材料和试剂

本尼特烟草种子
携带具有与蛋白质纯化标记融合的靶基因的二元载体（例如pCambia1300，pBIN19）的土壤杆菌菌株
注意：在此协议中，我们使用3x FLAG标签作为示例。
Acetosyringone（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
MES（pH 5.6）（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：04693132001）
Nonidet P 40 substitute（Fluka，catalog number： 74385）
感应介质（见配方）
渗透解决方案（参见配方）
提取缓冲液（参见配方）
TBS（参见配方）
4x SDS（见配方）

设备

抗FLAG珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
3x FLAG肽（Sigma-Aldrich，目录号：F3290）
蛋白G琼脂糖珠（GE healthcare，目录号：17-0618-01）
用于培养土壤杆菌的试管，烧瓶和振动机。
离心机
1ml钝的注射器（BD，目录号：309659）

程序

在22℃（16小时一天/8小时夜晚）至4周龄时生长本塞姆氏烟草。将具有与3x FLAG融合的靶基因的二元载体的土壤杆菌菌株在28℃，200rpm下在具有适当抗生素选择的3ml LB中过夜生长过夜。使用灭菌的移液管吸头，将少量的农杆菌甘油原液接种到试管中。
制备诱导培养基并将土壤杆菌从LB培养基接种到诱导培养基中。（1/100稀释过夜培养或1/25稀释约8小时培养）。这可以在早上进行以准备晚上渗透，或在晚上准备第二天早上的渗透。
在28℃下以200rpm摇动孵育约8-12小时，使得细菌细胞处于对数生长期。最佳OD值应为0.6-0.8
在50ml Falcon管中以3,200×g离心10分钟，离心土壤杆菌培养物以沉淀细胞。
准备渗透溶液。
在〜5-10ml的浸润溶液中重悬土壤杆菌沉淀
测量细菌细胞的OD，并加入适量的浸润溶液以将土壤杆菌稀释至所需的OD（通常为0.1-0.3OD）。每片至少1ml浸润溶液。如果你想共表达两个或多个蛋白质，混合不同种类的农杆菌，每个都有所需的OD。建议进行初步表达实验以测试不同构建体的蛋白表达水平。您可以根据其在 N中的蛋白质表达水平调整每种土壤杆菌的OD值。 benthami 。例如，您可以使用较大的OD值代表表达较低蛋白质的土壤杆菌，同时使用较小的OD值表达表达丰富蛋白质的农杆菌。
加水。本氏烟植物在浸润前约30分钟使渗透更容易。
选择适当的叶子渗透。选择最健康的植物，避免被撕裂或损坏的叶子。理想的叶子是年轻的叶子，〜3-5厘米跨，每株使用2-3片叶子。一片叶是约0.1g组织，这足以测量蛋白质表达。对于免疫沉淀，10片叶通常就足够了。
使用1毫升钝的注射器将溶液注入叶子的下侧。在将其拉入注射器之前，将溶液在管中旋转，以便均匀地悬浮农杆菌。尽量在注射时尽可能温柔，以免损伤叶子。渗透区域可以很容易地看作是一个黑色的，水浸泡的区域。如果渗透区域在不太推力的情况下停止膨胀，则再次在叶的不同区域中渗入。只要渗透可以覆盖叶片，对渗透区域没有特定要求。尝试完成渗透使用每叶少于5个不同的渗透。有短视频显示农杆菌 N的渗透。本bent：： https://www.youtube.com/watch?v=GHc7PU_jG2M。浸润后，植物可以在与以前相同的条件下生长
收获 N。本生烟草在土壤杆菌感染后36-48小时没有主静脉。 1g组织通常就足够了。可能需要进行时间点实验以决定蛋白质在哪个时间点表达最高。
使用冷的研钵和杵将组织在液氮中研磨成细粉
添加提取缓冲液[参见配方，用2％PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮），10mM DTT，1×蛋白酶抑制剂（PI）和1mM PMSF]到研钵中（每克植物组织2ml提取缓冲液），将其置于4° C冰箱中，等待粉末开始解冻并通过研磨使混合物均匀
将所有液体转移到1.5管中，并在4℃以最高速度离心10分钟
将上清液转移到新管中，再离心一次。
将上清液转移到管中，加入20％NP40至终浓度为0.15％
向样品中加入20μl蛋白G琼脂糖珠，并在冷室中孵育30分钟以预清除样品（使用1ml提取缓冲液预平衡珠，在12,000rpm离心后弃去上清液缓冲液， xg 30秒）。
通过在12,000×g离心30秒来沉淀小珠，并将上清液转移到新管中。取60μl上清液作为输入样品，代表免疫沉淀前的样品
加入10μl抗FLAG珠到上清液。珠子也需要如步骤18所示平衡。在Eppendorf管旋转器上在4℃下孵育珠子3小时。
通过离心沉淀小珠，并取60ul上清液用于流通样品
用1ml提取缓冲液（含0.15％NP40）洗涤珠子3次。对于每个洗涤步骤，通过在4℃下以12,000xg离心1分钟来沉淀珠粒，弃去上清液并加入1ml提取缓冲液。
加入100μl稀释的3×FLAG肽（用1×蛋白酶抑制剂将含有1mM EDTA的TBS中的3×FLAG储备液稀释1/10）3×FLAG储备液在TBS中为2.5mg/ml，可在-20℃下储存多年）珠子并在冷室中在Eppendorf管旋转器上孵育1小时。
通过离心沉淀珠粒。将上清液转移到新管中。加入35μl4x SDS加载缓冲液到上清液。该级分是含有纯化的免疫沉淀蛋白的洗脱样品。加入60μl1XSDS加载缓冲液到含有珠子的管中。珠子样品可能含有不能从珠子洗脱的残留蛋白质
向输入和流通样品中加入适当体积的4x SDS上样缓冲液。将所有样品在95-100℃煮沸5-10分钟。并使用Western blot分析样品

