rochester, Rochester, New York, USA) for providing their protocol for RIP coupled with RNase-H cleavage, and S. Rufener (Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern, Bern, 瑞士）帮助RIPs。这项工作得到了来自欧洲研究委员会（StG 207419），瑞士国家科学基金会（31003A-127614和31003A-143717）和伯尔尼州的OliverMühlemann的资助。

参考文献

Yepiskoposyan，H.，Aeschimann，F.，Nilsson，D.，Okoniewski，M。和Mühlemann，O.（2011）。人类细胞中无义介导的mRNA衰减途径的自动调节 RNA 17（12）：2108-2118。
Zü nd，D.，Gruber，A. R.，Zavolan，M. andMühlemann，O.（2013）。翻译依赖于UPF1从编码序列的置换导致其在3'UTR的富集。 Nat Struct Mol Biol 20（8）：936-943。