材料和试剂

组织培养
1. DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D6429）
2. 胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
3. 培养基M199（Sigma-Aldrich，目录号：M7528）
4. 青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
5. BJ人包皮成纤维细胞
6. 硫酸博莱霉素（Sigma-Aldrich，目录号：B8416）
7. BJ培养基（见Recipes）
一般资料
1. Bradford蛋白质测定试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
2. 多克隆抗AUF1抗体（EMD Millipore，目录号：07260MI）
3. 正常兔IgG抗体（Cell Signaling Technology，目录号：2729）
4. 蛋白A Dynabeads（Life Technologies，目录号：10002D）
5. MCLB（哺乳动物细胞裂解缓冲液）（参见配方）
6. NT2缓冲区（参见配方）
7. 缓冲区A（参见配方）
8. 缓冲液B（参见配方）
9. 缓冲液C（参见配方）
免疫沉淀试剂
1. Tris
2. EDTA
3. NP40
4. NaCl
5. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
6. SDS
7. 脱氧胆酸盐
8. MgCl 2
9. NaH 2 PO 4 sub
10. RNAse OUT（Life Technologies，目录号：10777-019）
11. 蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P6556）
12. RiboPure RNA分离试剂盒（Life Technologies，目录号：AM1924）
qRT-PCR试剂
1. dNTPs
2. 六核苷酸混合物（Roche Diagnostics，目录号：11277081001）
3. SuperScript II Reverse Transcriptase（Life Technologies，目录号：18064-014）
4. Power SYBR GREEN PCR主混合物（Life Technologies，目录号：4367659）
引物
1. IL6正向：5'-ACA TCCTCGACGGCA TCTCA-3'
2. IL6反向：5'-TCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3'
3. IL8正向：5'-GCTCTGTGTGAAGGTGCAGT-3'
4. IL8反转：5'-TGCACCCAGTTTTCCTTGGG-3'

设备

组织文化
1. 37℃强制空气培养箱中保持在5％CO 2和5％O 2（Thermo Fisher Scientific，Forma Series II水夹套CO 2培养箱）
2. 层流生物安全柜（Labconco净化器II类生物安全柜）
免疫沉淀
1. 能在450和595nm读数的分光光度计
2. Dyna-mag磁珠分离器（Life Technologies，目录号：12321D）
3. 微量离心机
4. 端到端管旋转器（Thermo Fisher Scientific，目录号：400110Q）
qRT-PCR
1. PCR仪（Bio-Rad Laboratories，型号：C1000热循环仪）
2. 实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，型号：CFX96实时系统）
一般设备
1. 组织培养细胞刮刀
2. 冷藏微量离心机
3. 热块能达到70°C