代表数据

在图1中示出了代表性的实验结果。该图根据在参考文献中列出的Xu等人（2014）修改。

图1.bHLH84-HA与SNC1-FLAG共免疫沉淀。在Co-IP实验中使用两个样品，包括具有bHLH84和SNC1-FLAG的共表达的样品和仅表达bHLH84的样品用作阴性对照。

笔记

在免疫沉淀过程中总是推荐阴性对照样品。对于单个蛋白质的免疫沉淀，建议表达空载体作为阴性对照。对于两种或更多种蛋白质的共免疫沉淀，建议表达没有诱饵蛋白的空载体以及含有猎物蛋白的相关载体。基于实验设计，可以相应地包括更多的阴性对照。
只要蛋白质可以被下拉，免疫沉淀实验是高度可重现的，虽然IP效率可能在不同的试验中略有不同。

食谱

感应介质
注意：您还需要在以下媒体中添加适当的抗生素。

试剂	库存集中	灭菌	体积/100 ml	最终集中
K _{2 HPO ₄}	10.5 g/L	用水和高压釜将所有混合物混合	96.85 ml
KH ₂ PO ₄	4.5 g/L
（NH 4）_{2 4}	1.0 g/L
柠檬酸钠：2H 2 O·dm /	0.5 g/L
甘油	0.5％
葡萄糖	20％	过滤	1 ml	0.2％
MgSO 4 4 /	1 M	过滤	100微升	1 mM
Acetosyringone	100 mM	过滤	50微升	50微升
MES（pH 5.6）	0.5 M	过滤	2 ml	10 mM

浸润溶液

试剂	库存集中	灭菌	每20 ml的金额	最终集中
MS粉末		NA	0.088克	4.4 mg/L
MES	0.5 M	过滤	0.4 ml	10 mM
Acetosyringone	100 mM	过滤	30微升	150μM/

提取缓冲区
10％甘油 25mM Tris-HCl（PH7.5）
1mM EDTA
150mM NaCl
TBS
10mM Tris-HCl
150mM NaCl（PH7.4）
4x SDS
200mM Tris-HCl（PH 6.8）
8％SDS
40％甘油 0.04％溴酚蓝
400 mM DTT

致谢

我们感谢自然科学和工程研究委员会（NSERC）（加拿大）发现补助计划的财政支持。在N中的瞬时蛋白表达。本尼曼人改编自Van den Ackerveken等人（1996）。 IP协议修改自Moffett等人（2002）。

参考文献

Moffett，P.，Farnham，G.，Peart，J.and Baulcombe，D.C。（2002）。植物NBS-LRR蛋白结构域在疾病抗性相关细胞死亡中的相互作用。 21（17）：4511-4519。
Van den Ackerveken，G.，Marois，E.and Bonas，U.（1996）。在宿主植物细胞内发生细菌无毒性蛋白AvrBs3的识别。单元 87（7）：1307-1316。
Xu，F.，Kapos，P.，Cheng，Y.T.，Li，M.，Zhang，Y.and Li，X.（2014）。 NLR相关转录因子bHLH84及其旁系同源基因在植物免疫中的功能冗余。 > PLoS Pathog 10（8）：e1004312。