材料和试剂

Qiagen Type-it Microsatellite PCR试剂盒（QIAGEN，目录号：206243）
1×TE缓冲液（10mM Tris，用HCl，1mM EDTA调至pH8.0）
GelRed（Biotium，目录号：41003）
1kb DNA梯（GeneRuler 1kb DNA Ladder）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0313）
无核酸酶水溶液
纯分子生物学级乙醇（96-100％）
2 ml管
DNeasy 96 Plant Kit（QIAGEN，目录号：69181）
Hi-Di TM甲酰胺（Life Technologies，目录号：4311320）
GeneScan 500 LIZ尺寸标准（Life Technologies，目录号：4322682）
冰块
葡萄糖（BD Biosciences，目录号：215510）
蛋白pepton（BD Biosciences，目录号：212230）
琼脂（BD Biosciences，目录号：214883）
2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11330032）
实验室抹布（例如，KimWipes，Kimberly-Clark，目录号：TW31KWPBX）
4毫米钢球（例如，Spex Certiprep，目录号：12145950）
移液器提示
移液管（0.1-2μl），移液器吸头
处理板：96孔板（例如，MicroAmp光学96孔反应板）和96孔板（Septa）
0.22μm无菌聚醚砜注射器过滤器（Merck Millipore，目录号：P/N SLMP025SS）
藻类培养基（见配方）
藻类培养基准备用于培养微小绿藻和其他trebouxiophycean藻类菌株（参见配方）
维生素溶液（见配方）

设备

多通道移液器（0.1-10,10-100,100-1000μl），具有延长的提示
带有转子的微量离心机，用于2 ml管
96孔板离心机
Bio/Rad实验室，目录号：164-0305）。
孵育器（65℃）
冷冻室或冷藏室-20°C
PCR热循环仪
ABI3130/3130xl/3730/3730xl DNA分析仪（Applied Biosystems）
球磨机MM 400（Retsch ，目录号：20.745.0001）
冻干器（例如，FreeZone 4.5升Benchtop Freeze Dry System，Labconco，目录号：7750021）

软件

GeneMapper （Software v4.1，Applied Biosystems，目录号：4366925）

程序

样品制备（第1天）
1. 取最多10毫克新鲜组织样品（近似湿重）或5毫米藻类培养物的大小（Beck等人，1998）/地衣地衣在2ml管中（见图2）
2. 在每个管中添加2个钢球
3. 用软薄纸覆盖开口管。
4. 将样品在-20°C冷冻至少6小时
5. 将管子安装在冻干机中并冻干过夜
  
  图2.用于DNA提取的样品示例
样品研磨和DNA分离（第2天）
1. 关闭管。
2. 使用球磨机MM 400在30Hz下，在环境温度下，无缓冲液，冻干冻干样品30秒
3. 在进行DNA分离之前，将粉碎的样品旋转几秒钟
4. 对于DNA分离，遵循DNeasy 96 Plant Kit，Qiagen方案（Plant Handbook 10/2012，http://www.qiagen.com，第31-34页）。
  注意：
  1. 对于缓冲区AW1和AW2，在第一次使用之前，请添加适量的乙醇，按瓶上所示取得a 工作解决方案。
  2. 将AP1预热至65°C。
5. 使用缓冲液AE从DNeasy离心柱洗脱纯化的DNA两次（2×50μl）。
  注意：更小或更大的洗脱体积可以或多或少地使用浓缩产品。为了确保完全洗脱，40μl应该最小洗脱体积。
DNA检查
1. 用1X TAE缓冲液制备1％琼脂糖凝胶。加入0.5μlGelRed用于100 ml凝胶
2. 加载2μlDNA
3. 添加1 kb或100 bp梯形图作为参考
4. 运行凝胶电泳。
5. 在凝胶文件系统中检查DNA的质量和数量（图3）
图3.在1％w/v琼脂糖凝胶上运行的 Dictyochloropsis reticulata的优质基因组DNA的实施例

PCR反应和基因分型板（第3天）的制备
7x 底漆组合

首先制备100μM引物储液
根据表1和2混合所有引物，得到1ml引物混合物（对于10x 96-样品PCR板足够）。

表1.微卫星的引物序列和标记（Dal Grande等人，2009; Dal Grande等人，2009）。，2014）

Algal Loci	轨迹GenBank	引物序列（5'-3'）	标签

LPh1	FJ754261	F：GTCTCAGGTGACCACTTGATTG	VIC
		R：GCAATGGATATGATGCTTGTTC
LPh2	FJ754262	F：GACAGCTGTTCCAGTGCATC
		R：GCAGAGGAAGTGCATGACG	FAM
LPh3	FJ754263	F：TGCAGTAGGTGTCATATGTGT	NED
		R：GAAGGCGCATCTTGATATAC
LPh4	FJ754264	F：GTGGTGGTACAACATGCTCA	NED
		R：ACGACCACGTGGGATATCTA
LPh5	FJ754265	F：TGGTGTTAGTAAGAATCGGCATC	PET
		R：GTGTATGTCGGCCCCAATAA
LPh6	FJ754266	F：GAATCCTGCCTGCCTACAAG	FAM
		R：AGCAACCCATTTCAACCAAC
LPh7	FJ754267	F：TGTGACAGGTGAAACACCAA	VIC
		R：TATGGTCCCTCATGGCAAAT