程序

BJ人包皮成纤维细胞在BJ培养基中在37℃，5％CO 2，5％O 2下培养。通过用100μg/ml硫酸博莱霉素处理细胞24小时诱导应激诱导的早衰（SIPS）。在24小时处理后，用新鲜培养基替换含有硫酸博莱霉素的培养基。在用博来霉素处理后3天，细胞衰老。
通过在冰上在PBS中刮擦来收集细胞（对于15cm培养皿，使用4ml PBS）。每次免疫沉淀（IP）（IgG对照和特异性抗体）需要350万个细胞。使用血细胞计数器测定细胞数。
通过在4℃下以1,500rpm离心5分钟来沉淀细胞。
为了裂解细胞，将沉淀重悬于1ml MCLB中，并在4℃下以末端旋转孵育20分钟。
离心细胞裂解液以最大速度在4℃下20分钟，以去除细胞碎片。删除1毫升的细胞裂解液到微量离心管。
从每个删除100微升蛋白裂解液，并放置在一个新的Eppendorf管。这将用作每个样本的输入。
根据制造商的方案使用Bradford测定法进行蛋白质浓度的定量
准备磁珠免疫沉淀。
1. 在0.1M NaH 2 PO 4中洗涤100μl珠子/IP三次（例如：如果要进行2次AUF1免疫沉淀和2次IgG免疫沉淀执行，您将需要200微升的珠子为AUF1 IP和200微升的IgG IPs珠子）。通过重悬浮进行洗涤磁珠，然后使用磁性将它们从溶液中分离微离心管架。
2. 重悬洗涤珠在500μl0.1 M NaH 2 PO 4和每IP添加30μg抗AUF1或IgG对照抗体（对于示例：如果您正在执行2个AUF1 IP，请将您的珠子重新悬挂在500 μl的0.1M NaH 2 PO 4 4并加入60μg的抗AUF1抗体）。
3. 用抗体在室温下孵育珠至少1小时，其中末端旋转。
4. 洗涤抗体偶联珠3次在缓冲液A中重悬珠子在缓冲液A中，并使用磁性微粒将其向下拉离心管架。留在缓冲液A的珠子，直到准备IP。
通过与20μl非抗体缀合的珠孵育，预清洁3mg蛋白质/IP。使用MCLB达到1 ml体积。在4℃下，在末端旋转下孵育30分钟。
同时，在NT2缓冲液中重悬抗体偶联的珠子。此时，您需要为各个IP分配珠子。例如，如果你准备做2 AUF1 IP，重悬在200微升NT2缓冲区的珠子，并将它们分开到2管的100微升每个。在室温下孵育30分钟。
免疫沉淀过夜：
1. 使用磁性从预先清除的蛋白裂解液中删除珠微量离心管架，保持蛋白裂解液并丢弃珠子。
2. 从NT2缓冲液中取出抗体偶联的珠子使用磁性微离心管架，保持珠子和丢弃NT2缓冲区。
3. 在预纯化的蛋白裂解液中重悬抗体偶联的珠子
4. 将管放在端到端旋转器上。在4℃孵育过夜。
在以下每种缓冲液中洗涤珠两次，方法是重悬细胞珠，然后使用磁性微量离心管试管架将其从溶液中分离。
1. 缓冲区A
2. 缓冲区B
3. 缓冲液C.
在补充有：
的100μlNT2缓冲液中在55℃孵育珠子30分钟
1. 0.1％SDS
2. 80 U RNAse OUT
3. 30μg蛋白酶K
通过加入1ml Trizol（包括在RiboPure RNA分离试剂盒中）到步骤12中所述的混合物中从IP和输入样品中提取RNA。在室温下孵育溶液5分钟。继续RiboPure RNA分离试剂盒中提供的RNA分离方案。洗脱在24μlH 2 O中的RNA
洗脱的RNA现在可用于产生qRT-PCR的cDNA
1. 使用六核苷酸引物合成cDNA 制造商的协议提供与Super Script II反向转录酶。
2. 用Power SYBR Green master进行PCR 按照制造商的方案混合。退火温度用于在材料和试剂中概述的引物截面为60℃。

代表数据

图1.代表性结果。小图（A）代表预期的结果。观察到的AUF1免疫沉淀的％输入高于IgG免疫沉淀观察到的百分比，表明AUF1抗体下降比非特异性IgG抗体更多的蛋白质（和RNA）。图（B）代表阴性结果，其中用AUF1抗体的免疫沉淀不比非特异性IgG抗体下拉更多的蛋白质（和RNA）。

笔记

请参见图2，了解简化的实验工作流程。

图2.RNA免疫沉淀（RIP）工作流程。来自每种处理的裂解物被分成三组：1）输入，其用于标准化感兴趣的RNA的整体表达水平，2）IgG免疫沉淀，其用于设定免疫沉淀的背景水平，和3）AUF1免疫沉淀，用于研究AUF1与感兴趣的RNA的结合的相对水平。

食谱

BJ文化媒体
DMEM
15％热灭活的胎牛血清 15％培养基199
1％青霉素/链霉素
MCLB（哺乳动物细胞裂解缓冲液）
50mM Tris（pH8.0） 5 mM EDTA
0.5％NP-40
100 mM NaCl
NT2缓冲区
50mM Tris（pH7.4）
150mM NaCl 1mM MgCl 2
缓冲区A
1x PBS
0.1％SDS
0.3％脱氧胆酸盐 0.3％NP-40
缓冲区B
5x PBS
0.1％SDS
0.5％脱氧胆酸盐 0.5％NP-40
缓冲区C
50mM Tris-HCl（pH7.4） 10mM MgCl 2/
0.5％NP-40

致谢

这项工作由NIH 5 R01 CA130919（SAS），NIH细胞生物化学和分子科学Predoctoral训练补助T32 GM007067（E A）和美国癌症协会研究学者奖（S.A.Stewart）支持。我们感谢Nicholas Davidson博士（华盛顿大学医学院）在生成本协议方面的技术支持。

参考文献

Alspach，E.，Fu，Y。和Stewart，S.A。（2013）。衰老和致肿瘤发生基质。 Crit Rev Oncog 18（6）：549-558。
Alspach，E.，Flanagan，KC，Luo，X.，Ruhland，MK，Huang，H.，Pazolli，E.，Donlin，MJ，Marsh，T.，Piwnica-Worms，D.，Monahan，，DV，McAllister，SS和Stewart，SA（2014）。 p38MAPK在基质介导的肿瘤发生中起着至关重要的作用。/em> 4（6）：716-729。