材料和试剂

对于体外转录（IVT）
1. 包括5×T7转录缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Fermentas，目录号：EP0111）的T7 RNA聚合酶
2. RiboLock RNA酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Fermentas，目录号：EO0381）
3. 100mM ATP，UTP，GTP，CTP（NTP组）（Thermo Fisher Scientific，Fermentas，目录号：R0481）
4. 重组DNA酶I（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM2235）
5. 无RNase的水（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9932）
6. （PercelElmer，目录号：BLU008X）
  PUP（800Ci/mmol，10μCi/
7. 1x T7转录缓冲液（参见配方）
  注意：模板将通过PCR生成，因此也需要PCR的所有试剂。
特别是对于tRNA IVT
1. MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
2. 来自酵母的鸟苷5'-单磷酸二钠盐水合物（GMP）（作为100mM在无RNA酶的水中的储备溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：G8377）
3. Bio-Spin层析柱，Tris缓冲液中的Bio-Gel P-6（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6227）
4. OptiPhase Supermix液体闪烁混合物（PerkinElmer，目录号：1200-439）
5. Microbeta入门试剂盒平板（PerkinElmer，目录号：1450-486）
用于变性尿素PAGE
1. 脲（Sigma-Aldrich，目录号：U6504）
2. Rotiphorese 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）溶液（Carl Roth，目录号：3030.1）
3. 过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：215589）[作为在无RNA酶的水中的10％（w/v）溶液]
4. N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
5. 2x MOPS缓冲液（例如Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9570）
6. 甲酰胺（例如Life Technologies，Ambion ^®，目录号：AM9342）
7. 甲醛（例如Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
8. 蔗糖（例如Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
9. 溴酚蓝（例如Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
10. 二甲醇（例如Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
11. 1x TBE缓冲区（参见配方）
12. 2x RNA加载染料（参见配方）
对于天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
1. 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）溶液，APS和TEMED，如C所列
2. 甘油（例如Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
3. Tris（例如Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
4. 硼酸（例如Sigma-Aldrich，目录号：B7901）
5. EDTA（例如Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
6. 0.5x TBE缓冲区（参见配方）
7. 10x加载缓冲区（参见配方）

设备

分子生物学的基本实验室设备，强调无核糖核酸酶
1. 0.5ml无RNase的微量离心管（Applied Biosystems ，目录号：AM12300）
2. 1.5ml无RNase的微量离心管（Applied Biosystems ，目录号：AM12400）
3. 具有尖端和15ml或50ml管（例如SARSTEDT AG）的微量移液管（例如Eppendorf）
4. 台式离心机（例如Microcentrifuge，Eppendorf，目录号：5425）
5. 用于1.5ml和0.5ml管（例如Grant Instruments，Grant bio PCH-1个人台式冷却器/加热器）的加热块
  注意：模板将通过PCR生成，因此也需要标准的PCR热循环仪。
实验室设备在指定区域进行放射性工作
1. 液体闪烁计数器（PerkinElmer，型号：1450LSC&发光计数器）
2. 用于垂直PAGE（例如CBS Scientific，目录号：WSP2-SG-200），电源（例如CBS Scientific，Inc。）的电泳室，载玻片，间隔物，夹具和梳子目录号：EPS-200-X）
3. 塑料包装，透明片材和Whatman纸（例如，Sigma-Aldrich，目录号：Z742422）
4. 凝胶干燥器（583型凝胶干燥器）（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-1746）用真空泵
5. 在盒（VWR International，目录号：63-92）中的荧光成像器（Fujifilm FLA-7000）（GE Healthcare，目录号：28-9558-09）和PhosphorImager屏（存储荧光屏）（VWR International，目录号：28-9564） 0035）