表2. 7x底漆混合液制备

标准化引物储备液的浓度：100μM（100pmol /μl）

每个引物20μl（30μl为LPh7）
TE缓冲液700μl

总体积为1 ml

PCR反应混合物

解冻模板DNA，无RNA酶的水，引物混合物和2x Type-it Microsatellite PCR Master Mix，如果储存在-20°C。
在使用前将溶液完全混合。
按照表3准备反应混合物。
注意：反应混合物包含所需的所有组分除了模板DNA以外的多重PCR。准备一定体积的反应混合物 10％大于反应总数所需的体积
充分混合反应混合物并将适当体积分配到PCR管或板中。
注意：轻轻地混合上下反应混合物几次。在反应设置期间不必将样品保持在冰上。

表3.微卫星多重PCR的PCR组分（总体积=10μl）

PCR分量	多重1（10μl）
Multiplex PCR Master Mix ^a	5μl（1x）
底漆混合物	1μl（每种引物0.2μM，LPh7为0.3μM）
DNA模板	1μl（1-10 ng）
无RNase水	3μl

PCR程序
1. 步骤1：95℃5分钟（初始活化）
2. 步骤2：95℃30秒（变性）
3. 步骤3：62℃90秒（退火）
4. 步骤4：72℃60秒（延伸）
5. 步骤5：转到步骤F2，重复24次
6. 步骤6：60℃30分钟（最终延伸）
7. 将PCR产物储存在-20°C，直到进一步处理。
制备用于基因分型的平板（第4天）
1. 用无RNA酶的水稀释PCR产物1:10
2. 合并1 μl稀释的PCR产物与含有9μl变性的缓冲液混合试剂（Hi-Di TM甲酰胺）和0.5μlLIZ500大小标准。
3. 注意：对于一个96孔板准备105个样品的缓冲液。
4. 以1500 RCF短暂离心板（5秒）。
5. 准备样品表。
  注意：用无核酸酶的水填充任何空白样品孔。
6. 在ABI3730xl上分析。
分析（第5天）
使用GeneMapper软件将序列生成器生成的原始数据文件导入计算机。
GeneMapper中的基因分型
1. 从"文件"菜单中选择"创建新项目"。
2. 导入样品。
3. 创建标记面板和面元集。
  分析参数
4. 选择"微卫星默认值"作为表设置，"微卫星分析方法"作为分析方法
5. 设置7x底漆混合物的面板。
6. 将大小标准设置为LIZ500，并排除35和250 bp峰
7. 分析（见图4）。
  注意：如果一些样本不符合大小标准，请转到编辑大小标准和覆盖尺寸。如果这不解决问题，那里可能是与示例或运行分析有关的一些问题。
图4.示例性网叶螨的一个样品的7x多重微卫星电泳图的例子

代表数据

一个简单，有代表性的数据示例，指示期望的结果类型（表4）。

表4. 7x多重微卫星等位基因表格示例

示例	人口	LPh1	LPh2	LPh3	LPh4	LPh5	LPh6	LPh7
1	Pop1	262	157	108	191	143	121	170
2	Pop2	260	151	138	176	156	121	190
3	PopN	148	159	122	181	140	116	152

注意：数字表示每个微卫星等位基因碱基对的相对大小。

食谱

藻类培养基
用于制备藻类培养基的成分
1. 大量营养素（g/400 ml）
  NaCl 1 （42.7mM） CaCl 2 ^。 2H ₂ O 1 （17.0 mM） KNO ₃ 20 （495mM） MgSO 4 4 ^。 7H O 3 （30.4 mM）（NH 4）₂ .HPO ₄ 10 （189mM）
2. 微量营养素（g/500 ml）
  KOH 15 （535mM）
  EDTA： 25 （171mM） FeSO 4 ^。 7H _{2 2.49 （17.9mM） H ₃ BO ₃ 5.52 （179mM） ZnSO 4} ^。 ^。 4H _{2 0.72 （7.28mM） NaMoO ₄ 0.36 （3.50mM） CuSO 4 ^。 5H} 0.79 （6.33mM） Co（NO ₃）₂ ^。 6H ₂ O 0.25 （1.72mM）
用于培养微小绿藻和其他trebouxiophycean藻类菌株的藻培养基准备
1. 对于一升培养基，取10ml大量营养素和1ml 微量营养素，加入0.715g HEPES缓冲液（终浓度3mM）用蒸馏水填充至1000ml
2. 用HCl调节pH至5.5。
3. 可以加入20g琼脂
4. 高压灭菌并加入1毫升无菌维生素溶液冷却后至少60℃。通过过滤使用a消毒维生素溶液 0.22μm无菌聚醚砜注射器过滤器。
  ote：要接收更多的藻类细胞，可以添加1.5％葡萄糖和1％蛋白胨。
维生素溶液
硫胺素 0.1 g/100 ml （3.77mM）生物素 2.5 mg/100 ml （0.10mM）维生素B12 1.5 mg/100 ml （9.50μM）

致谢

这项研究由瑞士国家科学基金会（项目31003A-105830和31003A-127346到CS）的Hesse高等教育，研究和艺术部的"LOEWE，Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-oekonomischer Exzellenz"和德国国家科学基金会（项目BE3825/4-1至AB）。

参考文献

Beck，A.，Friedl，T。和Rambold，G。（1998）。定义的地衣群落中光生物选择的选择性：来自文化的推断和新分子研究。新植物学家 139（4）：709-720。
Dal Grande，F.，Beck，A.，Cornejo，C.，Singh，G.，Cheenacharoen，S.，Nelsen，M.P.and Scheidegger，C。绿色藻类属的分子系统发育和共生选择性 sl （Trebouxiophyceae）：一种多形性和广泛的群体形成photobiont介导的地衣在地衣家庭Lobariaceae。新植物 202（2）：455-470。
Dal Grande，F.，Widmer，I.，Beck，A。和Scheidegger，C。（2010）。网球藻属的微卫星标记（Trebouxiophyceae），地衣的共生藻类（L.）。保护遗传学 11（3）：1147-1149。