程序

具有游离3'cca末端的tRNA的体外转录（IVT）
1. 用于通过PCR扩增来自细菌染色体的tRNA模板的引物需要T7启动子序列在它们的5'末端用于通过T7聚合酶的体外转录。为了成功转录，三个嘌呤碱基，最好是鸟嘌呤，应该跟随核心启动子序列（下划线）：nnnnCTAATACGACTCACTATAGRRnnnnnn ...第一个G（以粗体表示）作为转录起始。
2. 用于tRNA模板的PCR产物根据制造商的方案用MinElute PCR纯化试剂盒净化
3. tRNA IVT反应如下在20μl体积中建立。
  1. 加入1×T7反应缓冲液，20U RiboLock TM RNA酶抑制剂，0.5mM ATP，GTP和UTP，12μMCTP，9mM GMP，20U T7 RNA聚合酶和2μl的α32 P] -CTP（800Ci/mmol，10μCi/μ 1）至4pmol DNA模板（tRNA-PCR）。
    注意：反应设置遵循来自Fermentas for Synthesis of Radiolabeled RNA Probes of High Specific Activity（Fermentas）的方案。添加GMP以增加所得tRNA分子的5'单磷酸化（根据Sampson和Uhlenbeck，1988）。
  2. 在37℃下孵育反应混合物<7小时以富集短片段的转录并在-20℃下停止反应5分钟。
  3. 通过加入1U重组DNA酶I并在37℃下再温育30分钟除去DNA模板
  4. tRNA产物必须使用例如Micro Bio-Spin TM层析柱用Bio-Gel P-6在Tris缓冲液中清洗以确保没有小的tRNA片段丢失。如果使用闪烁计数器测量掺入率，则在清理前保留1μl反应体积（见A4）。
    注意：其他清洁试剂盒当然是可能的，只要所需产物的损失被避免和未掺入，放射性核苷酸被去除。如果通过变性尿素PAGE可以检测多于一种tRNA产物（参见图1），则应该从凝胶洗脱正确的条带。可以在本节后找到变性尿素PAGE的配方。
4. 为了建立放射性核苷酸在IVT期间掺入所产生的tRNA中的掺入率，将1μl在清除前后的反应体积用于闪烁计数。
  1. 将OptiPhase Supermix液体闪烁混合物（每孔50μl）移液到刚性96孔板中，并加入1μl样品，样品之间有一个空孔，以避免孔的交叉计数。
  2. 平行地，将使用的放射性核苷酸[α32 P] -CTP的稀释系列加入到同一板中以获得cpm（每分钟计数）的标准曲线。
  3. 将板密封并置于液体闪烁计数器中。来自标准曲线的cpm将给出每μCi的cpm值。由于P ^{32的半衰期}，这将随着每个实验而改变。清除之前和之后的样品的cpm值有助于计算放射性核苷酸的掺入率，并且随后计算IVT后的RNA产量，以确定在结合测定中使用的tRNA的摩尔浓度。
    注意：可以通过Ambion的文章（ http://www.lifetechnologies.com/de/de /home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/tech-notes/determining-rna-probe-specific-activity-and-yield.html ）。如果没有闪烁计数器，也可以通过在清除之前和之后获得的盖革计数器值以及从其计算的RNA产率和摩尔浓度来估计掺入率。

用于变性尿素PAGE的配方

选择10％（w/v）丙烯酰胺/8M尿素凝胶用于在小尺寸凝胶（10×10cm）上分离78nt的tRNA分子。
1. 将3.36g脲溶解在1×TBE（至体积为5.25ml）中，通过搅拌> 在室温下4小时。向8M尿素溶液中加入1.75ml 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）溶液，使总体积达到7ml。
  注意：总体积取决于玻璃板的尺寸和使用的垫片的厚度。这里我们使用10×10厘米板和1毫米厚度，需要7毫升的体积。脲 - 丙烯酰胺混合物可以预先在更大的体积中制备并在4℃下储存。
2. 具有所需尺寸的清洁玻璃载玻片在左侧和右侧设置有间隔物，并且放置在凝胶浇铸室中或者在两侧用夹具固定。
3. 向脲 - 丙烯酰胺混合物中加入35μl[0.5％（v/v）] 10％APS和15μl0.2％（v/v）TEMED以催化聚合过程。
4. 将混合物快速倒入载玻片（例如用10ml玻璃移液管）和梳子之间，并在凝胶中调节所需量的孔。避免气泡！
将完全聚合的凝胶在1×TBE缓冲液中在250V在室温下预运行40分钟。取下梳子。
将tRNA样品与2x RNA加载染料混合，并在加载前在85℃热变性5分钟。
注意：在装载样品之前，立即冲洗孔！
电泳设置为在室温下250V，在1x TBE缓冲液中运行1小时。
电泳后，将凝胶转移到Whatman纸上，并在PhosphorImager筛网曝光（几小时通常足够）之前覆盖在透明片材上，然后扫描与PhosphorImager FLA-7000（参见图1）。
注意：不要用凝胶干燥器干燥尿素-PA凝胶，因为它们会崩解。

IVT-RNA-tRNA结合测定

典型的10μl反应体积包含T7体外转录的所有组分：
1. 1x T7转录缓冲液，10U RiboLock RNA酶抑制剂，6U T7 RNA聚合酶和0.5mM NTP（ATP，UTP，GTP，CTP）。将用于前导RNA的DNA模板（PCR产物）添加至8nM，并将放射性标记的tRNA添加至50nM。
  注意：前导RNA模板必须在A1的5'末端含有T7启动子序列。
2. 因此，没有tRNA而是使用12μMCTP和1μl[α32 P] -CTP（800Ci/mmol，10μCi/μl）来设置对照反应以检查IVT效率。
3. 将反应混合物在37℃下孵育2小时，这对于440nt的转录物是足够的。
4. 加入2μl10×上样缓冲液，将样品立即装入非变性聚丙烯酰胺凝胶上
选择6％（w/v）丙烯酰胺凝胶以在中等大小的垂直凝胶上用〜440nt的RNA从复合物中分离78nt的tRNA。
1. 具有所需尺寸的清洁玻璃载玻片在左侧和右侧设置有间隔物，并且放置在凝胶浇铸室中或者在两侧用夹具固定。
2. 将1.5ml 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）溶液和0.5ml 10×TBE与无RNA酶的水混合至10ml体积，然后加入40μl[0.4％（v/v）] 10％APS和20μl μl[0.2％（v/v）] TEMED以催化聚合过程。
  注意：总体积取决于玻璃板的尺寸和使用的垫片的厚度。这里我们使用10 x 15厘米板和1毫米厚度，需要10毫升的体积。使用比通常更高的TEMED百分比来实现非常快速聚合。
3. 将混合物快速倒入载玻片（例如用10ml玻璃移液管）和梳子之间，并在凝胶中调节所需量的孔。避免气泡！
4. 完全聚合的凝胶必须在0.5×TBE缓冲液中在200V在4℃预运行至少40分钟。取下梳子。在装样前冲洗孔。
5. 在结合反应后立即装载样品。
  注意：如果可能，请在电泳室已经运行时快速装载样品，以避免复合体分离。
6. 电泳设置为100V（= 6.7V/cm），5W在4℃运行> 3小时。
  注意：这些设置主要取决于未结合的和结合的标记的RNA部分之间的大小差异以及所使用的凝胶的大小（因此它不应当在底部，而是应当清楚地分开）。在运行时更好地冷却凝胶（因此在4℃的房间或缓冲冷却系统中）。
电泳后，将凝胶转移到Whatman纸上，用塑料包裹物覆盖，然后通过真空凝胶干燥器在80℃下干燥， 30分钟。
放射性标记的RNA复合物的检测通过曝光PhosphorImager筛（通常过夜），然后用PhosphorImager FLA-7000（参见图2）进行扫描来实现。

代表数据

图1.标记的tRNA的变性尿素PAGE的扫描图像。该实施例显示大多数tRNA IVT反应的主要单一产物（箭头），而且一个样品中几种产物的扩散模式（泳道5 ）。该样品将导致非特异性结合反应，因此IVT必须重复或正确的条带从凝胶中洗脱。泳道1：大小标记;泳道2-6：不同的体外转录的tRNA

图2.结合测定后的原生PAGE凝胶的扫描图像这是在凝胶底部分离未结合的小tRNA *的实例，并且tRNA *与更大的T- （箭头），其在预形成的放射性标记的（*）tRNA的存在下在体外转录。泳道1：控制T-box RNA *无tRNA的IVT反应;泳道2：具有tRNA * fMet的T盒RNA IVT;泳道3：具有tRNA * Cys（不结合T盒RNA）的T盒RNA IVT。

笔记

我们手中最可变的组分是tRNA分子的体外转录。只有获得一个显性tRNA产物（通过用10％（w/v）丙烯酰胺/8M尿素的变性PAGE控制，参见图1]，然后检测到的结合相互作用强。如果发现产生的tRNA部分的高度多样性，则可以更好地建议在结合测定前从脲 - 丙烯酰胺凝胶洗脱标记的tRNA条带。

食谱

5x T7转录缓冲液（通常与T7聚合酶一起提供） 200mM Tris/HCl（pH7.9）
50 mM DTT
30mM MgCl 2/v/v 50mM NaCl 10mM亚精胺
10x TBE缓冲液（1 L）
0.89M Tris
0.9M硼酸 25mM EDTA
溶解108克Tris和55克硼酸在950毫升蒸馏水中的溶液加入50ml 0.5M EDTA（pH8.0）
2x RNA上样染料
2x MOPS缓冲区
65％（v/v）甲酰胺 4.4％（v/v）的甲醛 2％（w/v）蔗糖 0.1％（w/v）溴酚蓝
0.1％（w/v）二甲苯甲醇
10x加载缓冲区
40％（v/v）甘油 0.25x TBE

致谢

这项工作由德国研究基金会（DFG），Transregio34"后基因组时代的葡萄球菌的病理生理学"资助，我的博士津贴是由欧洲社会基金（ESF）授予的。这里提出的协议是在博士Wilma Ziebuhr实验室在我的研究时间在贝尔法斯特女王大学（QUB）。

参考文献

Fermentas T7 IVT协议： http：//www.thermoscientificbio .com/dna-and-rna修饰酶/t7-rna-polymerase/

Sampson，J.R。和Uhlenbeck，O.C。（1988）。体外转录的未修饰的酵母苯丙氨酸转移RNA的生物化学和物理表征。 Proc Natl Acad Sci USA 85（4）：1033-1037。

Schoenfelder，S. M.，Marincola，G.，Geiger，T.，Goerke，C.，Wolz，C.and Ziebuhr，W。葡萄球菌中的甲硫氨酸生物合成aureus 受到包含启动子tRNA特异性T盒核糖开关的分层网络的严格控制。
9（9）：e1003606。